يصف لنا طريقة بسيطة للقياس الكمي السريع من وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوية في البكتيريا المتنوعة، بما في ذلك الأنواع المتفطرات إيجابية وسلبية الغرام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المعايرة وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوية في البكتيريا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوي (سليلة) بوليمر بيولوجية الموجودة في الخلايا من جميع مجالات الحياة، ومطلوب من أجل الفوعة وإجهاد استجابة في العديد من البكتيريا. وهناك مجموعة متنوعة من أساليب لتحديد سليلة في المواد البيولوجية، والعديد منها كثيفة العمالة أو غير حساسة، يحد من فائدتها. نقدم هنا طريقة مبسطة للقياس الكمي سليلة في البكتيريا، تستخدم استخراج عمود غشاء والسليكا الأمثل للمعالجة السريعة لعينات متعددة والهضم من سليلة مع اكسوبوليفوسفاتاسي الخاصة سليلة سكبكس، والكشف عن فوسفات الحرة الناتجة مع مقايسة اللونية حساسة على أساس حمض الأسكوربيك. هذا الإجراء مباشرة، وغير مكلفة، ويسمح سليلة موثوقية القياس الكمي في مختلف أنواع الجراثيم. نقدم الكمي سليلة الممثل من بكتيريا سلبية الغرام (الإشريكيّة القولونية) وبكتيريا حمض الالكتيك إيجابية (ريوتيري اكتوباكيللوس)، والأنواع المتفطرات (بكتريا سميجماتيس). نحن تشمل أيضا بروتوكول بسيط لتنقية النيكل تقارب كميات مغ من سكبكس، التي ليست متاحة تجارياً حاليا.
المقدمة
وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوي (سليلة) هو بيوبوليمير خطية وحدات الفوسفات المرتبطة فوسفوانهيدريدي موجودة في جميع مجالات الحياة1،،من23. في البكتيريا المتنوعة، سليلة ضروري لاستجابة الإجهاد وحركية وتشكيل بيوفيلم، مراقبة دورة الخلية، ومقاومة المضادات الحيوية والفوعه4،5،،من67،8 9، ،،من1011. ولذلك قد دراسات الأيض س....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-تنقية الخميرة اكسوبوليفوسفاتاسي (سكبكس)
- تحويل سلالة overexpression بروتين كولاي BL21(DE3)31 مع بلازميد pScPPX26 انهانسر32 أو33من التحول الكيميائي.
- تطعيم 1 لتر مرق ليسوجيني (رطل) التي تحتوي على 100 ميكروغرام مل-1 الأمبيسلّين في قارورة أونبافليد ل 2 مع مستعمرة واحدة من BL21(DE3) التي تحتوي على pScPPX2، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون المصافحة، لامتصاص 600 نيوتن متر (600) من حوالي 0.3، كما يقاس جهاز المطياف الضوئي.
- بدء ثقافة الهز (180 لفة في الدقيقة) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، خلال الوق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الخطوات الرئيسية للبروتوكول هي تخطيطي في شكل مبسط في الشكل 1.
للتدليل على استخدام هذا البروتوكول مع بكتيريا سلبية الغرام، البرية من نوع كولاي MG165539 قد ازدادت إلى سجل منتصف المرحلة المتوسطة الغنية رطل في 37 درجة مئوية مع الهز (200 لفة في الدقيقة)، ثم تشطف والمحتضنة ح 2 إضافية في مورفولينوبروبانيسولفونيت مخزنة (والمماسح) الحد الأدنى المتوسط40.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
البروتوكول هو موضح هنا يبسط ويسرع الكمي لمستويات سليلة في البكتيريا المتنوعة، مع مجموعة نموذجية من عينات 24 أخذ حوالي 1.5 ح الكامل عملية. هذا يسمح بالفحص السريع للعينات وتحليل لمكتبات متحولة، ويبسط الحركية تجارب قياس تراكم سليلة على مر الزمن. لقد أظهرنا أن البروتوكول يعمل بشكل فعال على ممثلي ثلاث يعج مختلفة: بروتيوباكتيريا، فيرميكوتيس، أكتينوباكتيريا، وسيئة السمعة لهذه المرونة، والصعب جدران الخلية49.
كشف سليلة بالهضم مع سكبكس هو أكثر تحديداً وأكثر حساسية من الأسفار الكش.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وأيد هذا المشروع جامعة ألاباما في "برمنغهام قسم الأحياء المجهرية" أموال بدء التشغيل والمعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM124590 (MJG)، والمعاهد الوطنية للصحة منحة R01AI121364 (مهاجم).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الإشريكية القولونية < / em>BL21 (DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| البلازميد pScPPX2 | Addgene | 112877 متاح للمؤسسات الأكاديمية وغيرها من المؤسسات غير الربحية | |
| مرق LB | مرق فيشر Scientific | BP1427-2 | E. القولوني< > متوسط النمو |
| الأمبيسلين | فيشر BP176025 | ||
| العلميالأيزوبروبيل & بيتا ;-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) | التكنولوجيا الحيوية الذهبية | I2481C | |
| HEPES العازلة | الذهب التكنولوجيا الحيوية | H-400-1 | |
| هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) | فيشر P250500 العلمي | لضبط درجة الحموضة في محاليل HEPES المخزنة | |
| كلوريد الصوديوم (NaCl) | فيشر Scientific | S27110 | |
| إيميدازول | فيشر O3196500 | ||
| ليزوزيم | فيشر AAJ6070106 | ||
| كلوريد المغنيسيوم العلمي (MgCl2< / sub>) فيشر | Scientific | BP214-500 | |
| بيرس يونيفرسال نوكليز | فيشر Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) هو بديل مقبول |
| موديل 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | طرق تحلل الخلايا الأخرى (مثل الصحافة الفرنسية) يمكن أن تكون فعالة |
| أيضا 5 مل HiTrap مخلب HP عمود | GE Life | Sciences 17040901 | يمكن استبدال أي عمود كروماتوغرافيا تقارب النيكل أو راتنج |
| سداسي هيدرات كبريتات | فيشر Scientific | AC415611000 | لشحن عمود HiTrap |
| 0.8 & micro ؛ م حجم المسام مرشحات حقنة أسيتات السليلوز | فيشر Scientific | 09-302-168 | |
| كاشف برادفورد | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum & nbsp ؛ Spectra / Por 4 RC أنابيب غشاء غسيل الكلى 12,000 إلى 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | أغشية غسيل الكلى الأخرى مع MWCO < 30,000 Da يجب أن تعمل أيضا |
| حمض الهيدروكلوريك (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | لضبط درجة الحموضة في محاليل تريس المخزنة |
| كلوريد البوتاسيوم (KCl) | فيشر P217500 | ||
| الجلسرين | فيشر Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS خليط متوسط | Teknova | M2101 | E. قولونية< / em> نمو |
| متوسط الجلوكوز | فيشر Scientific | D161 | |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2< / sub>PO4< / sub>) | فيشر Scientific | BP362-500 | |
| فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة (K2< / sub>HPO4< / sub>) | فيشر Scientific | BP363-500 | |
| مستخلص الخميرة المجففة | فيشر Scientific | DF0886-17-0 | |
| التربتون | فيشر Scientific | BP1421-500 | |
| كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات | فيشر Scientific | M63-50 | |
| كبريتات المنغنيز أحادي الهيدرات | فيشر Scientific | M113-500 | |
| جوانيدين إيزوثيوسيانات | فيشر Scientific | BP221-250 | |
| ألبومين مصل الأبقار (خالي من البروتياز) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| ألواح مسطحة ذات 96 بئرا | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | ستعمل أي لوحة واضحة مكونة من 96 بئرا |
| Tecan M1000 Infinite Plate | Reader Tecan، Inc. | لا ينطبق | أي قارئ لوحة قادر على قياس الامتصاص عند 595 و 882 نانومتر سيعمل |
| الإيثانول | فيشر ساينتفيك | 04-355-451 | |
| أعمدة تدور غشاء السيليكا | عصر علوم | الحياة 1910-050/250 | |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) | فيشر ساينتفيك | BP120500 | |
| 1.5 مل أنابيب الطرد الدقيق | فيشر NC9580154 | ||
| أسيتات الأمونيوم | فيشر Scientific | A637-500 | |
| طرطرات البوتاسيوم الأنتيمون | فيشر ساينتفيك | AAA1088922 | |
| 4 N حمض الكبريتيك (H2< / sub>SO4) فيشر | Scientific | SA818-500 | |
| الأمونيوم سباعي الموليبدات | فيشر AAA1376630 | ||
| الحامض الأسكوربيك | فيشر | AC401471000 |
المراجع
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
