عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs)، مع قدرة التمايز والمساهمة في تجديد الأنسجة الوسيطة مثل العظام والغضاريف والعضلات، والرباط، ووتر والدهنية، وقد تم عزل من تقريبا جميع الأنسجة في الجسم الكبار^{1 , 2}-غير توفير التوازن الأنسجة بإنتاج خلايا المقيم في حالة التهاب مزمن أو إصابة، أنها تنتج السيتوكينات الحيوية وعوامل النمو تنسق الأوعية والجهاز المناعي وأنسجة يعيد البناء³. تفاعل MSCs مع أنسجة السرطان ليست مفهومة جيدا، ولكن الأدلة المتراكمة أن MSCs قد تشجع على بدء وتطور، وورم خبيث الورم⁴.

قدرة صاروخ موجه من MSCs إلى منطقة إصابة أو التهاب مزمن يجعل منها مرشح قيماً للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية. ومع ذلك، أنسجة السرطان، "ابدأ شفاء الجروح"، أيضا الإفراج عن السيتوكينات الالتهابية وجزيئات برو-الأوعية، وعوامل النمو الحيوي، الذي جذب MSCs إلى منطقة كانسيروجينوس⁵. بينما هناك قلة ذكرت التقارير التي تبين الآثار المثبطة ل MSCs على نمو السرطان^6،7، تطور السرطان وورم خبيث تعزيز الآثار قد تم على نطاق واسع⁸. MSCs مباشرة أو غير مباشرة تؤثر التسرطن بطرق مختلفة بما في ذلك قمع الخلايا المناعية، إفراز عوامل النمو/السيتوكينات التي تدعم انتشار خلايا السرطان، والهجرة، وتعزيز نشاط الأوعية، وتنظم ^9،الانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT)¹⁰. ورم البيئة يتألف من عدة أنواع الخلايا المرتبطة بالسرطان الخلايا الليفية (اجواءه) و/أو ميوفيبروبلاستس وخلايا بطانية، adipocytes والخلايا المناعية¹¹. من هؤلاء، هي اجواءه نوع الخلية الأكثر وفرة في مجال الأورام التي تفرز مختلف المستقطبات تعزيز النمو وورم خبيث سرطان⁸. فقد ثبت أن MSCs المشتقة من نخاع العظم يمكن أن تفرق في اجواءه في ستروما ورم¹².

الخلايا الجذعية البالغة لب الأسنان (دبسكس)، تميزت ك MSCs المستمدة من أنسجة الأسنان الأولى جرونثوس et al. ¹³ في عام 2000 ثم على نطاق واسع التحقيق قبل الآخرين^14،15، التعبير عن علامات بلوريبوتينسي مثل Oct4، Sox2، و نانج¹⁶ ويمكن التفريق في خلية مختلفة ليناجيس¹⁷. تحليل تعبير الجينات والبروتين أثبت أن دبسكس تنتج مستويات مماثلة من عوامل النمو/السيتوكينات مع MSCs الأخرى مثل عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF)، أنجيوجينين، وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية 2 (FGF2)، 4-انترلوكين (إيل-4)، إيل-6، وايل-10، والخلايا الجذعية عامل (SCF)، فضلا عن fms مثل تيروزين كيناز-3 يجند (أنطوني-3 لتر) التي قد تعزز الأوعية وتعدل الخلايا المناعية، ودعم سرطان الخلية الانتشار والهجرة^18،19،20 . في حين كانت تفاعلات MSCs مع البيئة سرطان موثقة توثيقاً جيدا في الأدب، لم يجر تقييم العلاقة بين دبسكس والخلايا السرطانية بعد. في هذه الدراسة، قمنا بإنشاء استراتيجيات علاجية متوسطة الثقافة المشتركة وشرط لخط خلية سرطان البروستاتا المنتشر جداً والكمبيوتر-3 دبسكس أن يقترح الإجراء المحتمل لآلية MSCs طب الأسنان في تطور السرطان وورم خبيث.

تم الحصول على الموافقة الخطية للمرضى بعد الموافقة من "لجنة الأخلاقيات المؤسسية".

1-دبسك العزلة والثقافة

1. نقل الحكمة الأسنان التي تم الحصول عليها من الشباب الذين تتراوح أعمارهم بين 17 و 20 إلى 15 مل الأنابيب التي تحتوي على تعديل النسر المتوسطة (دميم كامل دولبيكو) [انخفاض الجلوكوز دميم وسائط الإعلام، وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين 1%/ستربتوميسين/ الحل الامفوتريسين (PSA)]، ضمن ح 8 بعد الاستئصال. الحفاظ على نسيج المواد الباردة (4 درجة مئوية) أثناء نقل لتجنب احتمال موت الخلية.
2. إزالة نسيج اللب بالملقط استخراج العقيمة من مركز الأسنان بعناية ووضع أنسجة اللب في المتوسط دميم كاملة الباردة في 10 سم أطباق زرع الأنسجة وتخطر لهم إلى قطع صغيرة (2-3 مم) بدون مشرط.
   ملاحظة: جميع الإجراءات التجريبية ينبغي أن يتم تحت ظروف معقمة في هود الاندفاق الصفحي. وقد تم هذا الأسلوب غير الانزيمية المستخدمة سابقا^21،،من²²²³.
3. تعامل لوحات 6-جيدا أنسجة اللب الصغيرة مكان داخل زراعة الأنسجة وإضافة 200 ميليلتر وسائط دميم كاملة لتغطية كل قطع أنسجة اللب الصغيرة.
4. احتضان الآبار زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية في جو هواء هوميديفيد (80% رطوبة) مع 5% CO₂ لح 2 لتوفير مرفق الأنسجة.
   ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن تطول إلى 3-4 ح بمراقبة التبخر من وسائل الإعلام.
5. إضافة المجلد المناسب (2-2.5 مل) لإكمال دميم المتوسطة إلى الآبار واحتضان في 37 درجة مئوية في جو هواء هوميديفيد مع 5% CO₂ للخلايا لتنتشر من الأنسجة.
   ملاحظة: الخلايا تصبح مرئية بعد حوالي 4 أيام والتوصل إلى كونفلوينسي بعد 8-9 أيام.
6. عندما تصل الخلايا إلى 80% كونفلوينسي، قم بإزالة الوسائط من لوحات 6-جيدا وتغسل مع 2 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS)، وإضافة 2 مل التربسين. احتضانها ل 2 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية مع الأجواء الجوية هوميديفيد و شركاه 5%₂. قم بإضافة 2 مل من إكمال المتوسطة دميم متبوعاً بحضانة 2 دقيقة تمنع التربسين. الطرد المركزي خلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا.
7. مرور الخلايا في قوارير في كامل وسائل الإعلام دميم ومخزن لتجارب أخرى. إضافة 15 مل كاملة دميم وسائط قوارير T-75 ونقل الخلايا من بئرين للوحة 6-جيدا لأحد T-75 قوارير واحتضان في 37 درجة مئوية مع الهواء هوميديفيد الغلاف الجوي و شركة 5%₂.

2-وصف دبسكس

1. إجراء التحليلات المورفولوجية.
   1. خلايا البذور (الخطوة 1، 6) في زراعة الأنسجة المغلفة قوارير (أو لوحات 6-جيدا) في المتوسط دميم كاملة للممرات 8 على الأقل لمراقبة مورفولوجيا الخلايا.
   2. الخلايا عن طريق مجهر ضوء تصور وتحديد مورفولوجيا تنتجها الخلايا الليفية مثل الخلية. الخلايا يجب أن نعلق على أطباق الثقافة ومورفولوجيا الخلية مثل المغزل.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، الخلايا يمكن أن تكون مثقف كخلايا مفردة لمدة تصل إلى 14 يوما في بئر-لوحات لمراقبة مستعمرة تشكيل القدرات التي سمة من سمات محددة من الخلايا الليفية و MSCs.
2. إجراء تحليلات ماركر السطحية.
   1. تريبسينيزي الخلايا من الخطوة 1، 7. قم بإزالة الوسائط من قارورة زراعة الأنسجة T-75 وتغسل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل التربسين. احتضانها ل 2 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية مع الأجواء الجوية هوميديفيد و شركاه 5%₂. قم بإضافة 2 مل من إكمال المتوسطة دميم متبوعاً بحضانة 2 دقيقة تمنع التربسين. الطرد المركزي خلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا.
   2. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في أنابيب 1.5 مل وغسلها ثم مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 3 مرات لإزالة بارافورمالدهيد.
   3. احتضان خلايا ثابتة مع الأجسام المضادة ضد CD29، CD34، CD14، CD45، CD90، CD105، CD166، و CD73 عن ح 1 في 4 درجات مئوية في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: يتم تركيز الأجسام المضادة المستخدمة 0.5 ميكروغرام/مل. CD34 و CD14 CD45 تستخدم كعلامات سلبية، في حين CD29، CD90، CD105، CD166، CD73، وتستخدم كعلامات إيجابية الخلايا السطحية ل MSCs.
   4. يغسل خلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني واستخدام كل منها الأجسام المضادة الثانوية مثل fluorescein isothiocyanate (فيتك)، فيكوريثرين (PE)، و ما إلى ذلك لوضع العلامات. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1: 500 في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
   5. الاحتفاظ بعينات في الظلام للتدفق الخلوي التحليل والكشف عن تلطيخ الموجبة والسالبة بالتدفق الخلوي.
      ملاحظة: استخدام خلايا المراقبة أونستينيد لترتيب مبعثر أمامية وجانبية. ترتيب النابضة للايجاب الملون السكان باستثناء الخلايا الميتة والحطام، والسكان غير الملون. استخدام 100 ميكرومتر فوهة مع الضغط غمد 45 رطل/بوصة مربعة وجمع الأحداث 10,000 لتحديد دبسكس الإيجابية عن طريق ترتيب القنوات.
3. تنفيذ التفريق بين دبسكس.
   1. البذور 1 × 10⁴ خلايا على لوحات 24-جيدا في إكمال الإعلام دميم واحتضانها ل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو هواء هوميديفيد مع شركة 5%₂.
   2. وضع التمييز بين استخدام وسائل الإعلام تتنافس المتوسطة دميم كقاعدة الوسائط. تعد وسائل الإعلام أوستيوجينيك بخلط 100 الديكساميتازون شمال البحر الأبيض المتوسط، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، وحمض الأسكوربيك 0.2 مم. تعد وسائل الإعلام تشوندروجينيك بخلط 1 × الأنسولين-ترانسفيرين-السيلنيوم (ITS-ز) 100 نانومتر الديكساميتازون، 100 نانوغرام/مليلتر تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، وحمض الأسكوربيك ميكروغرام/مل 14 والبومين المصل البقري 1 ملغ/مل (BSA). تعد وسائل الإعلام أديبوجينيك بخلط 100 نانومتر الديكساميتازون 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، 0.5 مم 3-إيسوبوتيل-1-زانتين (إيبمكس) و 60 ميكرومتر الاندوميتاسين.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ الوسائط التمايز في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد على الأقل.
   3. تغيير وسائط النمو osteo-أو شندرو-أو وسائط التمايز أديبو الجينية وتحديث وسائل الإعلام مرتين في أسبوع لمدة أسبوعين.
   4. تأكيد التمايز كوسي فون والسيان تلطيخ الأزرق ونشاط إنزيم (النشاط الفوسفاتيز القلوية)، إيمونوسيتوتشيميستري، والتحاليل بوليميريز الكمية سلسلة من ردود الفعل (قبكر) وفقا للبروتوكولات المذكورة سابقا²¹.
      1. أداء فون كوسي وستاينينجس السيان الأزرق في الخلايا التي يتم إصلاحها مع بارافورمالدهيد 4% في درجة حرارة الغرفة للغسيل 10 دقيقة الخلايا الثابتة مع برنامج تلفزيوني ووصمة عار لهم مع عدة فونكوسا وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لمراقبة الودائع الكالسيوم .
      2. إعداد السيان الأزرق تلطيخ الحل بتذويب ز 1.00 من الصبغة السيان الأزرق في 100 مل حمض الخليك 3% (v/v) لتلطيخ كذلك. تغسل الخلايا الثابتة مع برنامج تلفزيوني ووصمة عار الخلايا لمدة 30 دقيقة مع الحل السيان الأزرق. تصور العينات ملطخة مجهر خفيفة.

3-إعداد حالة متوسطة (سم)

1. استبدال وسائط الإعلام خلايا في الخطوة 1، 7 ح 24 دميم كاملة جديدة قبل جمع سم.
   ملاحظة: ينصح مرور 2-4.
2. جمع شرط المتوسطة (سم) من دبسكس مثقف عندما تصل الخلايا إلى 80% كونفلوينسي. الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تم جمعها في 300 غرام x لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الأنسجة النفايات المادية وخلية.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام 0.2 ميكرون حقنه مرشحات لإزالة الحطام من المتوسطة شرط.
3. جمع المادة طافية وتخزينها في-20 درجة مئوية لإجراء مزيد من التجارب.
   ملاحظة: الاحتفاظ المادة طافية في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

4-معاملة الخلايا السرطانية مع سم

1. إجراء تحليلات بقاء الخلية.
   1. البذور PC-3 خلايا (خلايا سرطان البروستاتا البشرية) على لوحات 96-جيدا في كثافة خلية³ 5 × 10 خلايا/بئر في إكمال دميم واحتضان في دائرة هوميديفيد في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ ل 24 ساعة.
   2. علاج الخلايا التي تحتوي على 10، 20، 30 و 40 و 50 في المائة من سم (v/v) مختلطة مع دميم كاملة ح 24.
   3. قياس جدوى الخلية باستخدام 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (MTS)-الاعتداء كما هو موضح سابقا²⁴.
2. أداء محطة ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز dUTP نك نهاية الوسم تحليلات (TUNEL).
   1. بذور PC-3 الخلايا على ثقافة الخلية جيدا 6 لوحات في كثافة خلية 2 × 10⁵ خلايا/حسنا واحتضانها في دائرة هوميديفيد في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ بين عشية وضحاها.
   2. مزيج % 20 سم (v/v) مع إكمال المتوسطة دميم وتطبيقها على الخلايا ح 24.
   3. تريبسينيزي الخلايا وتعليق في 50 ميكروليتر TUNEL رد فعل خليط (وسم الحل + حل الإنزيم، زودت عدة) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في جو₂ هوميديفيد و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون.
      ملاحظة: تريبسينيزيشن، قم بإزالة الوسائط من لوحات ثقافة الخلية 6-جيدا وتغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 500 ميليلتر من التربسين. احتضانها ل 2 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية مع الأجواء الجوية هوميديفيد و شركاه 5%₂. أضف 1 مل من إكمال المتوسطة دميم متبوعاً بحضانة 2 دقيقة تمنع التربسين. الطرد المركزي خلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا.
   4. شطف مع برنامج تلفزيوني وتحليل الخلايا في برنامج تلفزيوني باستخدام التدفق الخلوي.
3. إجراء تحليلات qPCR.
   1. بذور الخلايا PC-3 إلى 6-جيدا خلية ثقافة لوحات في كثافة خلية 2 × 10⁵ خلايا/جيدا واحتضان في حاضنة هوميديفيد في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ بين عشية وضحاها.
   2. مزيج % 20 سم (v/v) مع إكمال المتوسطة دميم وتطبيقها على الخلايا ح 24.
   3. تريبسينيزي الخلايا وجمع بيليه خلية للتوليف والعزلة وكدنا الجيش الملكي النيبالي.
      ملاحظة: قم بإزالة الوسائط من لوحات ثقافة الخلية 6-جيدا وتغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 500 ميليلتر من التربسين. احتضان 2 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية مع الأجواء الجوية هوميديفيد و شركاه 5%₂. أضف 1 مل من إكمال المتوسطة دميم متبوعاً بحضانة 2 دقيقة تمنع التربسين. الطرد المركزي خلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا.
   4. القيام بتجارب qPCR وفقا للبروتوكول هو موضح سابقا²⁵.
4. تؤدي الهجرة الخلية من الخلايا السرطانية.
   1. البذور 1 × 10⁵ PC-3 الخلايا على لوحات 12-جيدا، واحتضان في حاضنة هوميديفيد بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
   2. الصفر في الخلايا مع تلميح عقيمة 200 ميكروليتر وتغيير المتوسطة فورا مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على تركيزات مختلفة من سم [مثلاً، 10، 20، 30 و 40 و 50% من سم (v/v) مختلطة مع دميم كاملة].
   3. الخدوش تحت مجهر مقلوب مراقبة والتقاط صور في فترات زمنية مختلفة (0 و 24 ساعة).
   4. قياس إغلاق الصفر باستخدام البرمجيات "ي الصورة" باستخدام الصيغة:
      
      ملاحظة: فتح الصورة الصفر مع البرمجيات "ي الصورة". رسم خط بنفس حجم شريط نطاق موجود بالفعل في الصورة. انقر فوق تحليل وتعيين المقياس ومراعاة المسافة بالبكسل تكبير الخط مرسومة. كتابة حجم شريط مقياس للجزء المسافة المعروفة وترتيب الوحدة (بكسل، سم، إلخ)، وانقر فوق موافق. الانتقال إلى المقطع تحليل مرة أخرى وانقر على القياسات. وهذا سيعطي أولاً حجم شريط مقياس كوحدة مختارة. انقر فوق حافة واحدة من الصفر واسحب حتى الوصول إلى الجانب الآخر من نقطة الصفر. قم بتدوين القيمة لكل نقطة الوقت (ح 0 وح 24). قم بتوصيل هذه القيم في الصيغة المذكورة أعلاه وحساب إغلاق الصفر.

5-خلية الهجرة عن طريق الاتصال غير المباشر للخلايا السرطانية ودبسكس

1. البذور 3 × 10⁴ دبسكس على إدراج لوحة 24-جيدا مع 0.4 ميكرومتر المسامية واحتضان في حاضنة هوميديفيد بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
2. لوحات في كثافة خلية من 5 × 10⁴ البذور PC-3 الخلايا على 24-جيدا واحتضان في حاضنة هوميديفيد بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
3. الصفر PC-3 الخلايا مع تلميح عقيمة 200 ميكروليتر وتغيير المتوسطة مع المتوسط الطازجة ومكان إدراج تحمل دبسكس على الكمبيوتر-3 خلايا.
4. الخلايا تحت مجهر مقلوب مراقبة والتقاط صور في فترات زمنية مختلفة (ح 0 و 24) لتحليل الهجرة الخلية.

6-اشترك في الثقافة المقايسة والتدفق الخلوي التحليل

1. قم بتسمية الكمبيوتر-3 الخلايا ودبسكس باستخدام PKH67 (الأخضر) والأصباغ رابط خلية الفلورسنت (أحمر) PKH26، على التوالي²⁶.
2. تريبسينيزي الخلايا PC-3، ودبسكس، على التوالي. قم بإزالة الوسائط من قارورة زراعة الأنسجة T-75 وتغسل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل التربسين. احتضانها ل 2 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية مع الأجواء الجوية هوميديفيد و شركاه 5%₂. إضافة 2 مل من إكمال المتوسطة دميم متبوعاً بحضانة 2 دقيقة تمنع التربسين.
3. الطرد المركزي خلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية ريسوسبيند الكريات الخلية في صبغ الحل أعد مخفف-ج المخزن المؤقت بالطقم (انظر الجدول للمواد).
4. احتضان خلايا في الحل صبغ لمدة 10 دقائق وإنهاء رد فعل المصبوغة بإضافة 100 ميليلتر من FBS. الطرد المركزي خلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية وغسل الخلايا مع متوسط النمو الكامل قبل استزراع المشترك.
5. لوحة تسمية الخلايا (5 × 10⁴/جيد) على لوحات 6-جيدا في نسبة 1:1 (دبسكس: PC3). الحفاظ على الخلايا المستزرعة شارك في دميم كاملة.
6. جمع الخلايا بعد 24 ساعة أو 48 ساعة من فترات حضانة بالطرد المركزي خلايا في ز 300 x لمدة 5 دقائق والغسيل مع برنامج تلفزيوني.
7. ريسوسبيند الخلايا في 300 ميليلتر من خلية تنشيط fluorescence الفرز المخزن المؤقت (نظام مراقبة الأصول الميدانية) في 5 مل جولة أسفل التدفق الخلوي أنابيب. دوامة لتفريق المجاميع خلية الحق قبل تحليل العينة.
8. استخدام فوهة 100 ميكرومتر مع الضغط غمد 45 رطل/بوصة مربعة.
   ملاحظة: قد يخفض معدل تدفق عالية للغاية حساسية الكشف عن الأسفار.
9. استخدام التحكم أونستينيد الخلايا والخلايا الملونة واحد لضبط مناسب للأمام والجانب مبعثر الجهد الليزر لأنواع الخلايا وتعويض كما ذكرنا سابقا²⁷.
   ملاحظة: استخدم النابضة للخلايا الحية لاستبعاد الحطام الخلية أو الخلايا الميتة، أو المجاميع.
10. جمع الأحداث 10,000 (100,000 الأفضل) لتحديد نسبة إيجابية دبسكس الخضراء والحمراء PC-3 الخلايا عن طريق ترتيب قنوات فلوريدا-2 (أحمر) وفلوريدا-1 (أخضر).

ويصور الشكل 1 ماجستير الخصائص العامة دبسكس تحت ظروف الثقافة. دبسكس بذل مورفولوجيا تنتجها الخلايا الليفية مثل الخلية بعد الطلاء (الشكل 1B). ماجستير المستضدات السطحية (CD29، CD73، CD90، CD105، و CD166) شديدة يعبر عنها بينما علامات المكونة للدم (CD34 و CD45 و CD14) هي سلبية (الشكل 1). المتعلقة بالتغييرات على المستوى الجزيئي والمورفولوجية osteo-، شندرو-، والتمايز أديبو الجينية لوحظت في الثقافة دبسكس متبوعاً بتمايز كوكتيل التطبيق (الشكل 1).

لتحديد نشاط جزيئات يفرزها من دبسكس على انتشار خلايا سرطان البروستاتا والهجرة، طبقنا سم التي يتم جمعها من استزراع الخلايا الجذعية طب الأسنان وتحليل انتشار سرطان الخلية وسلوك المهاجرة. واختير علاج سم (20% v/v) استناداً إلى التحليلات صلاحية خلية النظام التجاري المتعدد الأطراف. PC-3 الخلايا تعامل مع الخلايا الجذعية سم تعرضوا للتحليلات TUNEL المقايسة و qPCR لتحديد الخلية لائحة الموت وأبوبتوتيك تحت المراقبة والظروف التجريبية. خلصنا إلى أن العلاج سم زيادة صلاحية الخلايا والحد من موت الخلايا في ثقافة الخلية PC-3. وأجرى السابقين فيفو مقايسة الهجرة الخلية (مقايسة الصفر) لتقييم ما إذا كان يؤثر "سم دبسكس" PC-3 سرطان الخلية الهجرة. المعاملة مع التركيزات من 10% و 20% سم (v/v) زاد إغلاق الصفر إلى حد كبير بالمقارنة مع مجموعة المراقبة في ح 24 (الشكل 2). وبالمثل، فعل 20% سم (v/v) معاملة upregulation من المصفوفة خارج الخلية البروتين الجيني تعبيرات مثل الكولاجين أنا فيبرونيكتين ولامينين، التي تلعب أدواراً هامة في الهجرة الخلية.

استخدمنا تقنيات ثقافة مختلفة اثنين إلى وضع الثقافات المشاركة المباشرة وغير المباشرة PC-3 الخلايا ودبسكس تحت ظروف السابقين فيفو . تم اختيار نظام ترانس-جيدا لخلق بيئة تفاعل غير مباشر للخلايا السرطانية PC-3. كانت تبذر PC-3 الخلايا على الجزء السفلي من اللوحة جيدا وإدراج تحمل دبسكس وضعت في الجزء العلوي. نظراً لأننا تهدف إلى توليد تفاعل في المباشر، والأغشية ترانس-جيدا مع حجم المسام ميكرومتر 0.4 استخدمت لمنع حركة الخلية الجسدية من دبسكس من الجزء العلوي إلى الجزء السفلي من خلال الغشاء. زادت جزيئات يفرزها من دبسكس الصفر إغلاق الكمبيوتر-3 الخلايا إلى حد كبير بالمقارنة مع خلايا عنصر التحكم. PC-3 الخلايا المستزرعة يشترك مع دبسكس أظهر إغلاق الصفر 51% بينما الخلايا تحكم إغلاق 38% بعد 24 ساعة (الشكل 3A). المباشر المشترك الثقافات المحتوية على نسبة 1:1 من دبسكس واستخدمت كمبيوتر-3 خلايا لتحليل التنظيم الذاتي للخلايا الجذعية والخلايا السرطانية. الخلايا كانت ملطخة بالأصباغ الغشاء الأحمر والأخضر التمييز بين أنواع مختلفة من الخلايا تحت المجهر. PC-3 الخلايا ملطخة بالصبغ الأحمر الفلورية كانت محاطة دبسكس في بنية تشبه الأنبوب بعد فترة حضانة 24 ساعة. تم تحليل الخلايا المستزرعة شارك ملطخة بالأصباغ الفلورية بالتدفق الخلوي استناداً إلى تلطيخ الأسفار، وتم الكشف عن نسب الخلية. دبسكس وخلايا PC-3 إنشاء بنية حسنة تنظيم التي تكاثرت الخلايا PC-3 سرعة بعد 48 ساعة (الشكل 3B). على الرغم من أن الخلايا كانت تبذر في نسبة متساوية (1:1) لثقافة المشاركة المباشرة، تحددت 62.22 ٪ خلايا PC-3 بعد الاحتضان ح 48، مما يشير إلى ارتفاع معدل انتشار الخلايا PC-3.

رقم 1: تحديد خصائص الخلايا الجذعية لب الأسنان (دبسكس)- (أ) لب الأنسجة التي تم الحصول عليها من مركز الأسنان. بار (ب) مورفولوجيا خلية تنتجها الخلايا الليفية مثل دبسكس-الحجم: 100 ميكرومتر. (ج) التدفق الخلوي تحليلات دبسكس. CD29، CD73، CD90، CD105 و 166 مؤتمر نزع السلاح علامات السطحية الإيجابية، بينما CD14، CD34، و CD45 علامات السطح السلبية. NC: السلبية السيطرة (المتوسطة النمو تعامل الخلايا). وأكد "التمايز دبسكس" (د) لأنواع الخلايا الوسيطة مع فون كوسي تلطيخ، الأزرق السيان تلطيخ، وقطرات الدهن (شريط الحجم: 200 ميكرومتر). أوستيوكالسين، اكتب الكولاجين الثاني (العمود الثاني)، والأحماض الدهنية ملزمة البروتين 4 (FABP4) إيمونوستينينجس وأظهر التفريق بين osteo وشندرو، وأديبوجينيك بار دبسكس-جدول: 200 ميكرومتر. وهذا الرقم مقتبس من دوغان et al. 34- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: جمع شرط المتوسطة (سم) من دبسكس لتحليل الجدوى والصفر الخلية. كانت TUNEL الخلايا إيجابية بنسبة 20% سم (v/v) تطبيق. القياس الكمي لإغلاق الصفر أظهرت أن سم زيادة الهجرة الخلية PC-3. الطول: متوسطة مشروطة؛ NC: السلبية السيطرة (المتوسطة النمو تعامل الخلايا). * ف < 0.05. وهذا الرقم مقتبس من دوغان et al. 34- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: منهجية للخلية جيدا عبر الهجرة المقايسة والثقافة المشتركة. (أ) PC-3 الخلية إغلاق الصفر في نظام الثقافة المشارك ترانس-جيدا. (ب) نمط التفاعل الملون دبسكس (الفلورية الخضراء) والكمبيوتر-3 الخلايا (حمراء الأسفار) بعد ح 24 و 48 ساعة لثقافة المشارك (نسبة 1:1 بذر). تم الكشف عن ارتفاع عدد الخلايا PC-3 فيما يتعلق بشريط دبسكس-النطاق: 200 ميكرومتر. وهذا الرقم مقتبس من دوغان et al. 34- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.