نقدم هنا، بروتوكولا لتشكيل بليرس الدهن باستخدام أسلوب بلير اتصال فقاعي. هو مهب فقاعة مياه في المذيبات عضوية، حيث تتشكل من أحادي الطبقة على الواجهة المائية للنفط. يتم التلاعب بها الماصات اثنين لإرساء فقاعات لتشكيل من بلير.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
دهن بلير التجارب مع بليرس فقاعة الاتصال للتصحيح--كلامبيرس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
دهن بليرس توفير منصة تجريبية فريدة من نوعها للدراسات الفنية من قنوات أيون، مما يتيح دراسة التفاعلات غشاء القناة تحت غشاء مختلف التراكيب الدهن. فيما بينها، وقد اكتسب bilayer واجهة الحبرية شعبية؛ ومع ذلك، حجم كبير الغشاء يعوق تسجيل منخفضة الضوضاء الكهربائية. وقد أنشأنا أسلوب بلير (مصرف البحرين المركزي) فقاعة اتصال الذي يجمع بين فوائد الدهن مستو بلير وأساليب التصحيح-المشبك، مثل القدرة على تكوين الدهن وتختلف والتلاعب الميكانيكا بلير، على التوالي. استخدام برنامج الإعداد لتجارب المشبك التصحيح التقليدية، التجارب المستندة إلى مصرف البحرين المركزي يمكن سهولة إجراء. باختصار، هو حلاً المنحل بالكهرباء في ماصة زجاجية في مهب إلى مرحلة المذيبات عضوية (هيكساديكان)، وهو الإبقاء على الضغط ماصة للحصول على حجم فقاعة مستقرة. الفقاعة عفويا تصطف دهن أحادي الطبقة (الدهون نقية أو الدهون المختلطة)، التي يتم توفيرها من الدهنية في الفقاعات. بعد ذلك، يتم إرساء (~ 50 ميكرومتر في القطر) مبطنة أحادي الطبقة فقاعتين في غيض الماصات الزجاجية لتشكيل بيلايير. إدخال تشكيل القناة الدهنية في الفقاعة يؤدي إلى دمج القنوات في بيلايير، مما يسمح لتسجيل قناة واحدة الحالية مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء يمكن مقارنته بتسجيلات المشبك التصحيح. يتم تشكيل كبس مع تكوين دهن غير متماثل سهولة. مصرف البحرين المركزي يتجدد مرارا وتكرارا بتطاير الفقاعات السابقة وتشكيل شراكات جديدة. اضطرابات كيميائية وفيزيائية مختلفة (مثلوغشاء نضح والتوتر bilayer) يمكن أن تفرض على كبس. هيرين، نقدم الإجراء الأساسي لإنشاء مصرف البحرين المركزي.
المقدمة
للقنوات الأيونية، غشاء الخلية ليست مجرد مادة داعمة بل شريكا لتوليد تدفق أيون. وظيفيا، الغشاء عازل كهربائي أيون التي يتضمنها القنوات، وجميع أغشية الخلايا المهلة مع غشاء يستريح محتملة. تقليديا، كان تفرض غشاء تعسفية محتملة من دائرة خارجية التي تم قياس التيار الكهربائي عن طريق القنوات. وكشف هذا التقييم الكمي للجريان أيون في إمكانات غشاء مختلف الخصائص الجزيئية لهذه القنوات، مثل ما تخلل الأيوني الانتقائي والنابضة وظائف1،2. هو منهاج الدراسات الفنية لقنوات أيون الغشاء غشاء الخلية أو الغشاء بلير الدهن. تاريخيا، التسجيلات الحالية الكهربائية قناة واحدة أجريت أولاً في دهن بليرس3،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الدهنية
- تفريق فوسفوليبيدات (مثلاً، 10 ملغ مسحوق) في كلوروفورم بتركيز المطلوب (مثلاً، 10 ملغ/مل).
- تتبخر كلوروفورم.
- مكان الحل فسفوليبيد في قارورة مستديرة القاع ومجموعة فعلى مبخر دوراني (انظر الجدول للمواد) متصل باسطوانة غاز2 ن. قم بتدوير قارورة تحت تدفق2 ن في درجة حرارة الغرفة حتى يظهر فيلم فسفوليبيد رقيقة (بعد ~ 30 دقيقة).
- ضع قارورة مفتوحة إلى مجفف متصل بمضخة فراغ. استخدام مضخة فراغ، نضح داخل مجففة لعدة ساعات لإزالة كلوروفورم دقة.
- إضافة وحدة تخزين مناسبة لحل المنحل بالكهرباء إلى قارورة وتعليق فسفوليبيد للحصول على 2 مغ/مل تعليق فسفوليبيد. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نموذجي مصرف البحرين المركزي قد يبلغ قطرها 50 ميكرومتر (الشكل 5، 6) والسعة الغشاء محددة في هيكساديكان 0.65 µF/سم2. ويسيطر حجم الفقاعة تعسفاً من الضغط داخل فقاعة. عندما فقاعات صغيرة ضرورية لتسجيلات منخفضة الضوضاء، ينبغي أن تكون قطر تلميح صغيرة في المقابل. على سبيل المثال، ينبغي أن يكون قطر تلميح لحجم فقاعة 50 ميكرومتر في القطر، 30 ميكرومتر.
متى شكلت مصرف البحرين المركزي، أد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
طريقة الدهن بلير تشكيل مصرف البحرين المركزي يستند على مبدأ معالجة المياه في النفط تجميعية مبطنة ب أحادي الطبقة20. من الناحية التقنية، إجراءات تشكيل كبس سهلة، خاصة بالنسبة للتصحيح-المشبك الباحثين، الذين يجيدون التلاعب ميكروبيبيتيس الزجاج. سهولة يستخدم الإعداد الكهربية المشبك التصحيح في مصرف البحرين المركزي عندما تتوفر المتلاعبين ماصة اثنين مع ميكروينجيكتورس. من ناحية أخرى، نظراً لمصرف البحرين المركزي خلفا للإرشاد التقليدية، لكان قدر كبير من المعارف الفيزيائية الكيميائية المتراكمة8.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
شكر وتقدير
المؤلف يود أن يشكر ياماتاكي ماريكو وتاكاشيما ماساكو للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل في جزء من كاكينهي أرقام المنح ح 16 00759 و 17 ح 04017 (هكذا).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Azolectin (L- & alpha ؛ - فوسفاتيديل كولين ، النوع IV-S) | Sigma-Aldrich | P3644 | |
| A / D محول | الشقوق الجزيئية | Digidata1550A | |
| Ag / AgCl القطب الكهربائي | Warner Instruments | 64-1317 | |
| Bath Sonicator | Branson | M1800H-J | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| زجاج شعري | هارفارد جهاز | 30-0062 | |
| Hepes | Dojindo | 342-01375 | |
| ثقب منزلق زجاجي | ماتسونامي زجاج | S339929 | |
| مجهر مقلوب | أوليمبوس | IX73 | |
| طاولة العزل | Herz | TDI-86LA (Y) 2 | |
| Micro Injenctor | Narishige | IM-11-2 | |
| مناور دقيق | Narishige | EMM | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| حامل | |||
| دقيقة n-Hexadecane | Nacalai | 07819-32 | |
| مكبر للصوت التصحيح المشبك | HEKA | EPC800 | |
| ماصة مجتذب | Sutter Instrument Co. | P-87 | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
| POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine ) Avanti | Polar Lipids | 850757 | |
| POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)) Avanti | Polar Lipids | 840457 | |
| كلوريد البوتاسيوم | Nacalai | 28514-75 | |
| مبخر دوار | Iwaki | REN-1000 | |
| Succinic Acid | Nacalai | 32402-05 | |
| مضخة فراغ | Buchi | V-100 |
المراجع
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer Associates Inc. Sunderland. (2001).
- Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
- Mueller, ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
