Method Article

ميكروفلويديكس التواصل مع صفائف ميكروليكترودي لدراسة الاتصالات العصبية ونشر إشارة محواري

DOI:

10.3791/58878

⸱

December 8th, 2018

 ,  , 
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويهدف هذا البروتوكول لشرح كيفية الجمع في المختبر ميكروليكترودي صفائف أجهزة موائع جزيئية لدراسة انتقال إمكانات العمل في الثقافات العصبية. تحليل البيانات، إلا وهي كشف وتوصيف للترويج لإمكانات العمل، يتم تنفيذه باستخدام جديدة متقدمة، بعد سهلة الاستخدام ومتاحة بحرية، أداة حسابية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميكروليكترودي صفائف (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) تستخدم على نطاق واسع لدراسة وظيفة الخلايا العصبية في المختبر. تسمح هذه الأجهزة المتزامنة تسجيل غير الغازية/حفز النشاط الكهربية لفترات طويلة. ومع ذلك، يمكن أن تصبح خاصية الاستشعار من الإشارات من جميع المصادر حول كل ميكروليكترودي غير المواتية عند محاولة فهم الاتصال وإشارة الدعوة في الدوائر العصبية. في شبكة الخلايا العصبية، الخلايا العصبية عدة يمكن تفعيلها في نفس الوقت ويمكن أن تولد إمكانات العمل المتداخلة، مما يجعل من الصعب تمييز وتتبع انتشار الإشارات. ونظرا لهذا القيد، وقد أنشأنا إعداد في المختبر تركز على تقييم الاتصالات الكهربية، التي قادرة على عزل وتضخيم الإشارات محواري مع عالية الدقة المكانية والزمانية. بربط أجهزة موائع جزيئية والاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، نحن قادرون على تقسيم الخلايا العصبية الثقافات مع محاذاة التي تسيطر عليها جيدا لمحاور عصبية وميكروليكتروديس. يسمح هذا الإعداد تسجيلات لإكثار ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية على مدى عدة أسابيع. جنبا إلى جنب مع خوارزميات تحليل البيانات المتخصصة، وهو يوفر الكمي مفصلة للاتصالات عدة تتعلق بخصائص مثل سرعة النشر، فشل التوصيل، ومعدل إطلاق النار، التموج anterograde، والترميز الآليات.

هذا البروتوكول يوضح كيفية إنشاء إعداد ثقافة العصبية مجزأة على الركازة المتكاملة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف وكيفية الثقافة الخلايا العصبية في هذا الإعداد، وكيفية نجاح تسجيل وتحليل وتفسير النتائج من هذه التجارب. هنا، نحن إظهار كيف يبسط الإعداد الثابتة فهم الاتصالات العصبية ونشر إشارة محواري. هذه المنصات تمهد الطريق لنماذج في المختبر جديدة مع تصاميم شبكة الخلايا العصبية هندسيا والسيطرة عليها. يمكن استخدامها في سياق الثقافات العصبية متجانسة، أو مع تكوينات ثقافة المشارك فيها، على سبيل المثال، الاتصال بين الخلايا العصبية الحسية وأنواع الخلايا الأخرى هو رصد وتقييم. يوفر هذا الإعداد ظروف مثيرة جداً للاهتمام للدراسة، على سبيل المثال، النماء العصبي، الدوائر العصبية، والترميز، ونهج نيوروديجينيريشن ونيوروريجينيريشن من المعلومات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم الاتصالات الكهربائية في الدوائر العصبية خطوة أساسية الكشف عن وظيفة طبيعية، ووضع استراتيجيات علاجية لمعالجة الخلل. دمج الخلايا العصبية وحساب وترحيل إمكانات العمل (الجزائرية) التي تنتشر على طول محاور عصبية رقيقة على. التقنيات الكهربية التقليدية (مثلاً، تصحيح المشبك) هي تقنيات قوية لدراسة نشاط الخلايا العصبية ولكن غالباً ما تكون محدودة للهياكل الخلوية أكبر، مثل سوما أو dendrites. تقنيات التصوير توفر بديلاً لدراسة الإشارات محواري مع عالية الدقة المكانية، ولكنها صعبة من الناحية الفنية لأداء وعدم السماح بالقياسات الطويلة الأجل1. وفي هذا السياق، يمكن الجمع بين ميكروليكترودي صفائف (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) وميكروفلويديكس مساهمة قوية في الكشف عن الخصائص الأساسية لانتقال النشاط وإشارة neuron´s داخل الشبكات العصبية في المختبر2 , 3.

تكنولوجيا شركة طيران الشرق الأوسط تعتمد على التسجيلات خارج الخلية من الخلايا العصبية الثقافات. المزايا الرئيسية لهذه المنهجية الكهربية هي قدرته على دعم التحفيز الفورية وطويلة الأجل وتسجيل في مواقع متعددة وفي طريقة غير الغازية3. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مصنوعة من ميكروليكتروديس موصلة ومقاومة للتآكل متوافق حيويا، وارتفاع جزءا لا يتجزأ من الركازة رقاقة زجاج. متوافقة مع الخلية التقليدية الثقافة الأحيائية-الطلاء التي عن طريق تعزيز التصاق الخلايا إلى حد كبير زيادة مقاومة الختم بين الركيزة والخلايا3،4. وعلاوة على ذلك، فهي تنوعاً في التصميم وقد تختلف في حجمها ميكرويليكتروديس والهندسة والكثافة. إجمالاً، الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف العمل كخلية التقليدية الثقافة السفن مع ميزة السماح المتزامنة العيش-التصوير والكهربية التسجيلات/التحفيز.

استخدام تكنولوجيا شركة طيران الشرق الأوسط ساهمت دراسة الميزات الهامة للشبكات العصبية5. ومع ذلك، هناك ميزات المتأصلة التي تحد من الأداء للاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لدراسة الاتصالات ونشر وكالة الأنباء الجزائرية في دائرة العصبية. تمكين تسجيلات من الخلايا المفردة وهياكل حتى سوبسيلولار مثل محاور عصبية من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، ولكن إذا ما قورنت بإشارات سمال، إشارات محواري لديها نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة جداً (الاستخبارات)6. وعلاوة على ذلك، يعوق خاصية الاستشعار عن إمكانات الحقل خارج الخلية من جميع المصادر حول كل ميكروليكترودي تتبع انتشار الإشارات في دائرة العصبية.

قد أظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا، بيد أن ظروف تسجيل أفضل يتحقق قبل وبعد ميكروليكتروديس محاذاة حدود ميكروتشانيلس الضيقة التي يمكن أن تنمو محاور عصبية. يوفر هذا التكوين زيادة كبيرة في دائرة الاستخبارات الوطنية أن نشر إشارات محواري يمكن بسهولة اكتشاف7،،من89،10،،،من1112 13. استراتيجية يتحالف أجهزة موائع جزيئية مع تكنولوجيا طيران الشرق الأوسط يخلق المكروية معزولة كهربائياً مناسبة لتضخيم الإشارات محواري11. وعلاوة على ذلك، وجود ميكروليكتروديس الاستشعار متعددة على طول ميكروجروفي شرطا أساسيا لكشف وتوصيف لإكثار إشارة محواري.

يمكن تكييفها للعديد من الأسئلة البحثية14هذه المنصات في المختبر مع تصاميم شبكة الخلايا العصبية يمكن السيطرة عليها بشدة. هذه المنابر هي مناسبة لاستخدامها في سياق الثقافات الخلايا العصبية ولكن يمكن توسيعها لمهندس تكوينات الثقافة المشتركة، حيث يمكن رصد وتقييم الاتصال بين الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى. وهكذا يوفر هذا الإعداد ظروف مثيرة جداً للاهتمام لاستكشاف عدد من الدراسات المتصلة بالعصبية مثل النماء العصبي ودوائر الخلايا العصبية وترميز المعلومات، نيوروديجينيريشن ونيوروريجينيريشن. وعلاوة على ذلك، الاقتران مع النماذج الناشئة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent15،16 يمكن فتح سبل جديدة في تطوير العلاجات المحتملة للبشرية من الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي.

لدينا مختبر باستخدام منصة هذا الجمع بين ميكروليكتروديس ميكروفلويديكس (µEF) لفهم العمليات العصبية على المستوى الخلوي وشبكة الاتصال وأثرها في الفيزيائية-والجهاز العصبي باثولوجي. ونظرا لقيمة هذه المنصة في ميدان علم الأعصاب، والغرض من هذا البروتوكول لشرح كيفية إنشاء ثقافة العصبية مجزأة على الركازة المتكاملة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، كيف يمكن لثقافة العصبية في هذا النظام الأساسي، وكيفية تسجيل بنجاح، تحليل وتفسير النتائج من هذه التجارب. التأكيد ستثري هذا البروتوكول الأدوات التجريبية للثقافات العصبية في الدراسة للاتصالات العصبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا "الاتحاد الأوروبي" (EU) التوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي (نقلها للقانون البرتغالي ب المرسوم-ليات 113/2013). وأقر البروتوكول التجريبي (0421/000/000/2017) لجنة الأخلاقيات كلا البرتغالية الرسمية السلطة على الرفق بالحيوان والتجريب (ه Direção Geral de Alimentação Veterinária-دجاف) والمؤسسة المضيفة.

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافة وحلول أخرى

ملاحظة: إعداد طازجة الحلول طلاء في يوم استخدامه. قد يتم تخزين الحلول طلاء غير المستخدمة وثقافة وسائل الإعلام في-20 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية كما هو مفصل أدناه.

  1. إعداد 10 مل من 0.05% (v/v) Poly(ethylene imine) (جزيرة الأمير إدوارد) العامل الحل.
    1. إعداد 20 مل من 0.25% (w/v) بي الأسهم الحل عن طريق تذويب بي المنقي (انظر الجدول للمواد) في الماء المعقم.
    2. تمييع 2 مل من 0.25% (w/v) بي حل الأسهم في 8 مل ماء المقطر المعقم. يخلط جيدا واستخدامها. ويمكن تخزين حل غير مستخدمة في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد 1 مل حل laminin 5 ميكروغرام/مل.
    1. تمييع 5 ميليلتر من 1 ملغ/مل laminin الحل الأسهم في ميليلتر 995 متوسطة القاعدية (انظر الجدول للمواد). يخلط جيدا واستخدامها. ويمكن تخزين حل غير المستخدمة مجمدة في-20 درجة مئوية لتصل إلى 1-2 أسابيع.
  3. تحضير 1 لتر من هانك مخزنة حبيس حل متوازن الملح (ح-حبس).
    1. تحضير 1 م حبيس الحل بتذويب 11.9 غراما مسحوق حبيس في 50 مل الماء عالي النقاوة. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.2.
    2. تحضير حل ح-حبس (دون الكالسيوم والمغنيسيوم) بإذابة كلوريد البوتاسيوم 5.33 مم، 0.44 مم بوتاسيوم فوسفات مونوباسيك وكلوريد الصوديوم 138 مم، فوسفات الصوديوم 0.3 مم مائي والجلوكوز 5.6 ملم في 800 مل من الماء عالي النقاوة.
    3. إضافة 15 مل م 1 حبيس الحل (تركيز النهائي من 15 ملم).
    4. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 0.2-0.3 وحدات أدناه الرقم الهيدروجيني المطلوب 7.4 استخدام 1 N HCl أو هيدروكسيد الصوديوم ن 1. إضافة الماء عالي النقاوة أن يصل حجم الحل النهائي.
      ملاحظة الرقم الهيدروجيني يميل إلى الارتفاع أثناء الترشيح.
    5. تعقيم بالترشيح باستخدام 0.22 ميكرومتر مسامية غشاء poly(ether sulfone) (PES).
  4. إعداد 10 مل من ح-حبس تحتوي على 10% الحرارة-إبطال "المصل البقري الجنين" (هيفبس).
    1. تمييع 1 مل هيفبس في 9 مل من ح-حبس. يخلط جيدا واستخدامها. ويمكن تخزين حل غير المستخدمة عند 4 درجة مئوية لمدة 3-4 أسابيع.
  5. إعداد 5 مل من 1.5 ملغ/مل الحل التربسين.
    1. فورا قبل الاستخدام، حل 7.5 ملغ التربسين في 5 مل هبس ح. تعقيم بالترشيح باستخدام غشاء الدائرة العامة مسامية 0.22 ميكرومتر.
  6. إعداد 50 مل متوسطة المكملة.
    1. في أنبوب 50 مل مخروطية، مزيج من 48.5 مل متوسطة القاعدية (انظر الجدول للمواد)، 2% (v/v) الملحق B-27، 0.5 مم الجلوتامين لام و 1% القلم/بكتيريا (10,000 يو/مليلتر البنسلين و 10,000 ميكروغرام/مل ستربتوميسين). ويمكن تخزين المتوسطة المكملة في 4 درجات مئوية لمدة 3-4 أسابيع.

2-موائع جزيئية وإعداد أجهزة شركة طيران الشرق الأوسط

ملاحظة: الخطوات 2.1 2.11 في اليوم قبل البذر الخلية.

  1. تنظيف أجهزة موائع جزيئية لإزالة التصنيع وغيرها من الحطام باستخدام الأشرطة الفينيل. اضغط برفق الشريط ضد الجهاز للوصول إلى جميع المناطق للجهاز.
  2. الهواء تنظيف البلازما في شركة طيران الشرق الأوسط لمدة 3 دقائق (0.3 [مبر]) تنظيف السطح وجعله أكثر ماء.
  3. باختصار تغرق أجهزة موائع جزيئية في الإيثانول 70% وتمكينهم من أيردري داخل غطاء الاندفاق الصفحي.
  4. ضع كل اتفاق بيئي متعدد الأطراف في 90 ملم معقمة طبق بيتري وتعقيم لهم قبل 15 دقيقة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء.
  5. معطف طيران الشرق الأوسط وسط المساحة السطحية التي تفرخ مع 500 ميليلتر من 0.05% (v/v) بي الحل على الأقل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: كما هو موضح بالآخرين17، طلاء بي للاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف النتائج في الخلية أقل المجموعات من استخدام طلاء poly(lysine).
  6. نضح الحل طلاء بي من على سطح الأرض في شركة طيران الشرق الأوسط وتغسل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف 4 x مع 1 مل من تعقيم ماء مقطر. احرص على عدم لمس سطح طيران الشرق الأوسط أثناء الغسيل خطوات كهذه يمكن أن تلحق الضرر الأقطاب.
  7. تسترشد ستيريوميكروسكوبي داخل غطاء الاندفاق الصفحي، مركز رقاقة شركة طيران الشرق الأوسط وإضافة 1 مل الماء المعقم للمنطقة الوسطى في شركة طيران الشرق الأوسط.
  8. مكان الجهاز موائع جزيئية على رأس السطح اتفاق بيئي متعدد الأطراف.
  9. بعناية قم بمحاذاة ميكروجروفيس موائع جزيئية الجهاز مع شبكة ميكروليكترودي الشرق الأوسط وأفريقيا.
  10. عند محاذاتها بشكل صحيح، بعناية نضح المياه الزائدة دون لمس في اتفاق بيئي متعدد الأطراف أو الجهاز موائع جزيئية.
  11. احتضان µEFs بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية لتجف والسماح بالمرفقات كاملة. تيسيرا للمرفق، اضغط برفق الجهاز موائع جزيئية مناهضة اتفاق بيئي متعدد الأطراف.
    ملاحظة: تنفيذ الخطوة 2.12 اليوم من الخلية البذر.
  12. حالما يكون تماما المجففة µEFs، تحميل الآبار موائع جزيئية مع 150 ميليلتر من 5 ميكروغرام/مل laminin طلاء الحل واحتضانها في 37 درجة مئوية على الأقل 2 ح قبل البذر الخلية.
    ملاحظة: عند تحميل µEF مع حل لامينين، تأكد من أن الحل الذي يملأ ميكروجروفيس. استخدام فراغ لإزالة أي فقاعة الهواء التي قد تكون موجودة داخل ميكروجروفيس.

3-تشريح قشرة بريفرونتال

  1. تعد منطقة تشريح لإزالة الجنين.
    1. تطهير سطح العمل والأدوات الجراحية مع الإيثانول 70%.
      ملاحظة: على الرغم من أن هذا التشريح ليس إجراء عقيمة، تطهير يساعد على تقليل فرص التلوث.
    2. استخدم حفاضات نظيفة المتاح لحصر مجال التشريح ووضع الأدوات الجراحية لإزالة الجنين.
    3. يعد 4 أطباق بيتري 90 ملم مليئة بحبس ح الباردة ووضعها على صينية مع الجليد قرب منطقة التشريح.
  2. Euthanize E-18 وقت حوامل جرذان ويستار باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2).
  3. عند انتهاء الإجراء، إزالة الحيوان من الدائرة2 CO وتأكيد الوفاة بطريقة ثانوية للقتل الرحيم، مثل اكسسانجوينيشن.
  4. ضع الجانب البطني الحيوان أعلى في حفاضات المتاح ورذاذ أسفل البطن مع الإيثانول 70%، ومع المساعدة من ملقط ومقص، جعل شكل U تخترق الجلد لفضح الرحم.
  5. بعناية إزالة الأجنة من الرحم عن طريق خفض بعيداً أي النسيج الضام ووضعها في واحدة من أطباق بيتري مع حبس ح الباردة.
  6. إزالة كل الأجنة من أن الكيس الجنيني، ومع المساعدة من ملقط ومقص، قطع رأس الجنين.
  7. نقل رئيس embryo´s إلى طبق بتري ثاني مليئة بحبس ح الباردة.
  8. كرر الخطوات من 3.6-3.7 لكل جنين.
  9. تشريح قشرة بريفرونتال.
    1. نقل لرئيس embryo´s إلى ثالث طبق بيتري.
    2. استخدام زوج من الملقط لفضح الدماغ.
    3. إزالة المخ من تجويف، وتغطية ذلك مع حبس ح الباردة.
    4. إذا كانت موجودة, إزالة وتجاهل المصابيح شمي. تشريح قشرة بريفرونتال وإزالة السحايا.
    5. نقل أجزاء قشرة prefrontal إلى طبق بتري الرابعة مليئة بحبس ح الباردة.
    6. كرر الخطوات 3.9.1-3.9.5 لكل جنين.

4. الانفصال من الخلايا العصبية القشرية والثقافة في µEF

ملاحظة: الإجراءات التالية التي أجريت داخل غطاء الاندفاق الصفحي بعد 15 دقيقة دورة التعقيم الأشعة فوق البنفسجية. تعمل المساحة السطحية، فضلا عن جميع المواد التي وضعها داخل غطاء محرك السيارة ينبغي أن يكون سبق تطهيرها مع الإيثانول 70%.

  1. كما هو موضح في الخطوة 1، 5، حل التربسين سابقا مرجح في 5 مل ح-حبس وتصفية الحل.
  2. جمع القطع اللحاء تشريح سابقا في ما مجموعة 5 مل ح-حبس. نقلها إلى أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل.
  3. إضافة 2.3 مل من محلول التربسين طازجة 1.5 ملغ/مل للأنبوبة التي تحتوي على أجزاء اللحاء.
  4. مزيج التعليق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (بإيجاز تحرض كل 5 دقائق).
  5. وقف الهضم الأنسجة وتغسل التربسين.
    1. تجاهل المادة طافية المتضمن في التربسين. إضافة 5 مل ح-حبس تحتوي على 10% هيفبس لإلغاء تنشيط التربسين المتبقية؛ تحرض بلطف.
    2. واسمحوا أجزاء اللحاء يستقر وثم تجاهل المادة طافية.
    3. إضافة 5 مل ح-حبس لإزالة بقايا هيفبس. واسمحوا أجزاء اللحاء يستقر وتجاهل المادة طافية.
    4. أغسل مرة أخرى أجزاء اللحاء مع 5 مل من ح-حبس.
    5. واسمحوا أجزاء اللحاء يستقر وتجاهل المادة طافية. إضافة 5 مل متوسطة العصبية المكملة.
  6. ميكانيكيا فصل أجزاء اللحاء مع ماصة مقايسات 5 مل ببطء بيبيتينج صعودا وهبوطاً لمن 10-15 مرة. إذا لزم الأمر، كرر الإجراء باستخدام ماصة صغيرة عيار إلى تعليق خلية تصبح متجانسة.
  7. تجاهل الأنسجة أونديسوسياتيد المتبقية عن طريق تصفية الحوض تعليق خلية مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
  8. عد الخلايا قابلة للتطبيق وتحديد كثافة الخلية.
    1. في microtube، بإضافة 20 ميليلتر من 0.4% (w/v) تريبان الأزرق على تعليق خلية 20 ميليلتر. خلط جيدا إلى هوموجيناتي الحل ونقل 10 ميليلتر نويباور العد الدائرة.
    2. عد الخلايا قابلة للتطبيق وتحديد كثافة خلية من خلايا قابلة للحياة.
  9. ضبط كثافة الخلية إلى 3.6 × 107 خلايا/مل (إذا لزم الأمر، الطرد المركزي تعليق الخلية).
  10. مباشرة قبل الخلية البذر، إزالة الطلاء لامينين من جميع الآبار µEF. "الماصة؛" 50 ميليلتر من المتوسطة المكملة لكل بئر من حجرة محواري µEF.
  11. البذور 5 ميليلتر من تعليق خلية في حجرة سمال µEF. احتضان في 37 درجة مئوية ح 1، للسماح لمرفق الخلايا إلى الركيزة.
  12. بلطف ملء كل جيدا من µEF مع حرارة متوسطة المكملة. نقل µEF إلى حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية، زودت شركة 5%2.
    ملاحظة: لتجنب التبخر السريع الثقافة المتوسطة، ضع فتح microtube مليئة بالمياه داخل طبق بيتري تحمل في µEF.
  13. الحفاظ على الثقافات للفترة المطلوبة بالاستعاضة عن 50% متوسط الثقافة كل يوم إلى الثانية والثالثة والثقافة.
    ملاحظة: بعد هذه التجارب، ميكروفلويديكس يمكن أن تفصل من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف بغمر µEF في المياه بين عشية وضحاها. إذا لزم الأمر، بلطف قشر ميكروفلويديكس بمساعدة الملقط. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف يمكن تنظيفها بالحضانة بين عشية وضحاها بمطهر الانزيمية تجارية 1% (v/v) (انظر الجدول للمواد).

5-تسجيل نشاط الخلايا العصبية التلقائية

ملاحظة: عادة ما يحمل الثقافات العصبية القشرية الجنينية في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف على النشاط العفوي أقرب 7 أيام في المختبر (DIV)، لكن تأخذ 2-3 أسابيع (DIV 14-21) أن تنضج ويحمل مستقرة النشاط. والأمر متروك المجرب تقرر متى تبدأ القياسات الكهربية استناداً إلى أهداف الدراسة. ويتجلى في هذا البروتوكول، وتسجيل نشاط الخلايا العصبية من µEF باستخدام نظام تسجيل تجاري (انظر الجدول للمواد للحصول على تفاصيل الأجهزة)، مع وحدة نمطية لتدفئة إدراجها. لإجراء التسجيلات، استخدمنا برمجيات متاحة بحرية (انظر الجدول للمواد لتفاصيل البرامج).

  1. قم بتشغيل شركة طيران الشرق الأوسط في تسجيل النظام ووحدة التحكم بدرجة الحرارة والسماح للصفيحة القاعدية ساخنة من المضخم تصل إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: للحصول على تسجيلات طويلة الأجل (> 30 دقيقة في كل مرة) واحدة ينبغي أن يكون أيضا نظام أن يحافظ على جو2 CO.
  2. مكان µEF في المضخم (هيادستاجي).
    ملاحظة: تأكد من أن رقاقة شركة طيران الشرق الأوسط يتم محاذاتها بشكل صحيح مع رقم المرجع في ترك الحافة العليا. رقاقة شركة طيران الشرق الأوسط ونحن نستخدم التناوب متناظرة، ولكن هذه المحاذاة يطابق التوجه الصحيح لتخطيط دبوس أقطاب كهربائية ومعرّفات الأجهزة.
  3. أغلق وتحط غطاء المضخم.
  4. لتسجيل، فتح برنامج التسجيل وتحديد معلمات التسجيل والمسار لتيارات البيانات المسجلة (انظر دليل البرامج للحصول على تفاصيل حول كيفية إنشاء نظام تسجيل).
    ملاحظة: اكتساب مع معدل أخذ عينات من 20 كيلوهرتز عموما ما يكفي لمعظم تطبيقات. تردد أخذ عينات أعلى من المستحسن إذا كان مطلوباً المزيد من الدقة في توقيت سبايك. إذا كان أحد تعتزم فقط سجل والتموج، تعيين عامل تصفية عالية تمرير في 300 هرتز، التي سوف تخفف من مكونات تردد أدنى الإشارة. إذا كان يتم تسجيل البيانات الخام والتي تمت تصفيتها في وقت واحد، هذا سيزيد إلى حد كبير حجم ملف البيانات. من الممكن دائماً القيام بتصفية دون اتصال للبيانات الخام. كما يمكنك تحديد حجم ملف واحد للحد من البيانات ميكروليكتروديس من خلالها إلى السجل (مثلاً، فقط ميكروليكتروديس داخل ميكروجروفيس).
  5. انقر فوق بدء دق البدء في الحصول على البيانات. تحقق إذا كان العرض يظهر آثار النشاط وتسجيل بدء التشغيل.
    ملاحظة: مستوى الضوضاء عادة أعلى قليلاً في ميكروليكتروديس المقابلة ميكروجروفيس. إذا كان مستوى الضجيج مرتفع جداً (السعة الذروة إلى الذروة > 50 µV) أو متقلب في عدة ميكروليكتروديس، يمكن أن يكون سبب الاوساخ تعيق اتصال لوحة pin جيدة. عادة يتم حل هذه المشكلة قبل التنظيف بلطف منصات الاتصال شركة طيران الشرق الأوسط ودبابيس المضخم باستخدام مسحه القطن مبلل مع الإيثانول 70%.
  6. فتح ملف مسجل في برنامج التحليل (انظر الجدول للمواد) لاستكشاف البيانات بسرعة.

6-بيانات التحليل

ملاحظة: تظهر الخطوات التالية كيفية استخدام البرمجيات µSpikeHunter، وأداة الحاسوبية المتقدمة في مختبر لاغيار (متاحة عند الطلب أرسل إلى pauloaguiar@ineb.up.pt،) لتحليل البيانات المسجلة مع µEF. يتم استخدام واجهة مستخدم رسومية (الشكل 2) لتحميل البيانات، وتحديد نشر ارتفاع الأمواج، وتحديد اتجاهها (anterograde أو إلى الوراء) وتقدير سرعات الانتشار. µSpikeHunter متوافق مع HDF5 الملفات التي تم إنشاؤها من التسجيلات التي تم الحصول عليها باستخدام نظم الأسرة MEA2100، التي يمكن أن تستخدم بالاقتران مع 60-120-والقطب 256 الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. التسجيلات التي تم الحصول عليها باستخدام المجرب متعدد القنوات يمكن تحويلها بسهولة إلى ملفات HDF5 باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية (انظر الجدول للمواد).

  1. انقر فوق استعراض لتحديد ملف التسجيل. ثم، انقر فوق الزر "معلومات الملف" قائمة معدل أخذ العينات ومدة التسجيل، فضلا عن قائمة بالجداول البيانات المسجلة (على سبيل المثال، البيانات الأولية، البيانات المصفاة).
    ملاحظة: لتقديرات سرعة الانتشار الحقيقية، من المستحسن لتحديد دفق البيانات الخام للتحليل.
  2. حدد ميكروليكتروديس (صف واحد أو عمود المقترنة ميكروجروفي) لتحليل وتعيين قيمة عتبة الكشف عن سبايك (مرحلة إيجابية أو سلبية) في 6 × الانحراف المعياري (SD) من الضوضاء إشارة. انقر فوق قراءة البيانات لتطبيق الكشف عن الحدث والحصول على تسلسل النشر التي تم تحديدها.
    ملاحظة: إذا استوفيت المعايير، سيتم ملء قائمة تسلسل نشر الكشف عن لوحة التحليل. يمكن للمستخدم ثم عرض والتفاعل مع العديد من أدوات التحليل لتسلسل النشر، بما في ذلك آثار الجهد والصليب-الارتباطات بين ميكرويليكترودي وسرعات الانتشار تسلسل واحد، كيموجراف وأداة تشغيل صوت. على الرغم من أن يمكن الحصول على تقدير سرعة النشر لأي زوج من ميكروليكتروديس أو كمتوسط تقديرات لجميع أزواج، هذا التقدير أكثر موثوقية إذا زوج الأبعد محدداً.
  3. كرر الخطوة السابقة لمجموعات ميكروليكترودي من الفائدة. في كل مرة انقر فوق حفظ كافة الأحداث لحفظ الوقت والسعة من المسامير (في كل من ميكروليكتروديس) لكل تسلسل النشر المحددة إلى ملف CSV.
  4. استيراد ملفات CSV بالبيئات تحليل البيانات لمزيد من التحليل لأنماط النشاط للثقافة (معدل إطلاق النارمثلاً ، سبايك بين الفواصل الزمنية).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا، E-18 الفئران القشرية الخلايا العصبية المصنف في µEF قادرة على تطوير وتظل سليمة في هذه الظروف الثقافة لأكثر من شهر. أقرب وقت ممكن من 3 إلى 5 أيام في الثقافة، تنمو الخلايا العصبية القشرية على محاور عصبية من خلال ميكروجروفيس صوب حجرة محواري من µEF (الشكل 1). بعد 15 يوما في الثقافة، الخلايا العصبية القشرية مثقف في µEF من المتوقع أن يحمل مستويات ثابتة للنشاط ومن المتوقع نشر إمكانات العمل على طول ميكروجروفيس. الثقافات القديمة (> 14...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول المعروضة هنا يوضح كيفية تجميع µEF، وتتألف من جهاز موائع جزيئية وشركة طيران الشرق الأوسط مع التصاميم الموحدة المتاحة تجارياً، وكيفية تحليل البيانات المسجلة.

عند تصميم تجربة، أن الباحثين يجب أن تراعي أنه محدود النموذجي في المختبر بالشبكة الثابتة اتفاق بيئي متعدد الأطراف، مما يحد من ترتيبات ميكروجروفي. استخدام موائع جزيئية معينة أو تصميم شركة طيران الشرق الأوسط سوف يتوقف على احتياجات تجريبية محددة، لكن بشكل عام، ينبغي أن ينطبق نفس الخطوات الإجرائية على تكوينات مختلفة µEF.

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومولت هذا العمل FEDER-الصناديق Fundo يوروبيو للتنمية الإقليمية من خلال المنافسة عام 2020--برنامج أوبيراسيونال للقدرة التنافسية، وتدويل (المراسلة)، البرتغال عام 2020، والبرتغالية تمول عن طريق إقليم العاصمة الاتحادية-مؤسسة الفقرة أ Ciência ه تكنولوجيا/الهنود دا Ciência، ه تكنولوجيا متفوقة إنسينو في إطار المشروع يبحث/CTM-نان/3146/2014 (برنامج التعليم بالمراسلة-01-0145-فدر-016623). وأيد خوسيه ج ماتيوس إقليم العاصمة الاتحادية (PD/BD/135491/2018). باولو أغيار أيده Ciência Programa-Programa أوبيراسيونال الصلاحية البشرية (POPH)-تعزيز العمالة العلمية والتربوية ومكتيس والبرنامج إينفيستيجادور إقليم العاصمة الاتحادية، POPH و Fundo يوروبيو الاجتماعية. كانت ملفقة أجهزة موائع جزيئية في إينيسك-مايكروسيستمز، وتكنولوجيات النانو، البرتغال، تحت إشراف جواو بيدرو كوندي وتشو فرجينيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
B-27 Suplement (50X)Thermo Fisher ScientificLTI17504-044
بولي متفرع (إيثيلين إيمين) (PEI) ، 25 كيلو دالتونسيجما ألدريتش408727تنقية PEI المتفرعة عن طريق غسيل الكلى باستخدام غشاء قطع 2.5 كيلو دالتون لمدة 3 أيام عند 4 درجات ؛ C مقابل محلول 5 ملي مولار حمض الهيدروكلوريك (يجدد يوميا). جفف PEI المنقى بالتجميد.
مصفاة الخلية (40 وميكرو ؛ م) فالكون352340
أنابيب دقيقة مخروطية الشكل (1.5 مل)VWR211-0015
حفاضات يمكن التخلص منها ، 60x40 سمBastos Viegas SA455-019
ملقط دومون # 5 ، أدواتالعلوم الدقيقةالمستقيمة 91150-20
ملقط دومون # 5/45أدوات العلوم الدقيقة11251-35
ملقط دومون # 7 ،أدوات العلوم الدقيقة المنحنية91197-00
مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة بريميومBiowestS181BH-500ML
Laminin من Engelbreth-Holm-Swarm  Sigma-AldrichL2020-1MGقم بإعداد محلول مخزون اللامينين عند 1 مجم / مل عن طريق إذابة المسحوق في الحجم المعني من الوسط غير المكمل. تخزين محلول اللامينين عند -20 درجة ؛ C في كميات صغيرة (20 & micro; L) لتجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة.
L-الجلوتامين 200mM Thermo Fisher ScientificLTID25030-024
Neubauer غرفة عد محسنة (مقياس الدمMarienfeld630010
Neurobasal Medium (1X)Thermo Fisher Scientific21103-049الوسط القاعدي المستخدم في الثقافات العصبية
PDMS أجهزة الموائع الدقيقة  لا ينطبقغير قابل للتطبيقتتكون من مقصورتين لبذر الخلايا مترابطتين بواسطة 20 أخاديد صغيرة مع 450 مو ؛ م الطول والمرات ؛ 10 و مو ؛ م الارتفاع والأوقات ؛ 14 & أبعاد عرض م ومفصولة ب 86 & م (إجمالي المسافة 100 مو ؛ م).
محلول البنسلين والستربتومايسين (P / S) (100X)BiowestL0022-100
PES وحدة تصفية حقنة (Ø ؛ 30 مم) ، 0.22 & micro ؛ m أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبلين فريلابو1730012
، 15 ملأنابيب مخروطية من مادة البولي بروبلين،
50 ملمن البوليسترين
ماصات مصلية من البوليسترين ، 10 مل ؛ثيرمو فيشر Scientific1367811D
البوليسترين ديسكوزابيل الماصات المصلية ، 5 مل   ؛ثيرمو فيشر العلمي1367811D
غشاء السليلوز القياسي المتجدد (2 كيلو دالتون)    مختبرات الطيف132107
مقص جراحيقياسي أدوات العلوم الدقيقة91401-14
MEAs المستوية المتكاملة للركيزة (256 قطبا كهربائيا دقيقا)أنظمة متعددة القنوات256MEA100 / 30iR-ITO252 أقطاب تسجيل نيتريد التيتانيوم (TiN) و 4 أقطاب مرجعية داخلية منظمة في شبكة 16 × 16 مربعة. كل قطب تسجيل هو 30 & micro; م في القطر ومتباعد بمقدار 100 ميكرو ؛ م.
قفل الحقنة ، 10 مل & nbsp ؛Terumo Europe5100-X00V0
طرف قفل الحقنة ، 50 مل   ؛Terumo Europe8300006682
Terg-A-ZymeSigma-AldrichZ273287 مسحوق التنظيف النشط بالإنزيم المستخدم في تنظيف MEAs
لوحات زراعة الأنسجة, 35 مم StemCell Technologies27150
ألواح زراعة الأنسجة ، 90 ممFrilabo900095
محلول Trypan Blue (0.4٪)  سيجما ألدريتشT8154
التربسين (1:250)ثيرمو فيشر 27250018
الفينيل الشريط 4713MB40071909
) ، 50 مل ، طرف

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
  2. Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
  3. Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2014).
  4. Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
  5. Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
  6. Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181(2013).
  7. Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
  8. Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
  9. Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
  10. Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
  11. Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
  12. Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514(2015).
  13. Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868(2017).
  14. Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
  15. Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
  16. Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
  17. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
  18. van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
  19. Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11(2006).
  20. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  21. Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DevicesMicroelectrode ArraysNeuronal CommunicationAxonal Signal PropagationCompartmentalized CultureSpike PropagationPropagation VelocityConduction FailureFiring RateAnterograde Spikes

Related Articles