مقالة منهجية

استغلال التصوير الحي إلى نويات المسار خلال ميوبلاست التمايز والانصهار

7.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58888

⸱

أبريل 13, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chromatin Dynamics Unit, Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University, 3Department of Electronics, Information and Bioengineering, Politecnico di Milano

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الهيكل العظمى والعضلات والتفريق هو عملية ديناميكية للغاية، التي تعتمد خاصة على المواقع النووية. وهنا يصف لنا طريقة لتعقب تحركات الأنوية بتصوير الخلية الحية أثناء تشكيل التمايز وميوتوبي ميوبلاست والقيام بوصف كمي لديناميات الأنوية باستخراج المعلومات من التعقب التلقائي.

الملخص

المواقع النووية داخل الخلايا مهم للعمليات الخلوية متعددة في مجال التنمية والتجدد. المثال الأكثر إثارة للاهتمام لتحديد المواقع النووية يحدث أثناء تمايز الهيكل العظمى والعضلات. ألياف العضلات (ميوفيبيرس) هي خلايا مولتينوكليتيد التي شكلتها انصهار خلايا السلائف العضلات (myoblasts) المستمدة من الخلايا الجذعية العضلية (خلايا الأقمار الصناعية) التي يخضع لها الانتشار والتفرقة. المواقع النووية الصحيح داخل ميوفيبيرس مطلوب من أجل تجديد العضلات السليمة والدالة. إجراءات مشتركة لتقييم تشكيل التمايز وميوفيبير ميوبلاست يعتمد على الخلايا الثابتة تحليلها بواسطة الفلورة، مما يعوق دراسة سلوك الحركة وخلية نووية على مر الزمن. هنا، نحن تصف أسلوباً لتحليل تشكيل التمايز وميوفيبير وميوبلاست بتصوير الخلايا الحية. نحن نقدم برنامج لتعقب النووي الآلي للحصول على وصف كمي الفائق ديناميات النووية والسلوك ميوبلاست (أي المسار) خلال التمايز والانصهار.

المقدمة

الهيكل العظمى والعضلات من الأنسجة أكبر في الجسم البشري، وبلغ مجموعها 35-40 ٪ من كتلة الجسم1. الخلايا الأقمار الصناعية هي الخلايا الجذعية العضلية، تشريحيا تتميز بموقفهم (محاذياً لغشاء البلازما، تحت الصفيحة القاعدية لألياف العضلات)، التي تؤدي إلى تكاثر myoblasts (الخلايا السلف شذوذ)، وفي نهاية المطاف يفرق ودمج ميوفيبيرس القائمة و/أو الصمامات بشكل جديد ميوفيبيرس2،،من34. اكتشافهم والتقدم المحرز في دراسة تلك الأحياء أدى إلى أفكاراً هامة في تنمية العضلات والتجدد.

بروتوكولات لعزل وتفرق ميوبلاستس في ميوتوبيس قد وضعت منذ سنوات عديدة وتستخدم على نطاق واسع لدراسة الهيكل العظمى والعضلات التمايز5،،من67. بيد أن معظم هذه الطرق تمثل الإجراءات الثابتة التي تعتمد على تحليل الخلايا الثابتة، ونتيجة لذلك، عدم السماح للعلماء بالكامل استكشاف عمليات ديناميكية للغاية، مثل ميوبلاست الانصهار والنضج ميوفيبير. المثال الأكثر إثارة للدهشة هو تحديد المواقع النووية، التي محكم التنظيم، مع الأنوية في البداية في مركز ميوفيبير، وثم، تقع في المحيط بعد نضوج ميوفيبير8،9. تصوير الحية هو الأسلوب الأكثر ملاءمة الحصول على المزيد من الأفكار في هذه ظاهرة غريبة.

هنا، يمكننا وصف أسلوب يتيح للعلماء لتسجيل تشكيل التمايز وميوتوبي ميوبلاست بالوقت الفاصل بين الفحص المجهري وإجراء تحليلات كمية من التعقب التلقائي لنواة ميوبلاست. يوفر هذا الأسلوب الفائق وصف كمية للسلوك وديناميات وميوبلاست النووية خلال التمايز والانصهار. البروتوكول وينقسم إلى أربعة أجزاء مختلفة، وهي: (1) جمع عضلات من هيندليمبس الفئران، (2) عزل myoblasts الأولية التي تتكون في الهضم الميكانيكي والانزيميه، وانتشار (3) ميوبلاست والتفريق (4) ويعيش التصوير لتعقب الأنوية داخل ح 16 الأولى من التمايز ميوبلاست.

في الإجراء التالي، وتعزل من الفئران H2B-التجارة والنقل ميوبلاستس وتعامل مع 1 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين للحث على التعبير H2B-التجارة والنقل، كما هو موضح سابقا10. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن لعزل ميوبلاستس من الفئران المحورة وراثيا الأخرى التي تعبر عن بروتين فلوري في النواة أو ترانسفيكت الخلايا المعزولة من الفئران البرية من نوع للتعبير عن بروتين فلوري في النواة، كما هو موضح بيمنتل et al. 9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بموافقة جميع الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان في سان رافائيل رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.

1-تشريح العضلات اللكتات الماوس

  1. تعقيم الملقط ومقص (مستقيمة ومنحنية) بالتعقيم.
  2. إعداد وتصفية جميع وسائل الإعلام (حظر المتوسطة، متوسطة الهضم، تنتشر المتوسطة، والتفريق بين المتوسطة) (0.22 ميكرومتر) قبل بدء التجربة (انظر الجدول للمواد).
  3. ضع 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) في 35 مم طبق بيتري لمجموعة العضلات.
  4. التضحية الماوس بخلع عنق الرحم أو بواسطة استخدام CO2 وتعقيم الجلد مع الإيثانول. إزالة الجلد من هيندليمبس واطرافهم العليا باستخدام مقص وملاقط، تيسيرا لعزل العضلات.
    ملاحظة: يمكن العضلات معزولة من الفئران حديثي الولادة أو للبالغين. الفئران حديثي الولادة بزيادة عدد الخلايا الأقمار الصناعية مقارنة بالفئران الكبار. العدد الإجمالي للخلايا الأقمار الصناعية التي يمكن أن تكون معزولة عن ماوس الكبار واحدة غير كافية لإجراء التجربة المبينة أدناه.
  5. عزل الظنبوبي، سولاس، باسطة أصابع طويلة (مؤسسة كهرباء لبنان)، والساق، والفخذ، وثلاثية الرؤوس، ووضعها في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني. ترك الطبق على الجليد. بعناية إزالة الأوتار والدهون مع مقص معقم وملاقط.

2-عزل ميوبلاستس الابتدائي

ملاحظة: تتم جميع الإجراءات المتعلقة بزراعة الخلايا في ظروف معقمة.

  1. إزالة العضلات من برنامج تلفزيوني. قص وفرم العضلات، باستخدام مقص منحنى العقيمة، حتى يتم الحصول على كتلة موحدة. وضع القطع العضلات في أنبوب 50 مل.
  2. إضافة 10 مل متوسط الهضم إلى قطع العضلات واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت الانفعالات قوية (250 دقيقة-1) في حمام مائي، لهضم انزيماتيكالي العضلات.
  3. قم بإضافة 10 مل دولبيكو لتعديل المتوسطة النسر (دميم) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، الجلوتامين 1%، 1% البنسلين/ستربتوميسين والجنتاميسين 1% (حظر المتوسطة) لوقف عملية الهضم.
  4. الطرد المركزي في 40 س ز لمدة 5 دقائق وجمع المادة طافية في أنبوب 50 مل. حفظ بيليه على الجليد.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي، المادة طافية تحتوي على بعض الخلايا الأقمار الصناعية وخلايا الدم، وخلايا بطانية والليفية، بينما بيليه يحتوي على قطع من عسر الهضم العضلات والنسيج الضام. لزيادة عدد الخلايا المعزولة، يجب أن تخضع بيليه إلى اتخاذ خطوات إضافية الهضم كما هو موضح أدناه.
  5. الطرد المركزي المادة طافية على 650 x ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS. تبقى بيليه ريسوسبينديد على الجليد.
  6. كرر الخطوات من 2، 2 – 2.5 x 2 لبقية بيليه التي تم الحصول عليها في الخطوة 2، 4 وإضافة الكريات ريسوسبينديد في وقت لاحق إلى بيليه ريسوسبينديد الأولى يحافظ على الجليد.
  7. تمر الكريات ريسوسبينديد من خلال عامل تصفية 70 ميكرومتر، ومن ثم من خلال عامل تصفية 40 ميكرومتر. إضافة 15 مل دميم مع 10% FBS، وأجهزة الطرد المركزي في 650 x ز لمدة 5 دقائق.
  8. ريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء إلى استنزاف خلايا الدم الحمراء. تبني عليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 40 مل من برنامج تلفزيوني إيقاف تحلل لخلايا الدم الحمراء، والطرد المركزي في 650 x ز لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 5 مل دميم مع 10% FBS.
  9. كخطوة بريبلاتينج، لوحة الخلايا في 20 مل متوسط الانتشار في طبق بتري 150 مم غير مصقول. بعد 1 ساعة للاحتضان في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2)، جمع المتوسطة.
    ملاحظة: الليفية، إرفاق إلى اللوحة، ثم سيتم تجاهلها، بينما تبقى الخلايا الأقمار الصناعية في التعليق.
  10. كرر الخطوة 2.9 3 x، وفي آخر خطوة بريبلاتينج، وجمع المتوسطة التي تحتوي على الخلايا الأقمار الصناعية في التعليق.
  11. أجهزة الطرد المركزي في 650 x ز لمدة 5 دقائق.
  12. في حين يتم سينتريفوجينج الخلايا، معطف اثنان أطباق بيتري 150 مم مع الكولاجين (10 مل حل 0.1% في حمض الخليك 0.1 M). للقيام بذلك، وضع الكولاجين على اللوحة واحتضان لمدة 5 دقائق وإزالته. تسمح لوحة الجاف لمدة 30 دقيقة.
  13. تجاهل المادة طافية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.11 وريسوسبيند بيليه الخلية في 40 مل من انتشار المتوسطة (جدول المواد). لوحة الخلايا في أطباق بتري المغلفة بالكولاجين 150 مم اثنين (20 مل في الطبق) وإبقاء الخلايا في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، 5% O2) في انتشار المتوسطة لمدة 2-3 أيام مع 1 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين للحث على التعبير H2B-التجارة والنقل.
    ملاحظة: هذه الخطوة يتيح انتشار ميوبلاستس للحصول على عدد أكبر من الخلايا لفحوصات إضافية. يتم الحفاظ على كثافة الخلية منخفضة جداً لتجنب تفريق عفوية من ميوبلاستس إلى ميوتوبيس.

3-ميوبلاست فحوصات الانتشار والتمايز

ملاحظة: عند ارتفاع الكثافة ميوبلاست، تبدأ بعض الخلايا استطالة، وثم، من الضروري لانقسام الخلايا. وبصفة عامة، فمن الممكن لتقسيم الخلايا 2 x x-3 دون أن يؤثر ذلك على النمط الظاهري.

  1. تجاهل المتوسطة وتغسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، إضافة 2 مل التربسين (س 1)، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة خلية للحد الأدنى 5 الاختيار تحت المجهر و، عند فصل خلايا الجولة، إضافة 5 مل دميم مع 10% FBS لإلغاء تنشيط التربسين. حساب عدد الخلايا (عادة من الممكن الحصول على حوالي 1 × 106 خلايا/الماوس).
    ملاحظة: الاحتضان مع التربسين لمدة 5 دقائق يتم عادة ما يكفي لفصل myoblasts المتكاثرة.
  2. تخضع الخلايا لأحد الاختبارات الموصوفة أدناه.
    1. تحليل انتشار
      1. لوحة 50,000 الخلايا/جيدا في 1 مل/جيد من متوسط الانتشار في صفيحة 12-جيدا المغلفة بالكولاجين واحتضان خلايا مطلي حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2). إصلاح، وحساب عدد الخلايا في 24 أو 48 أو 72 ح.
        ملاحظة: يتم استبدال المتوسطة كل 48 ساعة لتجنب استنفاد المغذيات.
    2. تحليل التمايز
      1. معطف صفيحة 12-جيدا مع 350 ميليلتر من التمايز المتوسطة تحتوي على مصفوفة الغشاء (1: 100). احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإزالة المتوسطة.
      2. لوحة 200,000 الخلايا/بئر في الأجلين المتوسط والتمايز في لوحة المغلفة بالمصفوفة. احتضان الخلايا في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2، 5% O2) حتى أنها تلتزم باللوحة (ح 2 عموما ما يكفي للخلايا على الالتزام ويبدأ التمايز).
      3. لتقييم التمايز، نفذ تلطيخ للسلسلة الثقيلة الميوسين ونوى كما هو موضح سابقا11. وبدلاً من ذلك، إجراء تحليلات العيش-التصوير كما هو موضح أدناه.

4-لايف-تصوير ميوبلاست التمايز وتعقب النووي

  1. للخلية الحية التصوير ووضع الخلايا، والتي تم الحصول عليها في قسم 3.2.2 ومطلي في لوحة 12-حسنا، تحت مجهر [كنفوكل]، مجهزة بنظام لحضانة للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
  2. استخدم هدفا جافة 20 x (0.7 غ) للحصول على عرض للحقول مع مئات خلايا، ما يكفي لرصد تشكيل ميوفيبير. يمكن تصويرها الخلايا H2B-التجارة والنقل مع ليزر أرجون منخفضة كثافة 488 نانومتر.
    ملاحظة: ثقب مفتوحة يضمن أن عمق الصورة (~ 10 ميكرومتر) يحتوي على سمك الخلية حيث أن الخلايا التي يتم الاحتفاظ بها في التركيز طوال التجربة. استخدام مجهر [كنفوكل] مفيد حيث أنه يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء الصور، على الرغم من أن يمكن أيضا استخدام مجهر واسع المجال. تشكيل ميوفيبير يمكن رصدها من خلال قناة الإرسال.
  3. الحصول على الصور من 16-بت و 1,024 x 1,024 بكسل كل إطار كل دقيقة 6 ح 16. لكل موقف المكتسبة، إنشاء ملف multiframe.tif (راجع المثال في الملفات التكميلية).
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدمت البرمجيات التجارية المرتبطة بالمجهر (جدول المواد)؛ استخدام البرامج المناسبة لتحقيق نفس الهدف عند استخدام المجاهر الأخرى.
  4. تنزيل البرامج المتوفرة.zip ملف تكميلي.
    ملاحظة: هي الإجراءات البرامج النصية التي يجب تشغيلها في MATLAB. البرنامج تكييف البرامج المنشورة12 الأمثل لتتبع الأنوية أثناء تشكيل ميوتوبي. وينقسم هذا البرنامج إلى جزأين: الأول يحدد الأنوية في كل إطار بتجزئة لهم، بينما يولد ثانية واحدة "المسارات" (مسارات) حركة الأنوية. يتم توفير التعليمات البرمجية الكاملة لتجزئة النووية والتعقب ودليل خطوة بخطوة للشروع في العمل في الملفات التكميلية.
  5. استخراج ملف مضغوط وحفظه في مسار المطلوب على الكمبيوتر الشخصي (PC) باستخدام. تنفيذ كافة أدناه المقاطع على جهاز كمبيوتر مع البرامج الضرورية مثبتة بالفعل. لاحظ أن ملف.zip يتكون من ثلاثة مجلدات كما هو مذكور أدناه.
    ملاحظة: يتضمن إجراءات تجزئة المهام ليتم تشغيلها للتجزئة. بدلاً من ذلك، يتضمن إجراءات تتبع، والمهام المطلوبة للتتبع. ويقدم المثال تجزئة تتبع الملفات التعرف على النظام والبرامج النصية الأساسية،. البرمجيات المستخدمة لتجزئة وتتبع الأنوية يعمل بشكل صحيح في MATLAB، R2015a أو الإصدارات الأحدث.
  6. لتجزئة الأنوية من ملف.tif، اسم الملف، على سبيل المثال، NameFile.tif.
    1. افتح المجلد تتبع المثال تجزئة ، وانقر فوق DoSegmentation.m. سيؤدي هذا إلى فتح إطار الأوامر في MATLAB.
    2. تحقق من إطار المجلد الحالي على اليسار لمشاهدة كافة العناصر الموجودة في المجلد المثال تتبع تجزئة . انقر نقراً مزدوجاً فوق DoSegmentation.m.
      ملاحظة: يمكن الاطلاع على معلومات مفصلة بشأن التعديلات التي يتعين القيام به في البرنامج النصي في ملف StepbyStep.txt. وملزمة تعديل البرنامج النصي بحيث المتغير فيلينامينبوت NameFile.tif و فولديرينبوت هو المجلد حيث يرد ملف.tif.
    3. تشغيل البرنامج النصي (بواسطة النقر فوق على الأخضر زر تشغيل ). سيتم حفظ نتيجة للتجزئة file.mat (SegmentedNameFile.mat)، في حين يمكن تصور تجزئة الأنوية في الشكل الناتج.
      ملاحظة: يمكن تعديل المعلمات للتجزئة، المبينة في البرنامج النصي، إذا لزم الأمر. يمكن التحقق من نوعية التجزئة باستخدام البرنامج النصي CheckSegmentation.m (راجع الملف StepbyStep.txt). وبناء على ذلك، وإذا كانت جودة التجزئة الفقراء (فقط بضع أنوية الكشف)، ضبط معلمات التجزئة، بوضوح في البرنامج النصي DoSegmentation.m ، وكرر الإجراء.
  7. لإنشاء المسارات (أي مسارات كل من الأنوية في الوقت المناسب)، استخدام المواقع النووية التي تم الحصول عليها في التجزئة، تشغيل البرنامج النصي GenerateTracks.m في نفس مجلد العمل. تأكد من إضافة ملف تجزئة السليم كمدخل، التي تم الحصول عليها من قبل (انظر الملف StepbyStep.txt للحصول على مزيد من المعلومات).
    ملاحظة: كناتج، المستخدم سيتم الحصول على ملف TrackedNameFile.mat، مع مصفوفة لإحداثيات س ومصفوفة أخرى لإحداثيات ص من المسارات التي تم إنشاؤها.
  8. تقييم نوعية المسارات باستخدام CheckTracking.m (راجع الملف StepbyStep.txt للحصول على مزيد من المعلومات). استخدم الرقم الناتج من هذا المقطع الأخير للمساعدة في تصور كل موقف النوى في الوقت المناسب. تحقق من على الجانب الأيمن للصلبان الخضراء التي تشير إلى كل نواة مجزأة. لتحديد أحد نواة محددة، استخدم شريط التمرير السفلي. ملاحظة أن سوف يكون دائريا نواة المحدد باللون الأحمر، بينما على اليمين، مسار الخلية المحددة يمكن اتباعها في الوقت المناسب (باستخدام شريط التمرير العلوي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تلقائياً اتباع حركة النووية خلال التمايز ميوبلاست في تصوير حية، الأنوية ينبغي أن ترتبط بشكل تفضيلي يكون فلوريسسينتلي المسمى. من المهم ملاحظة أن استخدام جزيئات الحمض النووي إينتيركالاتينج ليس ممكناً لأن هذه الجزيئات تتداخل مع انتشار والتفريق بين myoblasts الابتدائية13. على سبيل مثال، قد تم تحليلها الانتشار والتمايز في الابتدائي myoblasts مثقف مع أو بدون هويشت (الشكل 1). من الواضح أن انتشار (الشكل 1 أ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ألياف العضلات (ميوفيبيرس) هي خلايا مولتينوكليتيد التي يتم تشكيلها من قبل دمج خلايا السلائف العضلات (myoblasts) المستمدة من الخلايا الجذعية العضلية (خلايا الأقمار الصناعية) التي يخضع لها الانتشار والتمايز2،3، 4. تقييم التمايز ميوبلاست، الإجراء المشترك الذي يتكون من استزراع myoblasts في التفريق بين المتوسطة وتحديد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة لأداء الفلورة تلطيخ ميك، علامة على التمايز، وتلطيخ من نوى مع الحمض النووي إينتيركالاتينج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل قبل فؤاد-الحفل الخيري إلى أ. ف. (#21545) ومنحة البذور المستشفى سان رافائيل (OSR) إلى S.Z. (ZAMBRA5X1000). الدكتور جان-إيف تينيفيز من "مركز تحليل الصورة" من معهد باستور المسلم لتقاسم علنا إجراءات MATLAB "تعقب بسيطة" له.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مستخلص أجنة الدجاجSeralabCE-650-J
كولاجينازSigmaC9263-1G125 وحدة / ملغ
كولاجين من جلد العجلSigmaC8919
DispaseGibco17105-0411.78 وحدة / ملغ
دوكسيسيكلينسيجماD1515
DMEMسيجماD5671
مصل الأبقار الجنينLife Technologies10270106
gentamicinSigmaG1397
مصل الحصانInvitrogen16050-098
HoechstLife Technologies33342
IMDMSigmaI3390
L-glutamineSigmaG7513
Matrigelكورنينج356231
البنسلين الستربتومايسينسيجماP0781
خلايا الدم الحمراء تحلل وسطBiolegend420301
وسط الهضم< / u>< / strong>
collagenase40 ملغ
dispase70 mg
PBS20 مل
مصفى 0.22um
وسيط مانع < / u >< / strong >
DMEM
مصل بقري للجنين10٪
L-glutamine1٪
بنسلين ستربتومايسين1٪
جنتاميسين1 & بيرميل;
مصفى 0.22um
<قوي >< u > وسط انتشار < / u >< / strong>
IMDM
مصل بقري الجنين20٪
L-glutamine1٪
بنسلين ستربتومايسين1٪
جنتاميسين1 & بيرميل;
مستخلص جنين تشيتشن3٪
مرشح 0.22um
< قوي >< > وسط التمايز < / u >< / قوي >
IMDM
مصل الحصان2٪
L-glutammine1٪
البنسلين ستربتومايسين1٪
جنتاميسين1 & بيرميل ؛
مستخلص جنين تشيتشن1٪
مفلتر 0.22um

المراجع

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
  3. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
  4. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
  5. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846(2014).
  6. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074(2013).
  7. Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047(2017).
  8. Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
  9. Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141(2017).
  10. Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
  11. Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
  12. Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100(2016).
  13. Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
  14. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  15. Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
  16. Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. , SIAM. (2009).
  17. Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
  18. Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
  19. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

H2BGFP

مقالات ذات صلة