يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

10.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58952

⸱

فبراير 12, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cellular Protein Chemistry, Utrecht University, 2Program in Cellular and Molecular Medicine, Boston Children's Hospital

في هذه المقالة

ملخص

هنا يمكننا وصف بروتوكول لأسلوب مطاردة نبض عامة يسمح تحليل الحركية قابلة للطي والنقل، وتدهور البروتينات الواجب اتباعها في الخلايا الحية.

الملخص

وصف تشيس نبض المشعة أداة قوية لدراسة نضوج كونفورماشونال، والنقل إلى مواقعها الخلوية الوظيفية، وتدهور البروتينات المستهدفة في الخلايا الحية. باستخدام أوقات قصيرة (نبض) راديولابيلينج (< 30 دقيقة) ورقابة مشددة من تشيس مرات، من الممكن تسمية سوى جزء صغير من تجمع مجموع البروتين واتبع الطي به. عندما جنبا إلى جنب مع نونريدوسينج/خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وإيمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة (تكيف محددة)، يمكن دراسة الطي العمليات بقدر كبير من التفصيل. وقد استخدم هذا النظام لتحليل قابلة للطي للبروتينات مع تباين كبير في خصائص مثل البروتينات القابلة للذوبان، البروتينات وحيدة ومتعددة تمرير transmembrane، N و O الغليكوزيلاتي البروتينات بشدة، والبروتينات مع أو بدون ثنائي كبريتيد واسعة النطاق الربط. أساليب مطاردة نبض هي أساس الدراسات الحركية إلى مجموعة من الميزات الإضافية، بما في ذلك شركة-والتعديلات بوستترانسلاشونال، أوليجوميريزيشن، والبلمره، أساسا يسمح تحليل البروتين من الولادة حتى الموت. دراسات نبض--تشيس في طي البروتين متكاملان مع أساليب أخرى البيوكيميائية والفيزيائية لدراسة البروتينات في المختبر بتقديم معلومات الفسيولوجية وزيادة الأزمنة. هي تكييف الأساليب كما هو موضح في هذه الورقة بسهولة لدراسة الطي تقريبا أي البروتين التي يمكن التعبير عنها في نظم الثدييات أو خلايا الحشرات.

المقدمة

طي البروتينات البسيطة نسبيا حتى ينطوي على العديد من الإنزيمات المختلفة قابلة للطي ومرافقين الجزيئية، والتعديلات التساهمية1. إعادة تشكيل كاملة لهذه العمليات في المختبر مستحيل عمليا، نظراً للعدد الهائل من المكونات المختلفة المعنية. ولذلك مرغوب فيه للغاية، دراسة البروتين قابلة للطي في فيفو، في الخلايا الحية. تقنيات تشيس نبض المشعة إثبات أداة قوية لدراسة التوليف، قابلة للطي، والنقل، وتحلل البروتينات في بيئتهم الطبيعية.

التمثيل الغذائي وسم البروتينات خلال نبضة قصيرة مع 35S المسمى الميثيونين/سيستين، متبوعاً بعملية مطاردة في غياب تسمية المشعة، يتيح تتبع محددة من سكان بروتينات المركبة حديثا في أوسع الوسط الخلوية. ثم البروتينات المستهدفة يمكن أن تكون معزولة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن وتحليلها عن طريق الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أو تقنيات أخرى. للعديد من البروتينات، ورحلتهم عبر الخلية تتميز بتعديلات مرئية في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. على سبيل المثال، غالباً ما يترافق نقل البروتينات الغليكوزيلاتي من هيولى (ER) إلى مجمع غولجي بإدخال تعديلات على جليكانس ن مرتبطة أو إضافة ربط س جليكانس2،3. هذه التعديلات يؤدي إلى زيادات كبيرة في الكتلة الجزيئية الواضحة، التي يمكن رؤية التغييرات التنقل في صفحة الحزب الديمقراطي الصربي. يمكن أيضا علامة النضج بالانقسامات proteolytic، مثل الانقسام وإشارة-الببتيد أو إزالة برو-الببتيدات، أسفر عن تغييرات في الكتلة الجزيئية الواضحة التي يمكن اتباعها بسهولة على جل الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة4. النشاط الإشعاعي بمزايا كبيرة على تقنيات قابلة للمقارنة مثل مطاردات سيكلوهيكسيميدي، حيث تمنع تخليق البروتين الرواية، كما العلاجات أطول سامة للخلايا، ولا تستبعد غالبية البروتينات كبار السن، الحالة المستقرة من التحليل، وبعض البروتينات بإنصاف أيام. مقارنة البروتينات تحت كل نونريدوسينج والحد من الظروف يسمح تحليل ثنائي كبريتيد تشكيل السندات، خطوة هامة في طي العديد من البروتينات الافرازية4،،من56، 7.

هنا يصف لنا طريقة عامة لتحليل طي البروتين والنقل في خلايا سليمة، باستخدام نهج مطاردة نبض مشعة. بينما نحن وتهدف إلى توفير الأسلوب مفصلة قدر الإمكان، البروتوكول تتمتع بإمكانيات لا حدود لها تقريبا للقدرة على التكيف وسوف تسمح الأمثل لدراسة البروتينات المحددة كل قارئ.

البروتوكولين تشيس نبض البديلة، تقدم للخلايا ملتصقة (الخطوة 1، 1 من البروتوكول المعروضة هنا) وآخر لتعليق الخلايا (الخطوة 1، 2 من البروتوكول المعروضة هنا). الشروط المقدمة هنا تكفي لتصور بروتين أعربت مع المستويات المتوسطة إلى العليا التعبير. إذا كان القارئ يعمل مع البروتينات أعرب سيئة أو مختلف الظروف بوستريتمينت، مثل إيمونوبريسيبيتيشنز متعددة، من الضروري زيادة حجم صحن أو الخلية عدد مناسب.

لوقف نبض تشيس، مطاردة العينات المأخوذة في كل مرة نقطة الجميع مأخوذة من أنبوب واحد من الخلايا. خطوات الغسيل بعد أن يتم حذف النبض؛ بدلاً من ذلك، كذلك إدماج 35S هو منع إضعاف مع فائض عالية من الميثيونين غير مسمى وسيستين.

استخدام البروتوكولات المقدمة المشعة 35S المسمى سيستين والميثيونين لمتابعة عمليات طي البروتين الخلوي. ينبغي إجراء جميع العمليات مع الكواشف الإشعاعية باستخدام تدابير الحماية المناسبة للتقليل إلى أدنى حد من أي تعرض للمشغل والبيئة للإشعاع المشعة وأداؤها في أحد مختبرات معينة. كالنبض-المطاردة وسم تقنية غير فعالة نسبيا في الأوقات نبض قصيرة (< 15 دقيقة)، وأقل من 1% مبلغ بداية النشاط الإشعاعي الذي أدرج في البروتينات المركبة حديثا. بعد إثراء البروتين المستهدفة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن، العينة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحتوي على أقل من 0.05 في المائة مبلغ بداية النشاط الإشعاعي.

على الرغم من أن استقرت الميثيونين 35S وسيستين وسم ميكس، سوف يحدث بعض التحلل، مما أسفر عن المركبات المشعة المتطايرة،. حماية الباحث والجهاز، ينبغي اتخاذ بعض الاحتياطات. الباحث دائماً أن تمتثل لقواعد السلامة الإشعاعية المحلية وقد ارتداء فحم التمريض القناع، إلى جانب معطف مختبر وقفازات (مزدوجة). يجب فتح قنينة الأسهم مع 35S الميثيونين وسيستين دائماً في غطاء دخان، أو تحت نقطة تطلعات محلية. بقع التلوث المختبرات المعروفة بأجهزة الطرد المركزي والماصات وأحواض المياه، وحاضنات والهزازات. يتم تقليل التلوث من هذه المناطق باستخدام ماصة نصائح مع عامل تصفية فحم، أنابيب ميكروسينتريفوجي ختم إيجابية (انظر الجدول للمواد)، وحوض الفحم الاسفنجيات في المياه والحمامات، الفحم تصفية ورقات ملتصقاً بأطباق نبض--تشيس، الفحم من الحرس في نظام الشفط، وإخضاع الأطباق التي تحتوي على الحبوب الفحم في الحاضنات وحاويات التخزين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

كانت تعالج جميع الكواشف الإشعاعية والإجراءات وفقا لجامعة أوترخت المحلية الإشعاع القواعد والأنظمة.

1-نبض تشيس

  1. نبض تشيس للخلايا ملتصقة
    ملاحظة: وحدات التخزين نظراً لهنا تستند إلى 60 مم خلية ثقافة الأطباق. 35 ملم أو أطباق 100 مم، ضرب وحدات التخزين قبل 1/2 أو 2، على التوالي. هذا البروتوكول يستخدم وقت نبض مرات 10 دقيقة ومطاردة من 0, 15 و 30، 60، 120 و 240 دقيقة. وهذه يمكن أن تختلف تبعاً للبروتينات المحددة قيد الدراسة (مناقشته أدناه).
    1. بذور الخلايا ملتصقة (مثلاً، شو HEK 293، هيلا،) في خلية 60 ملم الست ثقافة الأطباق حيث أن تكون سوبكونفلوينت (80%-90%) في اليوم لمطاردة النبض. استخدام صحن واحد على الأقل كل نقطة الوقت و/أو شرط.
    2. إذا لزم الأمر، ترانسفيكت الخلايا مع الكواشف المتوفرة تجارياً تعداء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة؛ أو فيروسي ترانسدوسي8 الخلايا يوم 1 قبل النبض-المطاردة التجربة مع بنية مناسبة للتعبير.
    3. غسل الأطباق مع 2 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (هانك لموازنة الحل الملح [حبس])، وإضافة 2 مل من المجاعة المتوسطة (العادي الثقافة المتوسطة تفتقر إلى الميثيونين وسيستين ومصل الدم البقري الجنين [FBS]، مثل الحد الأدنى المتوسطة الأساسية [MEM] دون الميثيونين وسيستين ولكن مع 10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.4)، ووضع الأطباق في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    4. نقل الأطباق على الرفوف في حمام مائي بريوارميد 37 درجة مئوية حيث أن أنهم على اتصال مع المياه ولكن لا تطفو. بدء تشغيل جهاز ضبط وقت.
    5. في 40 ق، نضح المتوسطة التجويع، بوضع 600 ميليلتر الحل النبض (وسائط المجاعة + صحن µCi/35 ملم 55 التسمية، راجع الملاحظة السابقة خطوة 1.1.1) إلى الماصة، وإضافته بلطف إلى مركز الطبق في الضبط 1 دقيقة تكرار هذه الخطوة في فواصل زمنية 1 دقيقة ل t أنه الأطباق المتبقية. بدء تشغيل مع العينة تشيس أطول لتوفير الوقت من خلال التجربة.
      ملاحظة: عند التعامل مع المواد المشعة، من الضروري اتباع الاحتياطات المناسبة والقواعد المحلية لمنع التعرض العرضي و/أو التلوث.
    6. في 11 دقيقة بالضبط وجميع الأطباق التالية، باستثناء العينة تشيس 0 دقيقة، إضافة 2 مل من تشيس المتوسطة مباشرة إلى الطبق ونضح أنه ومرة أخرى، أضف 2 مل من تشيس المتوسطة. كرر هذه الخطوة عند فواصل زمنية 1 دقيقة للاطباق المتبقية. نقل جميع الأطباق إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
    7. في 16 دقيقة بالضبط، إضافة 2 مل من تشيس المتوسطة (العادي الثقافة المتوسطة + 10 مم حبيس [الأس الهيدروجيني 7.4]، سيستين 5 مم، والميثيونين 5 مم) مباشرة إلى الطبق عينة 0 دقيقة فوق المتوسط النبض إلى التوقف عن وضع العلامات؛ ثم نضح فورا ونقل الطبق إلى صفيحة ألومنيوم المبردة، وإضافة 2 مل من المخزن المؤقت إيقاف المثلج (حبس + 20 مم ن-اثيلماليميدي [NEM]).
      ملاحظة: هذا هو عينة تشيس 0 دقيقة. لهذه العينة، المضي قدما إلى الخطوة 1.1.9 مباشرة.
    8. نقل كل طبق مطاردة مرة أخرى إلى حوض ماء 2 دقيقة قبل كل مرة تشيس (مثلاً، 24 دقيقة لمطاردة 15 دقيقة)، وفي الوقت الدقيق تشيس (مثلاً، 26 دقيقة لمطاردة 15 دقيقة)، نضح مطاردة وسائل الإعلام (أو تحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي إذا أثر العلاقات العامة إفراز أوتين) ونقل الطبق إلى صفيحة ألومنيوم المبردة. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت إيقاف المثلج.
    9. احتضان كل الأطباق على الجليد في المخزن المؤقت للتوقف لمدة دقيقة إيه فايف؛ ثم نضح الحل وقف وغسله مع 2 مل من محلول إيقاف المثلج. نضح الغسيل والاطباق مع 600 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (الفوسفات مخزنة المالحة [برنامج تلفزيوني] + المنظفات نونديناتورينج [انظر الجدول للمواد] مثبطات البروتياز + + 20 مم NEM). استخدام مكشطة خلية لضمان أن يتم تفكيك الأطباق كمياً.
    10. نقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة والطرد المركزي ل 10 دقيقة في 15,000-20,000 x ز و 4 درجة مئوية بيليه الأنوية.
  2. نبض تشيس لتعليق الخلايا
    ملاحظة: لضمان كفاءة وسم، ينبغي نابض الخلايا بتركيز 3 × 106 إلى 5 × 106 خلايا/مل، وينبغي أن تكون وحدات التخزين تشيس 4 × حجم النبض. في المثال التالي، نحن نابض 5 × 106 خلايا في حجم 1 مل لمدة 10 دقائق، وأن تسفر عن خمسة مطاردة الوقت نقطة (0، 15، 30 و 60 و 120 دقيقة) 1 مل، الذي يحتوي على 1 × 106 خلايا كل الوقت نقطة. جميع الحلول هي نفسها كما هو الحال في الفرع 1-1.
    1. ثقافة الخلايا تعليق (مثلاً، 3T3، جوركات) وفقا لبروتوكول منشورة سابقا9 حيث لا يوجد عدد كاف من الخلايا في وقت التجربة، على الأقل 1 × 106 خلايا كل مرة نقطة و/أو شرط.
    2. إذا لزم الأمر، ترانسفيكت الخلايا مع الكواشف المتوفرة تجارياً تعداء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، أو فيروسي ترانسدوسي8 الخلايا يوم 1 قبل النبض-المطاردة التجربة مع بنية مناسبة للتعبير.
    3. بيليه 5 × 106 خلايا كل شرط في أنبوب 50 مل لمدة 5 دقائق في 250 x g في درجة حرارة الغرفة، وغسلها x 1 مع 5 مل من وسائط الإعلام، والتجويع بيليه لهم مرة أخرى، وريسوسبيند لهم في 1 مل من المجاعة وسائط الإعلام.
    4. نقل الخلايا إلى حمام مائي 37 درجة مئوية، واحتضان هذه النسبة 10-25 دقيقة تحرض الأنابيب كل 10-15 دقيقة لمنع الخلايا من تسوية في الجزء السفلي.
    5. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت. 1 دقيقة بالضبط، إضافة µCi 275 (55 µCi/1 × 106 خلايا) من تسمية غير مخفف مباشرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا ودوامه لمزيج.
      ملاحظة: عند التعامل مع المواد المشعة، من الضروري اتباع الاحتياطات المناسبة والقواعد المحلية لمنع التعرض العرضي و/أو التلوث.
    6. في 11 دقيقة بالضبط، وقف وسم بإضافة 4 مل من مطاردة وسائل الإعلام. خلط العينة ونقل فورا 1 مل إلى أنبوب 15 مل على الجليد، والتي تحتوي على 9 مل من محلول إيقاف المثلج.
      ملاحظة: هذا هو عينة تشيس 0 دقيقة.
    7. كرر هذه الخطوات لكل نقطة الزمنية المتعاقبة. حالما يتم جمع جميع النقاط الزمنية، بيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية. نضح المتوسطة (أو تحويلها إلى أنبوب 15 مل جديدة إذا بعد إفراز البروتين). تغسل الخلايا مع 5 مل من محلول الإيقاف وبيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية.
    8. نضح الحل وقف وتماماً الخلايا مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل المثلج واحتضانها لهم لمدة 20 دقيقة على الجليد لضمان تحلل كامل. نقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنبوب وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 15,000-20,000 x ز عند 4 درجة مئوية بيليه الأنوية.

2-إيمونوبريسيبيتيشن

  1. الجمع بين الأضداد (انظر المناقشة) و 50 ميليلتر من حبات إيمونوبريسيبيتيشن (مثل البروتين A-سيفاروسي) (تعليق 10% [ت/ت] في المخزن المؤقت لتحلل + 0.25% ألبومين المصل البقري [جيش صرب البوسنة]) في ميكروسينتريفوجي أنبوب واحتضانها لهم عند 4 درجة مئوية ل ~ 30 دقيقة في شاكر.
  2. بيليه الخرز لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة ونضح المادة طافية. إضافة 200 ميليلتر من ليستي إلى الخليط حبة جسم واحتضان في 4 درجات مئوية في شاكر ح 1 أو رئيس-عبر رئيس إذا كان يتطلب إيمونوبريسيبيتيشن > ح 1.
  3. بيليه الخرز لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل إيمونوبريسيبيتيشن. ضع العينة في شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. بيليه الخرز كما هو موضح في الخطوة 2، 3 وتكرار الغسيل 1 x. ثم نضح المادة طافية وريسوسبيند الخرز في 20 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، الأس الهيدروجيني 6.8 (10 ملم تريس-HCl، يدتا 1 مم). الدوامة العينة.
  5. إضافة 20 ميليلتر من 2 × العازلة عينة دون الفلزي، الدوامة، الحرارة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية، ودوامه مرة أخرى.
    ملاحظة: إلا إذا كان إعداد عينات الحد، 2 ميليلتر من 500 مم DTT يضاف في هذه المرحلة. وبعد ذلك، انتقل إلى الخطوة 2.7.
  6. بيليه الخرز كما هو موضح في الخطوة 2، 3. نقل ميليلتر 19 من المادة طافية نونريدوسيد إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي طازجة التي تحتوي على 1 ميليلتر من 500 مم DTT، الطرد المركزي بعينه، ودوامه من قبل أنها تدفئة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية مرة أخرى.
  7. تدور أسفل العينة لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز؛ وهذا هو عينة مخفضة. بارد عليه وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة ميليلتر 1.1 م 1 NEM إلى انخفاض والعينة نونريدوسيد. دوامة وتدور أسفل العينات.

3-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة

  1. أولاً، تحديد المناسبة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة حل جل النسبة المئوية للبروتين للفائدة. على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp120، عندما يعمل في كاتشين ~ 60 ديجليكوسيلاتيد، ويتم تحليلها في جل 7.5 في المائة.
  2. إعداد الخليط جل حل دون تيميد وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (x % الاكريلاميد، 375 مم تريس-HCl [الأس الهيدروجيني 8.8،] [w/v]، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% و 0.05% فوق كبريتات الأمونيوم [الجزائرية] [w/v]) وديغا تحت الفراغ > 15 دقيقة. بينما هو جليحه الخليط هلام، دقة تنظيف ألواح الزجاج هلام مع الإيثانول 70% وأنسجة خالية من الوبر ووضعها في جهاز صب.
  3. إضافة تيميد إلى خليط جل حل (في تركيز نهائي من 0.005 في المائة [v/v]) ومزيج دقيق "الماصة؛" بين ألواح الزجاج، تاركاً مساحة سم ~1.5 لجل التراص. عناية تراكب الهلام مع منزوع ح2س أو الأيسوبروبانول وترك الأمر بلمرة.
  4. مرة واحدة قد بلمرة هلام حل، إعداد خليط جل التراص (الاكريلاميد 4%، 125 ملم تريس-HCl [الأس الهيدروجيني 6.8]، [w/v]، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% و 0.025% APS [w/v]).
  5. مسح الجزء العلوي من جل حل مع منزوع ح2س، وبعد ذلك، إزالة جميع المياه.
    ملاحظة: استخدام ورق الترشيح لإزالة قطرات الماضي.
  6. إضافة تيميد إلى خليط جل التراص (0.005 في المائة [v/v])، ومزيج دقيق، وتراكب هلام حل مع التراص هلام وإدراج مشط 15-جيدا. مرة واحدة وقد بلمرة هلام التراص، أنه نقل إلى دائرة تشغيل وملء الدوائر العليا والسفلي مع تشغيل المخزن المؤقت (25 مم تريس-HCl و 192 مم جليكاين [الأس الهيدروجيني 8.3] 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي [w/v]).
  7. تحميل 10 ميكروليتر من عينة كل حارة في مينيجيل 15-لين. تجنب تحميل العينات في المرحلة الأولى ولين الأخير على الجل وتحميل المخزن المؤقت الذي عينة نونريدوسينج في جميع الممرات الفارغة لمنع يبتسم العصابات. تشغيل المواد الهلامية في ثابت mA 25/هلام حتى الصبغ والجبهة في الجزء السفلي من الجل.
  8. إزالة المواد الهلامية من ألواح الزجاج، وصمة عار الهلام مع الحل تلطيخ البروتين (10% حمض الاستيك والميثانول 30% في ح2س + 0.25% الرائعة الأزرق R250 [w/v]) لمدة 5 دقائق مع الانفعالات، وثم، ديستين لمدة 30 دقيقة مع ديستينينج الحل (تلطيخ الحل دون الرائعة R250 الأزرق).
  9. ترتيب المواد الهلامية الوجه للأسفل على بلاستيك التفاف، ومن ثم، ضع 0.4 مم كروماتوغرافيا الورق فوقهم. وضع هلام ساندويتش اللوني للورق-الجانب الأسفل على هلام مجفف. بناء على تعليمات الشركة المصنعة، الجاف للمواد الهلامية ح 2 عند 80 درجة مئوية.
  10. نقل المواد الهلامية المجففة إلى كاسيت وتراكب لهم مع شاشة السينما أو الفوسفور أوتوراديوجرافي. في حالة استخدام الفيلم autoradiography، يجب إجراء هذه الخطوة في غرفة مظلمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد في الشكل 2قابلة للطي وإفراز gp120 فيروس نقص المناعة البشرية-1 من تشيس نبض ملتصقة. هلام نونريدوسينج (NR الخلايا في الشكل) يبين طي عنصر مؤكسد من gp120. فورا بعد النبض وسم من gp120 5 دقيقة (0 دقيقة تشيس) يظهر كعصابة منتشر في الهلام أعلى، وكما تقدم تشيس، ترحيل الفرقة أسفل الجل عن طريق موزع أكثر قابلة للطي وسيطة (IT) حتى يتراكم على نطاق ضيق (NT) وهذا يمثل gp120 مطوية أصلاً. وهذا يحدث كما يزيد تشكيل روابط ثنائي كبريتيد اﻻكتناز البروتين، مما أدى إلى ترحيل أسرع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أساليب مطاردة نبض كانت ضرورية لتطوير فهم العلماء من البروتين قابلة للطي في خلايا سليمة. في حين أننا حاولنا أن توفر طريقة عامة قدر الإمكان، هذا النهج ينطوي على إمكانية للاختلافات لا حدود لها تقريبا لدراسة مختلف العمليات التي تحدث خلال قابلة للطي، النقل، والحياة للبروتينات داخل الخلية.

عند القيام بعملية مطاردة نبض باستخدام خلايا ملتصقة بالاطباق، من الضروري لعلاج كل طبق نفس قدر الإمكان، كطبق منفصل يستخدم لكل نقطة الوقت و/أو شرط في تجربة. خاصة بالنسبة لمرات النبض ومطاردة قصيرة (< 5 دقيقة)، فمن الض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

الكتاب أشكر جميع أعضاء المختبر براكمان، في الماضي والحاضر، للمناقشات المثمرة وتساعد في تطوير الأساليب التي عرضت في هذا المقال. هذا المشروع قد تلقي تمويلاً من "مجلس البحوث الأوروبية" ضمن الاتحاد الأوروبي "البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) N ° 235649 وفي هولندا منظمة من العلمية البحوث (جمعية البحث العلمي الهولندية) تحت درجة N برنامج صدى 711.012.008.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الآمنةSarstedt72.706.400
حمض الخليكSigmaA6283حمض الخليك الجليدي
BAS تخزين شاشة الفوسفور 20x25 سمGE LifeSciences 28956475
Bromophenol BlueSigmaB8026درجة البيولوجيا الجزيئية
Carestream Biomax MR أفلامKodakZ350370-50EA
وسائط زراعة الخلاياالعادية المختلفةN / Aلخطوط خلوية محددة تستخدم
وسائط زراعة الخلية ، لا يوجد ميثيونين / سيستينمختلفN / Aنفس الوسائط مثل وسائط الثقافة العادية مثل DMEM / MEM / RPMI ، تفتقر إلى ورق ترشيح الميثيونين والفحم
السيستين Whatman1872047
ماصة مصفاة بالفحمالجزيئي المنتجات الحيوية5069B
فراغ الفحمWhatman67221001
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma112،553للرحلان الكهربائي
CysteineSigmaC7352درجة البيولوجيا الجزيئية ، اصنع مخزون 500 ملي مولار ، قم بتخزينه في -20 & nbsp ؛
Dithiothreitol (DTT)Sigma10197777001درجة البيولوجيا الجزيئية
EasyTag Express35S مزيج وضع العلامات على البروتينPerkin ElmerNEG772014MCتتوفر دفعات أخرى من الملصقات اعتمادا على الاستخدام
EDTASigmaE1644معدات تجفيف الهلام من درجة البيولوجيا الجزيئية
المختلفةN / A
GlycerolSigmaG5516علم الأحياء الجزيئي الصف
3 ورقة كروماتوغرافياGE علوم الحياة3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco24020117
Kimwipes مناديل مهمة حساسةVWR21905-026
MESSigma & nbsp;M3671درجة البيولوجيا الجزيئية
الميثانولسيجماMX0490   ؛
درجة البيولوجيا الجزيئية MethionineSigmaM5308، اصنع مخزونا 250 ملي مولار ، قم بتخزينها في -20
صب / تشغيل MinigelمختلفةN / A
NaClSigmaS7653درجة البيولوجيا الجزيئية
N-ethylmaleimideSigmaE3876درجة البيولوجيا الجزيئية ، اصنع مخزونا 1 مليون في 100٪ إيثانول ، قم بتخزينها في -20
PBSSigmaP5368درجة البيولوجيا الجزيئية
البروتين - A حبات التدفق السريعGE الرعاية الصحية17-5280-04
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)سيجماL3771درجة البيولوجيا الجزيئية
Triton X-100SigmaT8787درجة البيولوجيا الجزيئية
Trizma (Tris)SigmaT6066درجة البيولوجيا الجزيئية
درجة Typhoon IP جهاز تصوير الجزيئات الحيويةAmersham29187194
Unwire Test Tube Rack 20 مم للحمام المائيNalgene5970-0320PK
وسائط زراعة الخلايا نصائح واقي معدات قاعدة

المراجع

  1. Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
  2. Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
  3. Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
  4. Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067(2017).
  5. Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
  6. Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
  7. Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
  8. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).
  9. Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
  10. Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
  11. Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
  12. Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
  13. Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458(2010).
  14. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  15. Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
  16. Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SDS PAGE
تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.