التمييز من سبع مجموعات فرعية الخلايا المناعية قبل يومين-fluorochrome التدفق الخلوي

ملخص

نقدم هنا، بروتوكول سيتوميتريك تدفق لتحديد خلايا CD4⁺ و CD8⁺ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات في الدم المحيطي البشري باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط بدلاً من سبعة. مع هذا النهج، يمكن تسجيل خمس علامات إضافية على معظم تدفق سيتوميتيرس.

الملخص

خصائص الخلايا المناعية يعتمد بشدة على قياس التدفق متعدد الألوان لتحديد الفئات السكانية الفرعية استناداً إلى التعبير التفاضلية من علامات السطحية. يتطلب برنامج الإعداد للوحة متعددة الألوان الكلاسيكية الراقية الصكوك والأجسام المضادة المسماة مخصصة، وتصميم الدراسة المتأنية للتقليل من التداخل الطيفي. قمنا بتطوير إجراء تحليل مولتيباراميتريك تحديد السكان المناعة البشرية الرئيسية (CD4⁺ و CD8⁺ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات) في الدم عن طريق الجمع بين سبع علامات النسب باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط. استراتيجيتنا يستند إلى الملاحظة التي أعرب علامات النسب عن باستمرار في مزيج فريد من كل سكان الخلية. الجمع بين هذه المعلومات مع معايرة دقيقة للأجسام المضادة يسمح للمحققين بتسجيل خمس علامات إضافية، توسيع حدود معظم تدفق سيتوميتيرس الضوئية. وجها لوجه المقارنة أظهرت أن الغالبية العظمى من السكان الخلايا المناعية في الدم يمكن أن توصف بدقة قابلة للمقارنة بين أسلوب لدينا والكلاسيكية "نهج علامة فلوروتشرومي--واحدة واحدة"، على الرغم من أن هذا الأخير لا يزال أكثر دقة لتحديد السكان مثل NKT الخلايا والخلايا γδ تي. الجمع بين سبع علامات استخدام اثنين فلوروتشروميس يسمح لتحليل السكان الخلايا المناعية المعقدة والعينات السريرية على سيتوميتيرس تدفق fluorochrome معقولة 6-10، وحتى على الصكوك الحقل فلوروتشرومي 2-3 في المناطق ذات الموارد المحدودة. الأدوات الراقية يمكن أن تستفيد أيضا من هذا النهج باستخدام فلوروتشروميس الإضافية لتحقيق التدفق الخلوي تحليل أعمق. هذا النهج أيضا مناسبة لفحص العديد من السكان خلية في حالة العينات السريرية مع عدد محدود من الخلايا جيدا.

المقدمة

التدفق الخلوي هو أسلوب الذي استحدث لتحليل معلمات متعددة في جزيئات مفردة بمعدل عدة آلاف من الأحداث في كل ثانية¹. أمثلة للعينات التي تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي وتشمل، ولكن لا تقتصر على، خلايا، والخرز، والبكتيريا وحويصلات والكروموسومات. نظام فلويديك توجيه الجسيمات عند نقطة الاستجواب حيث يتقاطع كل الجسيمات طريقها مع ليزر واحد أو أكثر، وتسجل معلمات متعددة لمزيد من التحليل. تنتشر إلى الأمام والجانب، المتولدة عن تشتت ضوء الليزر نقية، تستخدم لتحديد السكان المستهدفين واسترداد المعلومات حول الحجم النسبي وتعقيد/تقسيمات داخلية من الجسيمات، على التوالي. يتم اشتقاق كافة المعلمات الأخرى، التي تستأثر بمعظم البيانات في تحليل تدفق سيتوميتريك، بتحقيقات المسمى فلوروتشرومي أن تعترف وربط أهداف محددة على الجسيمات ذات الاهتمام.

التدفق الخلوي أداة أساسية للدراسات المناعية تحديد وتوصيف السكان الخلية. تشريح تعقيد النظام المناعي، هي لوحات متعددة الألوان في تطور مستمر لتوسيع عدد العلامات المسجلة في نفس الوقت إيمونوفينوتيبينج العميق للخلية السكان¹. يؤدي هذا إلى وضع صكوك أكثر قدرة وفلوروتشروميس، مع سيتوميتيرس تدفق الراقية الأخيرة تتجاوز 20 الفلورية المعلمات. هذه النتائج في تصميم الدراسة معقدة بسبب التداخل الطيفي فلوروتشرومي وارتفاع التكاليف المرتبطة بجسم مخصص مشغلي الوسم والمهرة. في العديد من الحالات، يتم تقليل التعقيد والتكاليف باستخدام لوحات منفصلة لعلامات للسكان خلية مختلفة. هذا النهج، هو عرضه للخطأ ومع ذلك، ويقلل من المعلومات الموجودة في كل لوحة، ويمكن أن يكون صعباً لتطبيقه على عينات مع عدد محدود من الخلايا. وعلاوة على ذلك، تزايد عدد علامات يحول دون إيمونوفينوتيبينج العميق على الصكوك مع معلمات الفلورسنت أقل. أننا سبق أن وضعت بروتوكولا المصبوغة لتحديد السكان المناعة البشرية الرئيسية (CD4⁺ و CD8⁺ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات) في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) عن طريق الجمع بين سبع علامات النسب باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط بدلاً من السبعة المطلوبة باستخدام نهج (www.hcdm.org) "علامة فلوروتشرومي--واحدة واحدة" التقليدية^2،3. تقريرنا الأولى استكشاف والتحقق من صحة مفهوم الجمع بين علامات سبعة في اثنين فلوروتشروميس إيمونوفينوتيبينج العميق. في هذا التقرير، نقدم بروتوكول خطوة خطوة لعزل ووصمة عار خلايا الدم المحيطية، مع التركيز على الجانب العملي، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها خطوات لتحقيق تلطيخ ناجحة.

ويستند هذا البروتوكول على ملاحظة أن علامات النسب يكون تعبير ثابت على سطح الخلية، وأن كل السكان خلية مزيج حصري من علامات النسب. في ببمكس، والتعبير CD3 الخلايا المناعية تقسم إلى فئتين رئيسيتين هما: لمفاوية T CD3--الإيجابية والسلبية CD3 الخلايا. داخل الفريق الفرعي إيجابية CD3، خلايا CD4⁺، CD8⁺ ويمكن فصل الخلايا γδ تي استخدام الأجسام المضادة التي تستهدف فقط CD4، CD8 ومستقبلات γδ. بطريقة مماثلة، ضمن الفريق الفرعي CD3 السلبية، ب الخلايا والخلايا ناغورني-كاراباخ ووحيدات يمكن تعريفه بشكل فريد باستخدام الأجسام المضادة ضد CD19 و CD56 و CD14، على التوالي. في نهج واحد فلوروتشرومي ماركر واحد قياسية، مكافحة-CD3،-CD4،--، CD8-CD14،-يتم الكشف عن الأجسام γδ CD19-CD56 وتكر مع سبعة فلوروتشروميس مختلفة. لدينا نهج يجمع بين مكافحة-CD3-CD56 وأجسام γδ-تكر في أحد فلوروتشرومي (المسمى للراحة فلوروتشرومي A) ومكافحة-CD4،--، CD8-CD14-والأجسام المضادة CD19 في فلوروتشرومي مختلفة (فلوروتشرومي ب). وهذا ممكن عن طريق الجمع بين أضداد معايرة والتعبير مستضد التفاضلية. كلا CD4⁺ و CD8⁺ تي الخلايا إيجابية للأجسام المضادة-CD3 في فلوروتشرومي أ، ولكن يمكن فصلهم في فلوروتشرومي ب تحقيق الحد الأقصى من التعبير عن إشارة CD8 بينما تضع، مع معايرة مخصصة، إشارة CD4 بين CD8 و الخلايا النفي المزدوج إيجابية-CD4/CD8 CD3. الخلايا التائية γδ تعرب عن مستوى أعلى من CD3 CD4 و CD8، وذلك يمكن التعرف عليهم ك عالية CD3⁴. كذلك عزز هذه الإشارات بوصفها γδ خلايا تي في فلوروتشرومي أ مع أضداد γδ تكر المضادة، وبالتالي تحسين الفصل بين CD3 منخفضة تي الخلايا والخلايا عالية γδ تي CD3. يمكن تحديد الخلايا ب ك CD3^– في فلوروتشرومي أ و CD19⁺ في فلوروتشرومي ب لفصل CD3 السلبية ناغورني كاراباخ الخلايا من الخلايا باء، كمكافحة-CD3 جسم CD56 المضادة في فلوروتشرومي أ. وهذا ممكن لأنه أعرب عن CD56 في ناغورني كاراباخ الخلايا على مستوى أقل بكثير من CD3 على خلايا تي⁵. وأخيراً، يمكن تحديد وحيدات عبر مزيج من خصائص مبعثر جانب الأمام والتعبير عن CD14 في فلوروتشرومي ب

فكرة الجمع بين أربع علامات باستخدام فلوروتشروميس اثنين سعت بنجاح قبل^6،،من⁷⁸، وقد استخدمت في بروتوكول سريرية لتحديد السكان اللمفاوية الخبيثة⁹ . تقرير سابق أيضا ضم سبع علامات (مع خصوصية مختلفة من العلامات مما كنا في أعمالنا البروتوكول) باستخدام اثنين من فلوروتشروميس، ولكن هذا النهج يعتمد على العلامات المعقدة لكل جسم مع كمية متفاوتة من فلوروتشرومي¹⁰. هذا هو على النقيض لدينا أسلوب الذي يستخدم الأجسام المضادة المتاحة تجارياً ويمكن تكييفها لتكوين أداة ويمكن الاستفادة من الجيل الجديد من فلوروتشروميس البوليمر.

والهدف العام لهذه المنهجية توسيع حدود بصري لمعظم تدفق سيتوميتيرس تسمح بتسجيل خمس علامات إضافية لاستجواب السكان خلية معقدة. نتيجة لذلك، يمكن إجراء تحليل المناعية متقدمة في المتناول 6-10 fluorochrome تدفق سيتوميتيرس، والصكوك الحقل فلوروتشرومي 2-3 يمكن أن تحقق نتائج ملحوظة في المناطق ذات الموارد المحدودة. الأدوات الراقية يمكن أن تستفيد أيضا من هذا النهج باستخدام فلوروتشروميس إضافية لإنجاز التدفق الخلوي تحليل أعمق وإنشاء وحدات تدفق الألواح سيتوميتريك استهداف الأنساب عدة في الوقت نفسه¹¹. هذا يحتمل أن تقلل عدد اللوحات المستخدمة في وحدات إيمونوفينوتيبينج التدفق الخلوي، وخفض التكاليف، والأخطاء والتعامل مع الوقت. وهذا النهج أيضا جيد جداً مناسبة في حالة العينات السريرية مع عدد محدود من الخلايا.

البروتوكول

وافق "جونز هوبكنز مجلس المراجعة المؤسسية" تحت قانون المساءلة وقابلية التأمين الصحي جميع الدراسات للمواد البشرية. وكانت عينات المريض ومراقبة إزالة الألغام التي تم تحديدها. تم الحصول على ببمكس والدم من ضوابط صحية بالموافقة المستنيرة.

ملاحظة: هذا البروتوكول تم اختبارها على طازجة أو مجمدة معزولة خلايا الدم المحيطية والدم كله.

1-إعداد الخلية

1. عزل خلايا الدم طرفية (PBMC) من الدم كله
   1. سحب الدم في أنبوب أخضر-أعلى 10 مل تحتوي على الهيبارين الصوديوم. بعد أن كانت مليئة الأنبوب الدم، فورا عكس الأنبوبة عدة مرات لمنع تخثر الدم.
      ملاحظة: يمكن استخدام أنابيب تحتوي على تخثر الدم الأخرى مثل حمض الإيثيلين (يدتا) أو سترات الصوديوم مع نتائج مماثلة. إذا كان يتم تجميع كمية مختلفة من الدم، ينبغي تحجيم الخطوات التالية في البروتوكول تبعاً لذلك.
   2. نقل الدم مرسومة بعناية في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. تمييع الدم بمبلغ مساو من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
   3. إضافة 15 مل من الكثافة المتوسطة التدرج (مثلاً، فيكول) إلى الجزء السفلي من أنبوب 50 مل مخروطية الشكل الجديد وتراكب بعناية الدم المخفف على أعلى كثافة متوسطة متدرجة، تجنب أي خلط بين المتوسطة الكثافة المتدرجة والدم المخفف.
      ملاحظة: هذا خطوة حاسمة لفصل سليم بين ببمكس من الخلايا الحمراء.
   4. الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT)، مع لا الفرامل لتجنب تعطيل الواجهة.
   5. بعد الطرد المركزي، بعناية نضح الطبقة العليا باستخدام ماصة وتخلص منه، مع الاهتمام بعدم إزالة الخلايا عند نقطة الالتقاء بين المتوسط التدرج البلازما والكثافة، التي يتم فيها يقسم ببمكس. جمع العديد من الخلايا ممكن من الواجهة دون لمس بيليه الخلية الحمراء في أسفل الأنبوبة المخروطية 50 مل ونقل إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.
   6. إضافة برنامج تلفزيوني إحضار وحدة التخزين النهائي إلى 25 مل وعكس عدة مرات لخلط. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقيقة في الرايت مع الفرامل في إزالة أي تلوث كثافة متوسطة متدرجة من تعليق خلية.
   7. نضح المادة طافية دون القلق خلية بيليه بعناية. إضافة برنامج تلفزيوني إحضار وحدة التخزين النهائي إلى 25 مل وعكس عدة مرات لخلط. الطرد المركزي في x 200 غ لمدة 10 دقيقة في الرايت مع الفرامل إلى إزالة الصفائح الدموية.
   8. نضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. ريسوسبيند ببمكس في 1 مل أزيد الصوديوم PBS/0.1%. أزيد الصوديوم يقلل وضع حد أقصى، ذرف، استيعاب الأجسام المضادة، وزيادة خلية الإنعاش، ولكن يمكن أن يعوق سميته بقاء الخلية. ولهذا السبب، ينبغي تجنب أزيد الصوديوم في جميع الخطوات إذا كان سيتم استزراع الخلايا للتجارب اللاحقة. عزل الخلايا وتلطيخ دون أزيد الصوديوم أعطت نتائج مماثلة لتلطيخ المؤداة حضور أزيد الصوديوم.
      تنبيه: أزيد الصوديوم يمكن أن يسبب الموت التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. الاتصال قد يسبب حروق للجلد والعيون.
   9. تمييع الخلايا لعد بنقل 30 ميليلتر من ببمكس في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. قم بإضافة 120 ميليلتر من برنامج تلفزيوني و 150 ميليلتر تريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء (01:10 إضعاف الخلية). ريسوسبيند بعناية.
   10. نقل 10 ميليلتر هيموسيتوميتير، عد الخلايا تبعاً لذلك لعد تستخدم الدائرة وتحديد عدد الخلايا قادرة على البقاء. خلايا قابلة للحياة = عدد تريبان الأزرق الخلايا السلبية مجموع x 10 (معامل التخفيف المستخدمة في هذا البروتوكول) x 10⁴.
       ملاحظة: متوسط، 7-15 × 10⁶ من ببمكس ينبغي أن تجمع من 10 مل دم.
   11. ريسوسبيند الخلايا في 10 × 10⁶ لكل مل أزيد الصوديوم PBS/0.1%
       ملاحظة: ويمكن تجميد PBMC والمخزنة في النتروجين السائل لفترة ممتدة من الوقت. ومع ذلك، يمكن تغيير التعبير عن علامات مثل مستقبلات تشيموكيني بهذا الإجراء.
2. إعداد الخلايا من ببمك المجمدة
   ملاحظة: إجراءات التجميد مختلفة يمكن أن تؤثر على الانتعاش وبقاء الخلية¹². تم تجميد ببمكس لهذه التجارب وضعت خصيصا تجميد وسائل الإعلام أو مصل الدم البقري الجنين (FBS)/10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) مع نتائج مماثلة.
   تنبيه: [دمس] يمكن أن تكون خطرة قليلاً في حالة استنشاق (الرئة مهيجة)، الجلد الاتصال (مهيجة، بيرميتور)، للاتصال بالعين (مهيجة)، للابتلاع.
   1. إزالة PBMC المجمدة من النتروجين السائل ووضعه على الجليد. نقل كريوفيال من الجليد مباشرة إلى حمام الماء 37 درجة مئوية. الحفاظ كريوفيال على سطح الماء وهزه بلطف قارورة حتى تبقى بيليه جليد صغيرة. نقل كريوفيال مرة أخرى على الجليد.
   2. قم بإزالة أي ماء مع مسح رش إيثانول 70%. أضف 1 مل أزيد الصوديوم PBS/0.1% ببطء في 4 درجات مئوية وعناية بنقل الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة أزيد الصوديوم PBS/0.1% الباردة ببطء في 4 درجات مئوية للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 15 مل.
   3. بعناية إزالة أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 10 ريسوسبيند طافية، الخلايا في 1 مل أزيد الصوديوم PBS/0.1%.
      ملاحظة: يمكن أيضا أن يكون حراكه الخلايا في ربمي 10% FBS مع نتائج مماثلة.
   4. تمييع الخلية لعد بنقل 30 ميليلتر من ببمكس في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. قم بإضافة 120 ميليلتر من برنامج تلفزيوني و 150 ميليلتر تريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء (01:10 إضعاف الخلية). ريسوسبيند بعناية.
   5. نقل 10 ميليلتر هيموسيتوميتير، عد الخلايا تبعاً لذلك لعد تستخدم الدائرة وتحديد عدد الخلايا قادرة على البقاء. خلايا قابلة للحياة = عدد تريبان الأزرق الخلايا السلبية مجموع x 10 (معامل التخفيف المستخدمة في هذا البروتوكول) x 10⁴.
   6. ريسوسبيند الخلايا في 10 × 10⁶ كل مل في أزيد الصوديوم PBS/0.1%.
3. إعداد الخلايا من الدم كله
   1. سحب الدم في أنبوب أخضر-أعلى 10 مل تحتوي على الهيبارين الصوديوم. بعد أن كانت مليئة الأنبوب الدم، فورا عكس الأنبوبة عدة مرات لمنع تخثر الدم.
      ملاحظة: الأنابيب التي تحتوي على تخثر الدم الأخرى مثل يدتا أو سترات الصوديوم يمكن استخدامها مع نتائج مماثلة. إذا كان يتم تجميع كمية مختلفة من الدم، ينبغي تحجيم الخطوات التالية في البروتوكول تبعاً لذلك.
   2. نقل 200 ميليلتر من الدم كله إلى أنبوب 12 مم × 75 مم توج، إضافة 2 ميليلتر من أزيد الصوديوم ودوامه بلطف ل 2 s.

2-خلية تلطيخ

ملاحظة: اختيار أزواج من فلوروتشروميس مع تداخل تقريبا لا الطيفية مهم للحد من انتشار البيانات بسبب انتشار عالية من فلوروتشرومي في الجهاز فلوروتشرومي الأخرى. تحقيق تحديد أمثل لشركة فرعية الخلية، ينبغي استخدام فلوروتشروميس مع عائد كم عالية مثل جسم أزواج PE BV421 و PE-آسيا والمحيط الهادئ.

1. تلوين من ببمك الطازجة والمجمدة
   1. نقل 100 ميليلتر من ببمك (1 × 10⁶ خلايا) إلى لوحة الخامس-أسفل 96-جيدا.
      ملاحظة: يمكن استخدام أي عدد من الخلايا أقل من 1 × 10⁶ مع نتائج مماثلة².
   2. الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 3 دقائق على RT ونضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. إضافة إلى كل ميليلتر 100 جيدا لبرنامج تلفزيوني يتضمن صبغة العيش الميت يمكن حلها أن يتجاوب مع أمين مجاناً على البروتينات لمدة 10 دقائق لتسمية الخلايا الميتة.
   3. التحضير لكل عينة 30 ميليلتر من مزيج يحتوي على جميع الأجسام المضادة (مكافحة-CD3--CD56، TCRγδ في فلورتشرومي أ، ومكافحة خلايا CD4، CD8، CD19، CD14 في فلورتشرومي ب). يتم الإشارة إلى تركيز الأجسام المضادة في جدول 1 و جدول 2. في هذه المرحلة، يمكن كذلك إضافة معاير الأجسام المضادة ضد الجزيئات المستهدفة المختلفة وفي فلوروتشروميس مختلفة (على سبيل المثال، الجدول 3).
      ملاحظة: تركيز الأجسام المضادة يمكن أن تختلف تبعاً للشركة المصنعة ورقم الشحنة. ولذلك، ينبغي أن الاختبارات الأولية لتحقيق الإشارات الأمثل. واستخدمت برنامج تلفزيوني، PBS/0.5% جيش صرب البوسنة، PBS/0.2% أزيد الصوديوم أو أزيد الصوديوم PBS/0.5% BSA/0.1% مع نتائج مماثلة لتمييع الأجسام المضادة². يمكن أيضا أن تكون الملون الخلية بأحجام مختلفة من 30 ميليلتر لدمج هذه المنهجية للقائمة بالفعل بسهولة تلطيخ البروتوكولات.
   4. الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 3 دقائق على RT ونضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. إضافة كوكتيل الأجسام المضادة لكل بئر وريسوسبيند بعناية دون توليد الفقاعات. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
      ملاحظة: فمن الممكن وصمة عار العينات من 4 درجة مئوية مع نتائج مماثلة.
   5. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت المصبوغة وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 3 دقائق على RT ونضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. ريسوسبيند الخلايا في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، والحصول على البيانات المتعلقة سيتوميتير تدفق. إذا تم تغيير حجم المصبوغة، الرجاء التأكد على الأقل تمييع برنامج ميكس جسم تستخدم لغسل الفائض من الأجسام المضادة.
      ملاحظة: يمكن الثابتة مع بارافورمالدهيد PBS/2% الخلايا الملون، ويوضع في ثلاجة عند درجة 4 مئوية بين عشية وضحاها وثم حصلت على سيتوميتير تدفق في اليوم التالي.
      تنبيه: بارافورمالدهيد ضار إذا ابتلع ويمكن أن يسبب تهيج الجلد
2. بقع من الدم كله
   1. لكل أنبوبة 12 مم × 75 مم توج، إضافة مزيج من الأجسام المضادة (مكافحة-CD3.-CD56، TCRγδ في فلوروتشرومي أ، ومكافحة خلايا CD4، CD8، CD19، CD14 في فلوروتشرومي ب) واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. وترد في الجدول 4تركيز الأجسام المضادة. في هذه المرحلة، معاير الأجسام المضادة ضد الجزيئات المستهدفة المختلفة ويمكن إضافة كذلك في فلوروتشروميس مختلفة. تركيز الأجسام المضادة يمكن أن تختلف تبعاً للشركة المصنعة ورقم الشحنة. ولذلك، ينبغي أن الاختبارات الأولية لتحقيق الإشارات الأمثل.
      ملاحظة: فمن الممكن وصمة عار عينات في 4 درجات مئوية مع نتائج مماثلة.
   2. الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 3 دقائق على RT ونضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. جعل حلاً س 1 من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون الحل تحلل RT قبل الاستخدام.
   3. إضافة 2.0 مل 1 × العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء لكل أنبوبة وكاب جيدا وعكس عدة مرات لخلط. وتغطي بإحباط والسماح للجلوس لمدة 15 دقيقة.
   4. تدور إلى أسفل في 300 x ز للحد الأدنى 5 بعناية نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية.
   5. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، بيليه الخلية يجب أن يكون تلوين أبيض شاحب مما يدل تحلل خلايا الدم الحمراء ناجحة. نضح المادة طافية عدم الإزعاج بيليه الخلية بعناية ولطف ريسوسبيند الخلايا في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
   6. سلالة الخلايا عن طريق أنابيب 12 مم × 75 مم مع 40 ميكرومتر تصفية قبعات إزالة الركام الخلية والحصول على البيانات المتعلقة سيتوميتير تدفق.

3-أضداد معايرة

ملاحظة: معايرة الأجسام المضادة هو الخطوة الأكثر أهمية للحصول على بيانات عالية الجودة، واستنساخه. معايرة لمكافحة--CD3-CD8،-γδ CD14-CD19 وتكر-يتبع الإجراء القياسي الذي يتم اشتقاق تركيز الأجسام المضادة لفصل قمم الإيجابية والسلبية على النحو الأمثل تلطيخ مؤشر^13،14كحد أقصى. ينبغي أن يكون تخفيف في ذروة أو أقرب إلى الذروة من ناحية ارتفاع منحنى مؤشر وصمة عار مختارة (الشكل 1 ألف-جيم). الأجسام المضادة-CD4 هو معاير لمكان ذروة السكان إيجابية بين السكان إيجابية واحدة CD3 و CD3 CD4 + CD8 + "تي" الخلايا، أقرب إلى إشارة إيجابية واحدة CD3 أفضل تميز سكان CD8dim (CD8 + الخلايا γδ تي وخلايا تي ناغورني-كاراباخ). وعلى نفس المنوال، خلايا CD56 المعايرة يهدف إلى وضع ناغورني كاراباخ CD56⁺ بين CD3⁺ و CD3 السكان^– .

1. الحد الأقصى من وصمة عار مؤشر منحنى
   ملاحظة: المعايرة لمكافحة--CD3-CD8،-γδ CD14-CD19 وتكر-يتبع الإجراء القياسي الذي يتم اشتقاق تركيز الأجسام المضادة لفصل قمم الإيجابية والسلبية على النحو الأمثل تلطيخ مؤشر منحنى¹⁵كحد أقصى. إذا تم إضافة أجسام مضادة ضد علامات أخرى للفريق، يحتاجون أيضا إلى أن تكون معاير مع منحنى مؤشر المصبوغة كحد أقصى.
   1. إعداد إضعاف إضعاف جسم بملء 10 آبار لصفيحة 96-جيدا مع 40 ميليلتر لتلطيخ المخزن المؤقت. في البئر الأولى وزيادة الحجم النهائي إلى 80 ميليلتر من المخزن المؤقت المصبوغة وإضافة الأجسام المضادة للاهتمام بتركيز 4 مرات تركيز اقترح من قبل الشركة المصنعة.
   2. مزيج جيد ونقل 40 ميليلتر في الثانية أيضا. يخلط جيدا وكرر هذه الخطوة لكل الأخرى الآبار.
   3. وصمة عار 10 عينات من ببمك أو الدم كله مع 30 ميليلتر لتخفيف إضعاف مختلفة 10 من الأجسام المضادة بعد البروتوكول وصف قبل.
   4. الحصول على البيانات مع سيتوميتير تدفق وارسم الإشارة من كل تمييع (الشكل 1A).
   5. بوابة على السكان السلبية والإيجابية لكل تركيز الأجسام المضادة. يمكن أن يؤدي إلى زيادة تركيز الأجسام المضادة على خلفية ارتفاع. ولذلك، تغيير حجم البوابة السلبية تبعاً لذلك.
   6. لكل تركيز الأجسام المضادة، استخراج معلومات حول المتوسط والانحراف المعياري لكثافة السكان السلبية الفلورسنت، والوسيط لكثافة السكان إيجابية فلورسنت. حساب لكل تركيز الأجسام المضادة في فهرس وصمة عار بهذه الصيغة: (متوسط كثافة السكان إيجابية الفلورسنت – متوسط كثافة السكان السلبية الفلورسنت) ÷ (الانحراف المعياري 2 x من شدة الفلورسنت سلبية السكان) (الشكل 1B).
   7. الأرض في مقابل مؤشر وصمة عار. تركيز الأجسام المضادة، كسر لتمييع جسم (مثلاً، 01:10 إضعاف = 0.1)، وتحديد تركيز الأجسام المضادة مع قيمة الفهرس وصمة عار كحد أقصى (الشكل 1).
2. معايرة الأجسام المضادة ومكافحة CD4-CD56
   ملاحظة: معايرة الأجسام المضادة-CD4--و CD56 يعتمد على المعايرة السابقة على علامات أخرى في الفريق الثاني-فلوروتشرومي. لجسم CD4 مكافحة المعايرة يهدف إلى وضع مكافحة-CD4 الإشارة بين CD8 مزدوجة⁺/CD3⁺ CD3 والإشارات واحدة إيجابية السكان (الشكل 1).
   1. تيتراتي CD4 المضادة والأجسام المضادة CD56 مع استراتيجية إضعاف إضعاف كما هو موضح من قبل، مشيراً إلى تركيزات إضافية بين دقة تحديد نطاق التركيز التي تسمح بفصل خلايا CD4⁺ تي الخلايا والخلايا ناغورني كاراباخ من خلية أخرى والسكان.
   2. تيتراتي الأجسام المضادة-CD4 بوضع إشارة CD4 المضادة بين CD8 مزدوجة⁺/CD3⁺ CD3 والإشارات واحدة إيجابية السكان (الشكل 1).
      ملاحظة: رعاية خاصة وينبغي أن يتم بوضوح فصل خلايا CD4 خلايا⁺ ر من CD8⁺ قاتمة والسكان.
   3. تيتراتي جسم CD56 مكافحة اتباع استراتيجية مماثلة للمعايرة الأضداد المضادة CD4، عن طريق وضع ناغورني كاراباخ الخلايا بين CD3--السلبية والسكان CD3--الإيجابية.

4-استراتيجية النابضة

1. تحديد الخلية اللمفاوية ومونوسيتيك من السكان وإزالة الخلايا الميتة ومعظم خلايا الدم الحمراء المتبقية من التحليل.
   1. حدد جميع السكان التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية ووحيدات استناداً إلى الأمام مقابل الجانب مبعثر منطقة (مقابل منتدى التعاون الأمني-أ SSC-أ). إزالة المجاميع الخلية من التحليل عن طريق عرض المبعثر إلى الأمام مقابل ارتفاع المبعثر إلى الأمام (مقابل منتدى التعاون الأمني-ح ث منتدى التعاون الأمني) والجانب مبعثر الارتفاع مقابل الجانب مبعثر العرض (مقابل SSC-ح ث ال SSC).
   2. استخدم علامة تمييز يعيش الميت لاستبعاد الخلايا الميتة إيجابية مشرقة وخلايا الدم الحمراء المتبقية من التحليل. بوابة على الخلايا الليمفاوية ووحيدات استناداً إلى موجز منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب-أ مختلفة.
2. اثنين-فلوروتشرومي 7-علامة استراتيجية النابضة السكان اللمفاوية.
   ملاحظة: داخل الفريق الفرعي إيجابية CD3، خلايا CD4⁺، CD8⁺ ويمكن فصل الخلايا γδ تي استخدام الأجسام المضادة التي تستهدف فقط CD4، CD8 ومستقبلات γδ. بطريقة مماثلة، ضمن الفريق الفرعي CD3 السلبية، ب الخلايا والخلايا ناغورني-كاراباخ ووحيدات يمكن تعريفه بشكل فريد باستخدام الأجسام المضادة ضد CD19 و CD56 و CD14، على التوالي.
   1. حدد البوابة اللمفاويات وخلق مؤامرة دوت مع على كل محور واحد من اثنين فلوروتشروميس المستخدمة في هذا البروتوكول (الشكل 2).
   2. بوابة CD8⁺ تي الخلايا المحددة ك CD3⁺/CD8⁺ مضاعفة الخلايا إيجابية في أعلى الزاوية اليمنى دوت-الأرض (الشكل 2). استبعاد السكان CD8 الخافتة التي قد تحتوي على خلايا NKT. بوابة على CD4⁺ تي الخلايا المحددة كالسكان ما بين CD8⁺ تي في CD3 وخلايا مفردة السكان إيجابية. بوابة على الخلايا التائية γδ اعتبرت عالية CD3 الخلايا. تقسيم الخلايا التائية γδ CD8 إيجابية وسلبية CD8.
   3. بوابة في ناغورني كاراباخ الخلايا المحددة كالسكان ما بين CD3--الإيجابية والسلبية CD3 الخلايا. تقسيم الخلايا ناغورني كاراباخ في CD8 إيجابية وسلبية CD8. بوابة ب الخلايا المحددة ك CD19 CD3--السلبية⁺ السكان في الزاوية السفلية اليمنى من الأرض نقطة.
   4. حدد غيتس الوحيدات وخلق مؤامرة دوت مع على كل محور واحد من اثنين فلوروتشروميس المستخدمة في هذا البروتوكول (الشكل 2). بوابة على CD3/CD14^–+ السكان.

النتائج

إعداد وتحليل تجربة التدفق الخلوي لخلايا الدم المحيطية الإنسان ملطخة بسبع نسب علامات (مكافحة-CD3،-CD4،-، CD8-CD14،-أضداد γδ CD19-CD56 وتكر) استخدام اثنين فقط تعرض فلوروتشروميس.

يتم وصف النتائج الممثل لمكافحة--CD8-ومعايرة أضداد CD56. لكل جسم (في هذا المثال، مكافحة-CD8)، وسجلت البيانات من عشرة تخفيف إضعاف المتعاقبة لحساب منحنى مؤشر وصمة عار (الشكل 1 ألف-جيم). تركيز الضد الأمثل تحددها وصمة عار أقصى مؤشر إشارة

المناقشة

وقد ثبت البروتوكول المعروضة هنا مرنة جداً وحساس للتغيرات في تلطيخ المخزن المؤقت، ودرجة الحرارة وإعداد خلايا الدم المحيطية بسبب التعبير ارتفاع نسب علامات على سطح الخلية. أن الخطوة الأكثر أهمية للحصول على بيانات عالية الجودة، واستنساخه من معايرة الأجسام المضادة. من المذكرة، حيث ينبغي دائماً إجراء المعايرة للأجسام المضادة أثناء برنامج الإعداد من لوحة سيتوميتريك التدفق، هذه الخطوة لا إضافة مقاعد البدلاء-الوقت الإضافي إلى نهجنا fluorochrome اثنين. معايرة لمكافحة--CD3-CD8،-γδ CD14-CD19 وتكر-يتبع الإجراء القياسي الذي يتم اشتقاق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
CD3	BD Biosciences	562426	الجسم المضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	جسم مضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences		331217 جسم مضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	الجسم المضاد للتلطيخ RRID< / strong>: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	الجسم المضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	جسم مضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	الجسم المضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	جسم مضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	جسم مضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	الجسم المضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_1089215
CCR7	Biolegend		353217 جسم مضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	جسم مضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	الجسم المضاد للتلوين RRID< / قوي>: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	جسم مضاد للتلوين RRID< / قوي>: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	الجسم المضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	الجسم المضاد للتلوين RRID< / strong>: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	جسم مضاد للتلوين RRID< / قوي>: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	جسم مضاد للتلوين RRID< / قوي>: AB_2744293
الخلايا الميتة	تقنيات الحياة	L-23105	حية / ميتة التمييز
Falcon 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين المستدير القاع مع غطاء مصفاة الخلية	Bioscience		352235 لتصفية تعليق الخلية قبل المرور على الرغم من مقياس التدفق الخلوي
Falcon 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين المستدير	BD Bioscience	352001	تلطيخ الدم الكامل
استعادة ثقافة الخلية تجميد متوسط	الصياد الحراري	12648010	خلايا
التجميد96 بئر V- أسفل لوحة	ثيرمو	فيشر 249570	لوحة لتلوين
FACSAria IIu فارز الخلية	BD Biosciences		مقياس التدفق الخلوي
FCS Express 6	De Novo Software		تحليل
FACS برنامج Graphpad Prism	GraphPad		البيانات