مقالة منهجية

استخدام المصفوفات الدقيقة لاستجواب الأثر البيئي الدقيق على الأنماط الظاهرية الخلوية في السرطان

DOI:

10.3791/58957

⸱

مايو 21, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغرض من الطريقة المعروضة هنا هو إظهار كيف يمكن تصنيع النُفَج ّة الدقيقة للبيئة الدقيقة (MEMA) واستخدامها لاستجواب تأثير آلاف البيئات الدقيقة المؤتلفة البسيطة على النمط الظاهري للخلايا المستزرعة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم تأثير البيئة الدقيقة على النمط الظاهري للخلايا مشكلة صعبة بسبب الخليط المعقد من كل من عوامل النمو القابلة للذوبان والبروتينات المرتبطة بالمصفوفة في البيئة الدقيقة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن الكواشف المتاحة بسهولة لنمذجة البيئات الدقيقة في المختبر تستخدم عادة خليطا معقدا من البروتينات التي يتم تعريفها بشكل غير كامل وتعاني من تقلب الدفعة إلى الدفعية. تسمح منصة microarray microenvironment (MEMA) بتقييم الآلاف من التركيبات البسيطة من بروتينات البيئة الدقيقة لتأثيرها على الأنماط الظاهرية الخلوية في اختبار واحد. يتم إعداد MEMAs في لوحات جيدا، والذي يسمح بإضافة الأربطة الفردية لفصل الآبار التي تحتوي على مصفوفة مصفوفة مصفوفة مصفوفة مصفوفة (ECM) البروتينات. مزيج من الرباط القابلة للذوبان مع كل ECM المطبوعة تشكل مزيجا فريدا من نوعه. يحتوي اختبار MEMA النموذجي على أكثر من 2500 بيئة صغيرة مؤتلفة فريدة من نوعها تتعرض لها الخلايا في اختبار واحد. كحالة اختبار، تم طلاء خط خلايا سرطان الثدي MCF7 على منصة MEMA. وقد حدد تحليل هذا التحليل العوامل التي تعزز وتعوق نمو وانتشار هذه الخلايا. منصة MEMA مرنة للغاية ويمكن تمديدها للاستخدام مع المسائل البيولوجية الأخرى خارج أبحاث السرطان.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبقى زراعة خطوط الخلايا السرطانية على البلاستيك في الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) واحدة من خيول العمل الرئيسية للباحثين عن السرطان. ومع ذلك، يتم الاعتراف بشكل متزايد البيئة الدقيقة لقدرتها على التأثير على الأنماط الظاهرية الخلوية. في السرطان، ومن المعروف أن البيئة الدقيقة الورم تؤثر على السلوكيات الخلوية متعددة، بما في ذلك النمو، والبقاء على قيد الحياة، والغزو، والاستجابة للعلاج1،2. عادة ما تفتقر ثقافات الخلايا أحادية الطبقة التقليدية إلى تأثيرات البيئة الدقيقة، مما أدى إلى تطوير تجارب ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) أكثر تعقيداً لزراعة الخلايا، بما في ذلك مستخلصات غشاء الطابق السفلي النقي المتاحة تجارياً. ومع ذلك، فإن هذه المصفوفات النقية عادة ما تكون معقدة للاستخدام وتعاني من مشاكل تقنية مثل تقلب الدفعة3 والتركيبات المعقدة3. ونتيجة لذلك، قد يكون من الصعب تعيين وظيفة لبروتينات محددة قد تؤثر على الأنماط الظاهرية الخلوية3.

لمعالجة هذه القيود، قمنا بتطوير تقنية microarray microenvironment (MEMA)، مما يقلل من البيئة الدقيقة وصولا ً إلى تركيبات بسيطة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) وبروتينات عامل النمو القابلة للذوبان4،5 . منصة MEMA تمكن من تحديد العوامل البيئية الصغرية المهيمنة التي تؤثر على سلوك الخلايا. باستخدام تنسيق صفيف، يمكن وضع حد لآلاف المجموعات من عوامل البيئة الدقيقة في تجربة واحدة. ال [مّا] يوصف هنا يستجوب ~2,500 مختلفة فريدة [ميكروفيول] شروط. البروتينات ECM المطبوعة في لوحات جيدا تشكل منصات النمو التي يمكن أن تكون المستزرعة الخلايا. يتم إضافة الأربطة القابلة للذوبان إلى الآبار الفردية، مما يخلق بيئات صغيرة مؤتلفة فريدة من نوعها (ECM + ligand) على كل بقعة مختلفة تتعرض لها الخلايا. يتم زراعة الخلايا لعدة أيام، ثم ثابتة، ملطخة، وصورة لتقييم الأنماط الظاهرية الخلوية نتيجة للتعرض لهذه تركيبات البيئة الدقيقة المحددة. وبما أن البيئات الدقيقة هي تركيبات بسيطة، فمن السهل تحديد البروتينات التي تدفع التغيرات الفينوتية الرئيسية في الخلايا. وقد استخدمت MEMAs بنجاح لتحديد العوامل التي تؤثر على الأنماط الظاهرية الخلويةالمتعددة، بما في ذلك تلك التي تدفع قرارات مصير الخلية والاستجابة للعلاج 4،5،6،7. ويمكن التحقق من صحة هذه الاستجابات في تجارب بسيطة 2D ومن ثم يمكن تقييمها في ظل ظروف أن يلخص بشكل أكمل تعقيد البيئة الدقيقة الورم. منصة MEMA قابلة للتكيف إلى حد كبير مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ونقاط النهاية، شريطة أن تتوفر علامات حيوية فينوتيبيك جيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: ويرد في الرسم التخطيطي للتدفق المبين في الشكل 1عرض عام للعملية MEMA بأكملها، بما في ذلك الوقت المقدر. هذا البروتوكول تفاصيل تصنيع MEMAs في لوحات 8-جيدا. قد يتم تكييف البروتوكول للوحات أو شرائح أخرى.

1. إعداد البروتين، ومخفف، وتلطيخ المخازن المؤقتة

  1. قارورة متساوية من ECMs، الأربطة، والسيتوكينات إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ولفترة وجيزة الطرد المركزي. إضافة وحدة التخزين المناسبة من المخزن المؤقت RT المناسبة كما هو موضح في ورقة بيانات المنتج. اتبع توصية الشركة المصنعة لتركيزات المخزون.
    ملاحظة: وترد في الجدول 1 والجدول 2قائمة كاملة بالأنابيب والآليات المالية الأوروبية بمخزونها وتركيزاتها النهائية. وعادة ما تستخدم كل من الأربطة وECMs في أعلى تركيز من النطاق الموصى به من قبل الشركة المصنعة التي تثير تأثير بيولوجي في معيار 2 يوم اختبارات الثقافة. التعامل مع البروتينات بلطف وفي خزانات السلامة البيولوجية تحت تدفق laminar لتجنب التلوث.
  2. احتضان قارورة مع هزاز لطيف في RT لمدة 1 ساعة. لا دوامة البروتينات لأن هذا يمكن أن يسبب لهم تشويه.
  3. البروتينات Aliquot للتخزين على المدى الطويل بحيث جميع aliquots هي استخدام واحد فقط لتجنب التدهور مع دورات التجميد / ذوبان المتكررة. تخزين البروتينات الليوفيلة في -80 درجة مئوية (ما لم ينص على خلاف ذلك) حتى الحاجة. الحرص على جمع جميع البيانات الوصفية للرجوع إليها في المستقبل، مثل: '1' اسم البروتين، '2' التاريخ المعد، '3' رقم اللوت/الدفعة، '4' المورد، '5' رقم الفهرس، '6' التركيز، '7' الحجم، '8' معد.
  4. إعداد العازلة مخفف تحتوي على 20٪ (V / V) الجلسرين، 10 MM EDTA، 200 mM تريس-حمض الهيدروكلوريك، درجة الحموضة 7.2، وتعقيم فلتر. الاحتفاظ بهذا المخزن المؤقت معقم ًا وتخزينه في RT.
  5. إعداد العازلة تلطيخ تحتوي على 2٪ (ث / الخامس)BSA، 1 M M MgCl 2، و 0.02٪ NaN3 في محلول ملحي الفوسفات المخزنة (PBS). تصفية وتخزين في 4 درجة مئوية.

2. إعداد لوحة مصدر ECM

  1. إزالة المخزونات من البروتينات ECM لطباعتها وذوبانها على الجليد. تسجيل جميع أرقام الكثير لتتبع البيانات الوصفية.
  2. نفض الغبار أنابيب من البروتينات المذابة بلطف لضمان إعادة تعليق السليم وتدور إلى أسفل في جهاز طرد مركزي.
  3. جعل خليط الطباعة ECM (EPMs) وfiducial الفلورسنت لاستخدامها من قبل الروبوت التعامل مع السائل من شأنها أن تخلق لوحات مصدر 384 جيدا معشاة.
    ملاحظة:     سيتم استخدام لوحات المصدر 384-well بواسطة طابعة صفيف دبوس تعمل باللمس لإنشاء صفائف مطبوعة في 8 لوحات جيدا.
    1. تسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل لكل EPM وfiducial.
    2. إعداد كل EPM عن طريق الجمع بين 125 ميكرولتر من المخزن المؤقت مخفف (انظر الخطوة 1.4) مع الحجم المناسب من مخزون ECM وجعل الخليط يصل إلى حجم إجمالي 250 درجة مئوية مع PBS. التركيزات النهائية في كل أنبوب EPM سيكون 1X بروتين ECM, 5 MM EDTA, 10% الجلسرين, و 100 mM Tris.
    3. إعداد fiducial الفلورسنت عن طريق حلها في المخزن المؤقت المناسب المحدد من قبل الشركة المصنعة ونقل 250 € L إلى أنبوب fiducial المسمى.

3. إنشاء لوحة المصدر باستخدام معالج سائل

  1. تصميم تخطيط لوحة 384 جيدا أن العشوائية مواقف ECMs والأمثل لمحور دبوس طابعة صفيف المستخدمة. تصميم موضع fiducial بحيث سيتم طباعتها في الصف 1، العمود 1 موقف كل بئر للمساعدة في اتجاه الصفيف.
    ملاحظة: يتم استخدام ما مجموعه 14-15 نسخة متماثلة من كل إدارة المحتوى في المؤسسة لضمان بيانات قوية. وتشمل تكرار إضافية من الكولاجين أو آخر ECM التي تسفر عن مرفق قوي لتقييم توحيد الربط. قد يحتاج التخطيط إلى استخدام لوحات متعددة 384-جيدا اعتمادا على عدد ECMs ذات الفائدة.
  2. نقل أنابيب EPM إلى معالج السائل، والحفاظ على أنابيب في 4 درجة مئوية إما مع رف أنبوب تبريد أو باستخدام الروبوت التعامل مع السائل الموجود في غرفة باردة.
  3. باستخدام برنامج المعالج السائل، قم بتشغيل برنامج لنقل 15 ميكرولتر من كل EPM والفيدوسيال إلى الآبار المحددة مسبقاً داخل لوحة (لوحات) مصدر 384 بئر.
  4. Pipet PBS في أي آبار غير المستخدمة لزيادة الرطوبة والحذر من الجفاف أثناء عملية الطباعة.
    ملاحظة: انظر الشكل 2 للحصول على مثال على مجموعة لوحة مصدر 384 جيدا التي تم تحسينها ل4 × 7 دبوس الرأس ويشمل الكولاجين أنا كتلة وPBS.
  5. ختم لوحة (ق) والحفاظ على 4 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للطباعة.

4. طباعة MEMAs باستخدام مجموعة الطباعة الروبوت

ملاحظة: ويصف الجزء التالي من البروتوكول على وجه التحديد إعداد واستخدام وزارة البيئة والبيئة للتحقيق في تأثير مختلف بروتينات البيئة الدقيقة على نمو وانتشار خلايا MCF7. ومع ذلك، يمكن بسهولة تكييف البروتوكول لاستخدام الأربطة المختلفة، ECMs، والخلايا لدراسة خطوط الخلايا الأخرى ونقاط النهاية ذات الأهمية.

  1. باستخدام طابعة دبوس تعمل باللمس، طباعة EPMs والبقع fiducial في 8 لوحات جيدا. طباعة نسخ متماثلة متعددة من كل شرط ECM لضمان التكرار.
    ملاحظة:     يمكن استخدام تنسيقات لوحة أخرى أو الشرائح للطباعة ولكن قد تكون هناك حاجة إلى تحسين المخزن المؤقت لتحقيق تكوين بقعة الأمثل.
    1. اطبع ECMs لـ MEMA باستخدام دبابيس قطرها 350 ميكرومتر مرتبة في تكوين رأس الطباعة 4 × 7. اطبع الصفائف في لوحات 8-well كـ 20 عمودًا بـ 35 صفًا، لما مجموعه 700 نقطة تقريبًا. صفائف أكبر ممكنة في هذه اللوحات ولكن تأتي مع مقايضة من زيادة آثار الحافة في كل من ربط الخلية وتلطيخ.
  2. بعد الطباعة، قم بتخزين لوحات في المجفف لمدة لا تقل عن 3 أيام قبل الاستخدام.

5. إنشاء لوحات العلاج Ligand

  1. تصميم تخطيط لوحة 96 جيدا بما في ذلك ligands من الفائدة. لتسهيل علاج العديد من لوحات MEMA في وقت واحد، وتصميم هذه اللوحة مع تباعد التي تسمح لاستخدام الأنابيب متعددة القنوات مع 4 نصائح متباعدة لنقل السوائل بين آبار MEMAs 8-جيدا ولوحة 96 جيدا.
    ملاحظة: وفي هذا البروتوكول، تُستخدم المجموعة الكاملة من الأربطة المدرجة في الجدول 2.
  2. ذوبان الأربطة على الجليد. نفض الغبار لفترة وجيزة وتدور أسفل كل أنبوب.
  3. تخفيف الأربطة إلى مخزون عمل 200x باستخدام المخزن المؤقت الموصى بها من قبل الشركة المصنعة (عادة PBS).
  4. Pipet 10 درجة مئوية من كل 200x ligand الأسهم في البئر المقابلة داخل لوحة 96 جيدا.
  5. ختم وتخزين لوحات في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: جعل لوحات العلاج ligand على دفعات، والتقاط جميع البيانات الوصفية لتحليل المصب.

6. زراعة الخلايا على MEMAs

  1. كتلة MEMAs لمدة 20 دقيقة مع 2 مل لكل بئر من العازلة حظر غيرقاذورات تحتوي على 1٪ عامل حظر غير قاذورات (جدول المواد) في الماء المقطر المزدوج (ddH2O).
  2. يستنشق حجب العازلة وآبار شطف الثلاثي مع PBS. لمنع الجفاف، وترك الحجم النهائي من PBS في الآبار حتى جاهزة لطلاء الخلايا.
    ملاحظة: من المفيد للغاية أن يكون هناك عاملان في مقاعد البدلاء لخطوات ثقافة الخلايا على الوزارة البحرية والزراعة. يمكن لأحد العاملين في مقاعد البدلاء تنفيذ خطوات الطموح، بينما يقوم الثاني بتنفيذ خطوات إضافية. فمن المستحسن استخدام الأنابيب متعددة القنوات 1 مل مع نصائح متباعدة لتتناسب مع لوحة 8-جيدا لpipetting وY-الخائن مع اثنين من ماصات باستور لستنشق آبار متعددة في وقت واحد.
  3. البذور 2 × 105 خلايا MCF7 لكل بئر في 2 مل من دولبكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS).
    ملاحظة: قبل إجراء تجربة كاملة لـ MEMA، قم بإجراء تجربة معايرة الخلايا لتحسين أرقام الخلايا بحيث تحتوي بقع MEMA على أرقام خلايا عالية (ولكنها لا تتلاءم) في نهاية المدة التجريبية المطلوبة.
  4. بعد 2-18 ساعة من التصاق، يستنشق المتوسطة واستبدالها ب2 مل من متوسط النمو المنخفض (DMEM مع 0.1٪ FBS).
    ملاحظة: يمكن استخدام المصل المنخفض (على سبيل المثال، 0.1٪ FBS) أو ظروف النمو المنضب ة عامل في هذا الوقت لعزل التأثير التحفيزي للأربطة محددة.
  5. إذابة لوحة علاج الرباط على الجليد. لوحة مذوبة بالطرد المركزي في 200 × غرام لمدة دقيقة واحدة.
  6. نقل 200 درجة مئوية من المتوسطة من كل بئر في لوحة الثقافة إلى البئر المناسب في لوحة العلاج. Pipet صعودا وهبوطا لخلط حجم ligand مع المتوسطة ونقل هذا الخليط مرة أخرى إلى البئر المناسبة في لوحة MEMA.
  7. صخرة طفيفة باليد وإعادة لوحات MEMA إلى الحاضنة. الثقافة لمدة التجربة في وجود مزيج ligand / ECM في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    ملاحظة: تجربة MEMA نموذجية تعمل لمدة 72 ساعة; قد تتطلب التجارب لمدة أطول استبدال المتوسطة وإعادة المعالجة مع ligand.
  8. نبض الآبار MEMA في 71 ساعة مع 100X 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) لتركيز نهائي من 10 μM. الحضانة في الظروفالتجريبية مع EdU لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: ويمكن أيضا استخدام علاجات الخلايا الحية الأخرى في هذا الوقت.

7. تحديد وتلطيخ المثليون أو الشرق الأوسط والأوسط

  1. بعد 72 ساعة وأي علاجات الخلايا الحية، يستنشق الآبار. إصلاح MEMAs في 2 مل لكل بئر من 2٪ بارافورماليدهايد (PFA) لمدة 15 دقيقة في RT.
  2. إستنشق PFA. نفاذية مع 2 مل لكل بئر من 0.1٪ السطحي غير الأيونية لمدة 15 دقيقة.
  3. يستنشق السطحي غير الأيونية وغسل مع 2 مل لكل بئر من PBS. إستنشق الـ(بي بي إس) غسل مع 2 مل من PBS مع 0.05٪ بوليسوربات 20 (PBS-T).
    ملاحظة: سطح MEMA هو الكاره للماء، وعدم غسل مع PBS-T قبل وصمة عار وحضانة الأجسام المضادة سيؤدي إلى تشكيل الفراغات في الآبار خلال خطوات الحضانة وتؤدي إلى تلطيخ القطع الأثرية.
  4. إستنشق PBS-T. إضافة الكواشف رد فعل الكشف EdU. حضانة لمدة 1 ساعة في RT، هزاز ومحمية من الضوء. بعد 1 ساعة الحضانة، وتبريد رد فعل مع المخزن المؤقت التبريد التجارية المقدمة.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ EdU الكشف وتلطيخ / خطوات الأجسام المضادة في 1.5 مل لكل بئر للحد من التكلفة.
  5. قم بإستقان العازلة للتبريد واغسلها بـ PBS-T قبل الحضانة بالبقع أو الأجسام المضادة.
  6. احتضان آبار MEMA مع الأجسام المضادة ضد الهيستون H3K9me3 (1:1,000) والفيبريلرين (1:400) في وصمة عار العازلة التي تحتوي على 2٪ (ث / الخامس) ألبومالمصل البقري (BSA)، 1 MM MgCl2 و 0.02٪ NaN3 بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: إجراء التحيّات الأجسام المضادة لتحديد التركيزات المثلى قبل استخدامها على مجموعة MEMA كاملة.
  7. بعد الحمل الأساسي أو وصمة عار، وغسل الآبار 2X مع PBS ومرة واحدة مع PBS-T.
  8. إضافة الأجسام المضادة الثانوية (حمار المضادة للماوس IgG والحمار المضادة للأرنب IgG، على حد سواء 1:300) و 0.5 ميكروغرام / مل 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). حضانة لمدة 1 ساعة في RT في الظلام.
  9. غسل الآبار 2X مع 2 مل لكل بئر من PBS، وتركها في النهائي 2 مل PBS.
  10. انتقل إلى التصوير أو تخزين MEMAs الملون للتصوير في وقت لاحق في PBS في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.

8. تصوير التقييمات المتوسطة والصغيرة والمتوسطة

  1. صورة MEMA على نظام التصوير الآلي مع قنوات الكشف الفلورسنت المناسبة.
  2. إخراج بيانات الصورة الناتجة إلى نظام إدارة الصور. تقسيم الخلايا وحساب مستويات الكثافة باستخدام CellProfiler8.

9- تحليل البيانات

ملاحظة: يتكون تحليل البيانات من التطبيع، وتصحيح التباين، وتلخيص البيانات المشتقة من CellProfiler الخام. في هذه الحالة، يتم استخدام بيئة R مع تعليمات برمجية مخصصة لتنفيذ كافة الخطوات. ومع ذلك، يمكن استخدام أي بيئة إحصائية أو برنامج لتنفيذ الإجراءات المكافئة. يتوفر مثال على التعليمات البرمجية المخصصة مفتوحة المصدر لبيئة R للتحليل في: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

  1. قبل المعالجة وتطبيع بيانات الصورة المجزأة.
  2. تحديد عدد الخلايا الموضعية باستخدام النوى الملطخة DAPI.
  3. لصناعة السيارات في بوابة كثافة EdU لتسمية الخلايا كما EdU+. قياس الانتشار باستخدام نسبة EdU+ الخلايا في كل بقعة.
  4. متوسط تلخيص البقع السيتوبلازمية وقياسات مورفولوجيا النووية على المستوى الفوري.
  5. إجراء إزالة التباين غير المرغوب فيه (RUV) التطبيع على البيانات لتحسين جودة البيانات9.
    ملاحظة: يتم تطبيق هذا النهج على كل إشارة كثافة ومورفولوجيا بشكل مستقل كمصفوفة مع صفائف باستخدام الصفوف والبقع كما الأعمدة كما هو موضح سابقا9.
  6. تطبيق التسوية loess ثنائي المتغيرات إلى المخلفات تطبيع RUV باستخدام صف الصفيف وعمود الصفيف كمتغيرات مستقلة لتصحيح للتأثيرات المكانية أو كثافة ذات الصلة.
  7. وبمجرد الانتهاء من التطبيع، يلخص الوسيط التكرار لكل حالة من شروط البيئة الدقيقة للإبلاغ والمزيد من التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولتبسيط الآثار البيئية الدقيقة على نمو الخلايا وانتشارها وتحديد الظروف التي تعزز أو تمنع نمو الخلايا وانتشارها، تم زرع خط خلايا سرطان الثدي MCF7 على مجموعة من ثمانية من الاتفاقيات البيئية المتوسطة والمتوسطة 8 الآبار على النحو المبين في البروتوكول. وقد عرّض هذا التقييم الخلايا إلى 48 جهازاً مختلفاً من الـ ECMs و57 ربطاً مختلفاً، لما مجموعه 2736 حالة بيئية مؤتلفة. بعد 71 ساعة في الثقافة، تم نبض الخلايا مع EdU، ثابتة، نفاذيبليد، وملطخة DAPI، رد فعل للكشف عن EdU، والأجسام المضادة للفيبريلين، والأجسام المضادة للH3K9me3. تم تص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت أهمية "الأبعاد" والسياق عاملاً محفزاً في تطوير أنظمة الثقافة المختبرية كأدوات في توصيف الخلايا السرطانية من خلال تفاعلها مع البيئة الدقيقة11،وقدرة المختبر نظم الثقافة لتقليد البيئة في الجسم الحي هو القوة الدافعة وراء السعي لتحسين تلك النظم الثقافية. في النظم المختبرية، ومع ذلك، لا تزال أدوات هامة من أبحاث السرطان على وجه التحديد بسبب قدرتها على تقطير المجمع في حالة الجسم الحي وصولا الى نموذج مبسط12.

على الرغم من أن أنظمة 2D يمكن أن تشمل ECMs...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مكتبة الصندوق المشترك للشبكات (LINCS) منحة HG008100 (J.W.G., L.M.H., وJ.E.K).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Aushon 2470Aushon BioSystemsArrayer المستخدم في بروتوكول
نيكون HCAنيكوننظام التصوير عالي المحتوى المصمم حول نيكون Eclipse Ti المجهر المقلوب
BioTek Precision XS السائلمعالج BioTek روبوت مناولة السوائل BioTek
محلول عازلة هيدروكلوريد TrizmaSigmaT2069
EDTAInvitrogen15575-038
GlycerolSigmaG5516
Triton X100SigmaT9284
Tween 20SigmaP7949
Kolliphor P338BASF50424591
384 بئر صفيف دقيق ، بئر أسطوانيThermo Fisherab1055
Nunc 8 طبق جيدThermo Fisher267062
Paraformaldehyde 16٪ محلولعلم المجهر الإلكتروني15710
BSAFisherBP-1600
Sodium AzideSigmaS2002
قناع الخليةالمجسات الجزيئيةH32713
Click-iTEdU Alexa Fluorالمجسات الجزيئيةC10357
DAPIPromo KinePK-CA70740043
ALCAMR & D Systems656-ALECM
Cadherin-20 (CDH20)R & D Systems5604-CAECM
Cadherin-6 (CDH6)R & D Systems2715-CAECM
Cadherin-8 (CDH8)R & أنظمة D188-C8ECM
CD44R & D Systems3660-CDECM
CEACAM6R & D Systems3934-CMECM
Collagen ICultrex3442-050-01ECM
Collagen Type IIMilliporeCC052ECM
Collagen Type IIIMilliporeCC054ECM
Collagen Type IVSigmaC5533ECM
Collagen Type VMilliporeCC077ECM
COL23A1R & D Systems4165-CLECM
Desmoglein 2R & D Systems947-DMECM
E-cadherin (CDH1)R & أنظمة D648-ECECM
ECM1R & أنظمة D3937-ECECM
FibronectinR & D Systems1918-FNECM
GAP43Abcamab114188ECM
HyA-500KR & D SystemsGLR002ECM
HyA-50KR & أنظمة DGLR001ECM
ICAM-1R & D Systems720-ICECM
LamininSigmaL6274ECM
Laminin-5Abcamab42326ECM
LumicanR & D Systems2846-LUECM
M-CAD (CDH15)R & amp أنظمة D4096-MCECM
Nidogen-1R & D Systems2570-NDECM
Osteoadherin / OSADR & D Systems2884-ADECM
Osteopontin (SPP)R & amp D أنظمة1433-OPECM
P-Cadherin (CDH3)R & D Systems861-PCECM
PECAM1R & D SystemsADP6ECM
Tenascin CR & أنظمة D3358-TCECM
VCAM1R & D SystemsADP5ECM
VitronectinR & D Systems2308-VNECM
BiglycanR & D Systems2667-CMECM
DecorinR & D Systems143-DEECM
بيريوستينR & D أنظمة3548-F2ECM
SPARC / osteonectinR & D Systems941-SPECM
Thrombospondin-1/2R & D Systems3074-THECM
BrevicanR & D Systems4009-BCECM
ElastinBioMatrix5052ECM
FibrillinLynn Sakai Lab OHSUN / AECM
ANGPT2RnD_Systems_Own623-AN-025Ligand
IL1BRnD_Systems_Own201-LB-005Ligand
CXCL8RnD_Systems_Own208-IL-010Ligand
IGF1RnD_Systems_Own291-G1-200Ligand
TNFRSF11BRnD_Systems_Own185-OSLigand
BMP6RnD_Systems_Own507-BP-020Ligand
FLT3LGRnD_Systems_Own308-FK-005Ligand
CXCL1RnD_Systems_Own275-GR-010Ligand
DLL4RnD_Systems_Own1506-D4-050ليجند
HGFRnD_Systems_Own294-HGN-005Ligand
Wnt5aRnD_Systems_Own645-WN-010Ligand
CTGFLife_Technologies_OwnPHG0286Ligand
LEPRnD_Systems_Own 398-LP-01MLigand
FGF2Sigma_Aldrich_OwnSRP4037-50UGLigand
FGF6RnD_Systems_Own238-F6Ligand
IL7RnD_Systems_Own207-IL-005Ligand
TGFB1RnD_Systems_Own246-LP-025Ligand
PDGFBRnD_Systems_Own220-BB-010Ligand
WNT10AGenemed_Own90009Ligand
PTNRnD_Systems_Own252-PL-050Ligand
BMP3RnD_Systems_Own113-BP-100Ligand
BMP4RnD_Systems_Own314-BP-010Ligand
TNFSF11RnD_Systems_Own390-TN-010Ligand
CSF2RnD_Systems_Own215-GM-010Ligand
BMP5RnD_Systems_Own615-BMC-020Ligand
DLL1RnD_Systems_Own1818-DL-050Ligand
NRG1RnD_Systems_Own296-HR-050Ligand
KNG1RnD_Systems_Own1569-PI-010Ligand
GPNMBRnD_Systems_Own2550-AC-050Ligand
CXCL12RnD_Systems_Own350-NS-010Ligand
IL15RnD_Systems_Own247-ILB-005Ligand
TNFRnD_ Systems_Own210-TA-020Ligand
IGFBP3RnD_Systems_Own675-B3-025Ligand
WNT3ARnD_Systems_Own5036-WNP-010Ligand
PDGFABRnD_Systems_Own222-ABLigand
AREGRnD_Systems_Own262-AR-100Ligand
JAG1RnD_Systems_Own1277-JG-050Ligand
BMP7RnD_Systems_Own354-BP-010Ligand
TGFB2RnD_Systems_Own302-B2-010Ligand
VEGFARnD_Systems_Own293-VE-010Ligand
IL6RnD_Systems_Own206-IL-010Ligand
CXCL12RnD_Systems_Own351-FS-010Ligand
NRG1RnD_Systems_Own378-SMLigand
IGFBP2RnD_Systems_Own674-B2-025Ligand
SHHRnD_Systems_Own1314-SH-025Ligand
FASLGRnD_Systems_Own126-FL-010Ligand
نظام روبوت المستخدم في بروتوكول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  3. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  4. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
  5. Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
  6. Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324(2014).
  7. Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  8. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  9. Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , Report No. 820 (2013).
  10. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
  11. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  12. Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
  13. Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
  14. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
  15. Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
  16. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Microenvironment MicroarrayExtracellular Matrix ProteinsLigand TreatmentCell Proliferation AssayFluorescent ImagingCellProfiler AnalysisEdU IncorporationBreast Cancer CellsMicroenvironmental FactorsAutomated Imaging

مقالات ذات صلة