توفر هذه المقالة طريقة لعزل نقية الأنسجة الجنينية من أجنة السمان والدجاج التي يمكن دمجها إلى النموذج السابقين فيفو تشيميريك الأجهزة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الأنسجة الجنينية وتشكيل أجهزة تشيميريك السمان-الدجاج باستخدام المثال الغدة الصعترية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وكان القدرة على عزل الأنسجة الجنينية خطوة أساسية لإقامة نظام الوهم الدجاج السمان، الذي بدوره قد قدمت مساهمات بلا منازع لإزاحة الستار عن العمليات الرئيسية في علم الأحياء التنموي.
وهنا يتم وصف أسلوب أمثل لعزل الأنسجة الجنينية من السمان والدجاج بالجراحة والهضم الأنزيمي مع الحفاظ على خصائصه البيولوجية. بعد عزلة، ترتبط الإنزيم أورجانوتيبيك في المختبر ل h. 48 السمان الأنسجة من كل الأنواع ويمكن التمييز بميزات النووية متميزة والمؤشرات الجزيئية التي تتيح دراسة الحديث عبر الهاتف الخلوي بين أنسجة الدجاج رابطة هيتيروسبيسيفيك للأنسجة. هذا النهج، لذلك، أداة مفيدة لدراسة تفاعلات الأنسجة المعقدة في العمليات الإنمائية مع التعديلات المكانية ديناميكية للغاية، مثل تلك التي تحدث أثناء morphogenesis البلعوم وتشكيل المعي أجهزة المستمدة من الأنسجة. ووضع هذا النهج التجريبي الأولى لدراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة خلال المراحل المبكرة من تكوين الغدة الصعترية. في هذا الصدد، بداية الغدة الصعترية المحتملين المستمدة من الأنسجة والمستمدة من ميسوديرم ميسينتشيمي، تم عزل من الأجنة السمان والدجاج، على التوالي.
يمكن اختبار قدرة الأنسجة المرتبطة بها لإنشاء الأجهزة كذلك بتطعيم لهم على الغشاء تشوريوالانتويك (كام) جنين الدجاج. كام توفر المواد الغذائية، ويتيح تبادل الغاز للأنسجة اكسبلانتيد. بعد 10 أيام في التنمية ovo، يمكن تحليل أجهزة تشيميريك في اكسبلانتس المقطوع بالطرق المورفولوجية التقليدية. يسمح هذا الإجراء أيضا دراسة المساهمات الخاصة بالانسجة أثناء تكوين الجهاز، ومن تطورها الأولى (التنمية في المختبر) إلى المراحل النهائية من أورجانوجينيسيس (في التنمية ovo).
أخيرا، توفر طريقة تحسين العزل أيضا ثريديمينسيونالي (3D) الحفاظ على الأنسجة الجنينية، التي يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل الطوبوغرافية عالية الاستبانة لأنماط التعبير الجيني الأنسجة على حدة.
المقدمة
في أوائل السبعينات، وضعت نظاما أنيقة الدجاج السمان الوهم Le دارين، فتح آفاقاً جديدة لفهم دور الهجرة الخلية والتفاعلات الخلوية أثناء التنمية1،2. وقد وضع النموذج على الفرضية القائلة بأن الخلية التبادل بين هذين النوعين لا تخل إلى حد كبير امبريوجينيسيس، أكد في وقت لاحق عندما تستخدم لدراسة العمليات الإنمائية العديدة، بما في ذلك تشكيل الجهاز العصبي والمكونة للدم نظم1. أخذ هذا الأخير على سبيل مثال، موجات دورية من فروعه المكونة للدم استعمار بداية الظهارية الغدة الصعترية أولاً لوحظ استخدام نظام الوهم الدجاج السمان3. لذلك، إقليم المحتملين من الغدة الصعترية، الأنسجة الحقائب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
كل هذه التجارب اتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية دي التاريخ مركز الطب والرعاية الحيوانية يسبوا.
1-المخصبة حضانة بيض السمان والدجاج
- مكان بيض السمان الياباني (طائر طائر japonica) المخصب في حاضنة هوميديفيد 38 درجة مئوية لمدة 3 أيام. احتضان البيض (بيضة نهاية حادة) مواجهة في قاعة الهواء.
ملاحظة: البيئة هوميديفيد ويتحقق عن طريق وضع حاوية مياه في الجزء السفلي من الحاضنة. - احتضان البويضات المخصبة من الدجاج (Gallus gallus) لأيام 2.5 في حاضنة هوميديفيد 38 درجة مئوية. احتضان البيض في وضع أفقي ووضع علامة على الجانب العلوي باستخدام قطعة من الفحم لتحديد مكان الجنين.
ملاحظة: تبدأ مع 40 من بيض السمان وبيض الدجاج 60....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تفاصيل البروتوكول وسيلة لعزل الطيور الأنسجة الجنينية لاستخدامها في العديد من النهج التقني البيولوجيا الخلوية والإنمائية. هذا الأسلوب كان يعمل سابقا في دراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة خلال المراحل المبكرة من تكوين الغدة الصعترية5. وهنا، تظهر نتائج جديدة في الشكل 1 و الشكل 2، باستخدام نهج مماثل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تحسين إجراءات عزل الأنسجة الجنينية مفصلة هنا من الأساليب السابقة لإنتاج أجنة الدجاج السمان تشيميريك في مختلف السياقات البيولوجية3،،من56.
وهذا النهج مناسبة لعزل الأنسجة الجنينية نقية دون الحاجة إلى التلاعب بالجينات أو استخدام علامات خاصة بالانسجة، التي غالباً ما تكون غير محددة، الحد من استخدام نماذج حيوانية معدلة وراثيا. ويمكن استخدامه لدراسة التفاعلات بين الظهارية الوسيطة أثناء التطوير، مع القدرة ع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
الكتاب ممتنون إيزابيل الكوبايا لقراءة نقدية من المخطوطة، ماريو إنريكي للسرد الفيديو و Proa فيتور من "دائرة علم الأنسجة" ه هيستولوجيا دي معهد بيولوجيا هل التنمية، دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي لشبونة، لتقديم الدعم التقني. ونحن مدينون لا سيما كايرو باولو و "هوجو سيلفا" من مقاتلي دي أوديوفيسوايس (الوحدة السمعية البصرية)، دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي يسبوا على التزامهم المعلقة بإنتاج هذا الفيديو. ونعترف Microsystems إيكا يرجى توفير ستيريوسكوبي مزودة بنظام فيديو وإلى إينتيرافيس--شركة زراعية-سنة, S.A للمساهمة مع السمان يخصب البيض. هذا العمل كان يدعمه دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي لشبونة (فمول).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بيض الدجاج المخخص (Gallus gallus< / em>) | Pintobar ، مزرعة دواجن البرتغال | ؛ | |
| بيض السمان المخصب (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي PP Corning | 430052 | ||
| 50 مل أنابيب الطرد المركزي PP Corning | 430290 | ||
| 60 × 20 مم أطباق بيركس | مجموعة دوران | 21 755 41 | |
| 100 × 20 مم أطباق بيركس | دوران | 21 755 48 | |
| شبكة معدنية | Goodfellows | شبكة دقيقة شبكية شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ | |
| مرشح غشاء | Millipore | DTTP01300 | 0.6 مم مرشح غشاء Isopore |
| طبق بتري ، 35 × 10 مم | Sigma-Aldrich | P5112 & nbsp ؛ | |
| أوعية بيركس 60 × 30 مم (صغيرة الحجم) | من السوبر ماركت ؛ | ||
| 100 × 50 مم أوعية بيركس (حجم كبير) | من السوبر ماركت | ||
| ماصات النقل | Samco Scientific ، Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 مل ماصة بلاستيكية |
| ماصة زجاجية باستير | نورماكس | 5426015 | |
| شريط | من السوبر ماركت ؛ | ||
| السيتوكيراتين (عموم ؛ حمضي وأساسي ، نوع الأول والثاني السيتوكيراتين) ، استنساخ Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Invitrogen ، Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | تحضير محلول 25 مجم / مل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ؛ جهاز طرد مركزي وفلتر قبل aliquote وتخزينه في -20 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بكميات مجمدة من أجل عدة سنوات. |
| بارافورمالديهايد | سيجما ألدريتش | P6148 | |
| البنسلين الستربتومايسين | إنفيتروجين ، ثيرمو فيشر العلمي | 15140-122 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | جيبكو ، ثيرمو فيشر العلمي | 10010023 | |
| الأجسام المضادة QCPN | دراسات التنموية الورم الهجين بنك | QCPN | |
| RPMI 1640 متوسط ، مكمل جلوتاماكس ؛ | جيبكو ، ثيرمو فيشر العلمي | 61870010 | |
| بلوسيل RTV141A / ب سيليكون مطاط 1.1 كجم طقم | ELKEM / Silmid | RH141001KG | لتحضير القاعدة الخلفية لطبق بتري |
| دومون # 5 ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11251-30 ؛ | ملقط رفيع |
| مقص بون ناعم للغاية ، | أدوات العلوم الدقيقة | 14085-08 | مقص منحني |
| دبابيس الحشرات ؛ | أدوات العلوم الدقيقة | 26001-30 | 0.3 مم دبوس الفولاذ المقاوم |
| ملعقة صغيرة | أدوات العلوم الدقيقة | 10087-12 | ملعقة زرع |
| دبابيس Minutien | أدوات العلوم | الدقيقة 26002-20 | 0.2 مم الفولاذ المقاوم للصدأ microscalpel |
| Minutien دبابيس | أدوات العلوم الدقيقة | 26002-10 | 0.1 مم الفولاذ المقاوم للصدأ microscalpel |
| موريا مطلي بالنيكل دبوس حامل | أدوات العلوم الدقيقة | 26016-12 | دبوس مطلي بالنيكل |
| موريا ملعقة مثقبة | أدوات العلوم الدقيقة | 10370-17 | مقشدة |
| Wecker مقص العين | أدوات العلوم الدقيقة | 15010-11 | |
| كاميرا | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| المجهر | لايكا مايكروسيستمز | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital الماسح الضوئي للشرائح | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | لايكا M80 |
المراجع
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to t....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
