Method Article

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

DOI:

10.3791/58975

⸱

June 11th, 2019

 ,  , 
1Institute for Stem Cell Biology & Regenerative Medicine, Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يفصّل هذا البروتوكول طريقة أحادية الطبقة وخالية من المصل لتوليد خلايا شبيهة بخلايا الكبد بكفاءة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSCs) في غضون 18 يومًا. وهذا ينطوي على ست خطوات كما hPSCs تميز بالتتابع إلى أنواع الخلايا المتوسطة مثل خط البدائية, endoderm النهائي, القلفة الخلفية وذرية برعم الكبد قبل تشكيل الخلايا الشبيهة بالكبد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يزيل الكبد السموم من المواد الضارة، ويفرز البروتينات الحيوية، وينفذ الأنشطة الأيضية الرئيسية، وبالتالي الحفاظ على الحياة. وبالتالي، فإن فشل الكبد - الذي يمكن أن ينجم عن تناول الكحول المزمن، والتهاب الكبد، والتسمم الحاد، أو غيرها من الإهانات - هو حالة خطيرة يمكن أن تتوج بالنزيف واليرقان والغيبوبة والموت في نهاية المطاف. ومع ذلك, وقد أحبطت نُهج لعلاج فشل الكبد, فضلا عن دراسات وظائف الكبد والمرض, جزئيا بسبب عدم وجود إمدادات وفيرة من خلايا الكبد البشرية. ولهذا الغرض، يفصّل هذا البروتوكول التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى (hPSCs) في الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد، مسترشدة بخارطة طريق تنموية تصف كيفية تحديد مصير الكبد عبر ست خطوات تمايز متتالية. من خلال التلاعب مسارات الإشارات التنموية لتعزيز تمايز الكبد وقمع تشكيل مصائر الخلايا غير المرغوب فيها بشكل صريح، تولد هذه الطريقة بكفاءة مجموعات من الذرية برعم الكبد البشري والخلايا الشبيهة بالكبد بحلول أيام 6 و18 من التمايز PSC، على التوالي. ويتحقق ذلك من خلال التحكم الدقيق زمنياً في مسارات الإشارات التنموية، التي تمارسها الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو في وسط ثقافة خالية من المصل. التمايز في هذا النظام يحدث في الطبقات الأحادية وينتج الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد التي تعبر عن إنزيمات خلايا الكبد المميزة ولها القدرة على تطعيم نموذج الماوس من فشل الكبد المزمن. القدرة على توليد بكفاءة أعداد كبيرة من خلايا الكبد البشرية في المختبر له تداعيات لعلاج فشل الكبد، لفحص المخدرات، وللدراسات الميكانيكية لأمراض الكبد.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغرض من هذا البروتوكول هو التمييز بكفاءة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSCs) في السكان المخصب من الذرية برعم الكبد والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد2. الوصول إلى إمدادات جاهزة من الذرية الكبد البشري والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد تسريع الجهود للتحقيق في وظائف الكبد والمرض ويمكن تمكين علاجات زرع الخلوية الجديدة لفشل الكبد3،4، 5. وقد ثبت أن هذا الأمر ينطوي على تحديات في الماضي لأن الـ hPSCs (التي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القوى) يمكن أن تفرق في جميع أنواع الخلايا في جسم الإنسان؛ وبالتالي، كان من الصعب تمييزها حصرا إلى مجموعة نق....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد وسائل الإعلام التمايز

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على معلومات الشركة المصنعة فيما يتعلق بالمواد والكواشف المستخدمة.

  1. إعداد وسائط أساسية محددة كيميائياً (آلية التنمية النظيفة)
    ملاحظة:     آلية التنمية النظيفة 2 وآلية التنمية النظيفة(3) وآلية التنمية النظيفة(4) وآلية التنمية النظيفة(5) هي وسائط معرّفة كيميائياً تُستخدم كوسائط أساسية للتمركزات المنسّلة المُعرِّفة بخلايا الكبد في مراحل مختلفة. ويمكن الاطلاع على تكوين هذه الوسائط في الجدول 1.
    1. لجعل CDM2 أو CDM3، وإعداد حل الأسهم التي تحتوي على الكحول البولي فينيل (PVA). حل 0.5 غرام من مسحوق PVA في 50....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد 24 ساعة من التمايز APS، سوف تعتمد المستعمرات عموما مورفولوجيا مختلفة من المستعمرات غير المتمايزة المصاحبة لفقدان الحدود المشرقة التي عادة ما تحصر مستعمرات hPSC. من الناحية الشكلية، خلايا خط بدائية عموما لها حدود خشنة وأكثر انتشارا وأقل إحكاما من hPSCs-هذا هو مذكر من الانتقال الظهاري إلى mesenchymal كما خلايا epiblast متعددة القوى تميز والدخول في البدائية خط في الجسم الحي. إذا كان حجم مستعمرة hPSCs قبل التمايز كبير جداً، سيكون هناك مركز مرتفع بشكل عام يضم خلايا غير متمايزة. وينبغي التخ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الطريقة تمكن من توليد السكان المخصب من الذرية برعم الكبد، والخلايا الشبيهة بالكبد في وقت لاحق، من hPSCs. القدرة على توليد السكان المخصب من خلايا الكبد البشرية مهم للاستخدام العملي لهذه الخلايا. الطرق السابقة لتوليد خلايا الكبد من hPSCs أسفرت عن مجموعات الخلايا غير النقية التي تحتوي على كل من خلايا الكبد وغير الكبد التي، عند زرعها في القوارض، أسفرت العظام والغضاريف بالإضافة إلى أنسجة الكبد15. وبالتالي فإن القمع الصريح للتمايز غير الكبد أمر بالغ الأهمية لتوليد مجموعات الكبد المخصب التي قد تكون م.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بينغ ليم على المناقشات ومعهد ستانفورد لبيولوجيا الخلايا الجذعية والطب التجديدي لدعم البنية التحتية. وقد دعم هذا العمل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (DISC2-10679) ومعهد ستانفورد-يو سيبير سيبل للخلايا الجذعية (إلى L.T.A. وK.M.L.) ومركز ستانفورد بيكمان للطب الجزيئي والوراثي وكذلك المجهول، [بإكستر] و [دجنوفا] أسرات (إلى [ك.م.ل.]).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  GeltrexThermofisher ScientificA1569601
1: 1 DMEM / F12Gibco11320033
0.2   مو مرشح غشاء المسامm MilliporeGTTP02500
mTeSR1تقنيات الخلايا الجذعية5850
ThiazovivinTocris Bioscience3845
  ؛ AccutaseGibco أو Millipore Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM ، GlutaMAX & trade ؛ مكملغذائي Thermofisher Scientific31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix و GlutaMAX & trade ؛ مكملغذائي Thermofisher Scientific31765035
KOSR ، بدائل مصل بالضربة القاضيةThermofisher Scientific10828028
Poly (كحول فينيل)Sigma-Aldrich   ؛  P8136
Transferrin سيجما ألدريتش   10652202001
كيميائيا تركيز الدهونThermofisher Scientific11905031
Human ActivinR & D338-AC
CHIR99201Tocris4423
PI103Tocris2930/1
Human FGF2R & D233-FB
DM3189Tocris6053/10
A83-01Tocris2939/10
Human BMP4R & D314-BP
C59Tocris5148
TTNPBTocris0761/10
ForskolinTocris1099/10
Oncostatin MR & D295-OM
ديكساميثازونتوكرس1126
Ro4929097Selleck ChemS1575
AA2PCayman Chemicals16457< / em>
الأنسولين المؤتلف البشريSigma-Aldrich    هاتف: 11061-68-0
محدد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
  2. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  3. Fisher, R. A., Strom, S. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsLiver Cell DifferentiationHepatocyte like CellsDevelopmental Signaling PathwaysSmall Molecules Growth FactorsSerum free Culture MediumLiver Bud ProgenitorsDay 6 DifferentiationDay 18 DifferentiationPVA Stock Preparation

Related Articles