موقع الموجه الطفرات أسلوب يستخدم لإدخال طفرات محددة في الحمض الخلوي الصبغي (DNA). هذا البروتوكول توضح كيفية القيام الطفرات الموجهة الموقع مع خطوة 2 والخطوة 3 تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على أساس النهج التي تنطبق على أي جزء من الحمض النووي للفائدة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الطفرات موقع الموجه لفي المختبر وفي فيفو التجارب المتمثلة بالتفاعلات الحمض النووي الريبي في الإشريكيّة القولونية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
موقع الموجه الطفرات تقنية تستخدم لإدخال طفرات محددة في الحمض النووي للتحقيق في التفاعل بين جزيئات الحمض النووي الريبي (سرنا) صغيرة غير الترميز والهدف رسول الكشف (مرناس). وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم الطفرات موقع الموجه لتعيين مواقع ربط بروتين محددة للجيش الملكي النيبالي. ويرد وصف عرضاً بكر على أساس الخطوة 2 والخطوة 3 للطفرات. والنهج ذات الصلة لجميع البروتين-الجيش الملكي النيبالي ودراسات الحمض النووي الريبي الريبي التفاعل. وباختصار، هذه التقنية تعتمد على تصميم كبسولة تفجير mutation(s) المنشودة، ومن خلال الخطوات 2 أو 3 من PCR توليف منتج PCR مع الطفرة. ثم يتم استخدام المنتج PCR للاستنساخ. وهنا، نحن تصف كيفية تنفيذ الطفرات الموجهة الموقع مع كل نهج الخطوة 2 و 3 استحداث الطفرات سرنا و McaS ومرناً، كسجد، للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي-الجيش الملكي النيبالي وتفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي. نقوم بتطبيق هذا الأسلوب للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي التفاعلات؛ هذا الأسلوب غير المنطبقة على جميع الدراسات الطفرات (مثل التفاعلات الحمض النووي عالي البروتين، والأحماض الأمينية بالإضافة/الحذف/استبدال). من الممكن إدخال أي نوع من الطفرة باستثناء القواعد غير طبيعية ولكن هذا الأسلوب لا ينطبق إلا إذا كان يمكن استخدام منتج PCR المصب بالتطبيق (مثل الاستنساخ وقالب لمزيد من PCR).
المقدمة
الحمض النووي كثيرا ما يشار إلى خطة لخلية حية حيث يتم ترميز جميع الهياكل الخلية في تسلسل الحمض النووي لها. النسخ المتماثل دقيقة وآليات إصلاح الحمض النووي ضمان حدوث معدلات منخفضة جداً فقط من الطفرات، هو أمر ضروري للحفاظ على الوظائف الصحيحة للجينات مشفرة. تغيير تسلسل الحمض النووي يمكن أن يؤثر على الوظائف المتعاقبة على مستويات مختلفة بدءاً من الحمض النووي (الاعتراف بعوامل النسخ والتقييد الإنزيمات)، ثم الجيش الملكي النيبالي (تكامل قاعدة بين زوج وتعديلات الهيكل الثانوي) و/أو البروتين (الأمينية استبدال حمض والحذف والإضافات أو الإطار-التحولات). في حين أن العديد من الطفرات لا تؤثر على وظيفة المورثات إلى حد كبير، يمكن أن يكون بعض طفرات في الحمض النووي آثار ضخمة. وهكذا، الطفرات الموجهة من الموقع أداة قيمة لدراسة أهمية مواقع محددة من الحمض النووي على جميع المستويات.
ويصف هذا البروتوكول نهجاً الطفرات مستهدفة تستخدم لإدخال طفرات محددة. يعتمد البروتوكول على استراتيجيتين PCR مختلفة: 2-خطوة أو بكر 3-الخطوة. بكر 2-الخطوة قابلاً للتطبيق إذا كانت الطفرة المنشودة بالقرب من النهاية 5 'أو نهاية 3' الحمض النووي للفائدة (< 200 زوج قاعدي (bp) من النهاية) وبكر 3-الخطوة قابلاً للتطبيق في جميع الحالات.
في نهج بكر الخطوة 2، كبسولة تفجير 3 مصممة الذي صمم مجموعة واحدة من الإشعال تضخيم الحمض النووي للفائدة (كبسولة تفجير 1 و 3، إلى الأمام وعكس، على التوالي) وكتاب واحد يهدف إلى إدماج الطفرة. الطفرة إدخال التمهيدي (التمهيدي 2) ينبغي أن يكون اتجاه عكس إذا كانت الطفرة القريبة من النهاية 5 'وتوجه إلى الأمام إذا كانت الطفرة بالقرب من النهاية 3'. في الخطوة الأولى في بكر، يسهب التمهيدي 1 + 2 أو 2 + 3 جزء صغيرة قريبة من 5 'نهاية أو 3' نهاية، على التوالي. ثم يتم استخدام ناتج PCR تمهيدي في الخطوة الثانية مع التمهيدي 1 أو 3، مما أدى إلى منتج PCR مع طفرة في الحمض النووي للفائدة (الشكل 1A).
في PCR الخطوة 3، يتم تصميم كبسولة تفجير 4، الذي صمم مجموعة واحدة من الإشعال تضخيم الحمض النووي للفائدة (كبسولة تفجير 1 و 4، إلى الأمام وعكس، على التوالي) ومجموعة واحدة من الإشعال يهدف إلى إدماج طفرات محددة مع تداخل التكامل (2 و 3، عكس والي الأمام، على التوالي). في خطوة واحدة، واثنتان، وتضخيم الإشعال 1 + 2 و 3 + 4 في نهاية 5 'و 3'. في الخطوة الثالثة، منتجات PCR الناتجة من خطوة واحدة واثنين يتم استخدامها كقوالب وتضخيم مع الإشعال 1 + 4. وهكذا، من بكر وناتج الحمض النووي للفائدة مع الطفرة المرجوة (الشكل 1B).
بينما يمكن استخدام الحمض النووي تحور لأي تطبيق المصب، يصف هذا البروتوكول كيفية إعادة دمج الحامض النووي في ناقل استنساخ. استخدام استنساخ متجهات مزايا عديدة مثل سهولة الاستنساخ وتطبيقات تجريبية محددة تبعاً لميزات ناقل. غالباً ما يتم استخدام هذه الميزة لدراسات التفاعل الجيش الملكي النيبالي. أسلوب آخر للحمض النووي الريبي دراسات التفاعل سبر الهيكلية للجيش الملكي النيبالي في المجمع مع آخر الجيش الملكي النيبالي1،2 أو البروتين3،4. ومع ذلك، الهيكلي هو فقط إجراء التدقيق في المختبر حين الطفرات موقع الموجه والاستنساخ اللاحقة تسمح بالتفاعل الدراسات المجراة.
الطفرات موقع الموجه قد استخدمت على نطاق واسع للجيش الملكي النيبالي التفاعل الدراسات كما عرضها هنا. بيد أن الأسلوب الرئيسية بشأن 2 أو 3-خطوة PCR تنطبق على أي قطعة من الحمض النووي وهكذا لا يقتصر على دراسات الحمض النووي الريبي-التفاعل.
لتجسيد هذه التقنية واستخداماتها المحتملة، يتم استخدام الوصف لمناطق هامة لتنظيم بوستترانسكريبشونال مرناً، كسجد، من الإشريكيّة القولونية (كولاي). كولاي، كسجد هو استهداف قبل الصغيرة غير الترميز الجيش الملكي النيبالي، McaS، بالتعاون مع بروتين، هفق، لقمع التعبير البروتين كسجد2،،من45. التقنية تستخدم لإدخال طفرات إلى منطقة قاعدة المزاوجة بين كسجد و McaS، وموقع الربط هفق كسجد. ثم هو استنساخ الحمض النووي التي تم الحصول عليها إلى ناقل مناسب للتجارب اللاحقة. وتشمل التطبيقات المصب تقنية التجارب المجراة في سواء في المختبر. للتوضيح، مثال 1 تتميز المجراة باستخدام تحليل لطخة غربية وتتميز المثال 2 في المختبر باستخدام مقايسة تحول تنقل الغرواني الكهربي (أمسا). وفي كلتا الحالتين الطفرات يتضح كيفية توجيه الموقع يمكن استخدامها بالاقتران مع غيرها من تقنيات جعل استنتاجات البيولوجية حول جينات للفائدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. ناقلات التحديد
- اختر متجه لإجراء تجارب المتلقين للمعلومات. أي ناقل قابل للتطبيق لهذا الأسلوب PCR الخطوة 2 و 3.
- على أساس الاختيار لناقلات الأمراض، اختر إنزيمات التقييد الملائمة للاستنساخ.
2-التمهيدي تصميم للموقع توجه الطفرات
- تقرر بين أما الخطوة 2 أو 3-الخطوة بكر الاستراتيجية (2-الخطوة فقط للطفرات < 200 شركة بريتيش بتروليوم من طرفي للحمض النووي للفائدة). بكر 2-الخطوة، انتقل إلى الخطوة 2، 2 وعلى بكر 3-الخطوة انتقل إلى الخطوة 2، 3.
- تصميم كبسولة تفجير لبكر الخطوة 2.
- ويتضمن التصميم التمهيدي 1 و 3 تضخيم الحمض النووي للفائدة ومع 5 ' عبء أن النيوكليوتيدات 4 (على سبيل المثال، أتات أو أجكت) متبوعاً بالموقع التعرف على القيود ذات الصلة اللازمة لاستنساخ داخل المتجهة المختار.
- تصميم التمهيدي 2 لإدخال mutation(s) في المواقع المطلوبة والجناح الطفرة مع 10-15 النيوكليوتيدات تكميلية على كلا الجانبين. جعل التمهيدي عكس إذا قدم الطفرة في نهاية 5 'أو إلى الأمام إذا كان يتم عرض الطفرة في نهاية 3'.
- تصميم كبسولة تفجير لبكر الخطوة 3.
- ويتضمن التصميم التمهيدي 1 و 4 تضخيم الحمض النووي للفائدة ومع 5 ' عبء أن النيوكليوتيدات 4 (على سبيل المثال، أتات أو أجكت) متبوعاً بالموقع التعرف على القيود ذات الصلة اللازمة لاستنساخ داخل المتجهة المختار.
- تصميم التمهيدي 2 و 3 لإدخال mutation(s) في المواقع المطلوبة والجناح الطفرة قبل 10-15 النيوكليوتيدات تكميلية على كلا الجانبين. يتم عكس التمهيدي 2 و 3 التكميلية.
3-[بكر] تضخيم البرية نوع الحمض النووي لاستنساخ
ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل عن بكر، انظر6.
- إجراء PCR6 استخدام كبسولة تفجير 1 + 2 (الخطوة 2 PCR) أو 1 + 4 (3-الخطوة PCR) واستخدام الحمض النووي نوع البرية كقالب للحصول على استخدام PCR المنتج أولاً البرنامج بكر في الجدول 1.
- التحقق من صحة PCR بالتفريد [اغروس] هلام.
- جعل [اغروس] هلام الحل (2 في المائة) بإضافة 2 ز [اغروس] في 100 مل من 1 x تريس-خلات-الإيثيلين حمض (يدتا) (تاي) المخزن المؤقت. حل [اغروس] واسطة الغليان في فرن ميكروويف. إضافة بروميد اثيديوم صبغ تلطيخ الحمض النووي (إلى تركيز نهائي ل ~ 0.5 ميكروغرام/مل) [اغروس] هلام الحل للتصور.
- يلقي [اغروس] هلام ووضعه في وحدة التفريد، وتحميل عينات بكر (مختلطة مع صبغ تحميل الحمض النووي) وسلم الحمض النووي لحجم معروف. تشغيل عينات في 75 واط لمدة 45 دقيقة، أو حتى عصابات مفصولة بشكل واف، ووضع تصور لعصابات طاولة بنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) أو مع هلام نظام التصوير.
- تنقية المنتج بكر مع مجموعة استخراج هلام (جدول المواد) وقياس تركيز الحمض النووي المنقي مع جهاز المطياف الضوئي (جدول المواد).
- تخزين تنقية الحمض النووي في-20 درجة مئوية (في تريس يدتا (TE) العازلة – التخزين على المدى الطويل) أو 4 درجة مئوية (في dH2س – التخزين القصير الأجل) حتى المستخدمة في الخطوة 5.
4-بكر الأخذ بتوجه الموقع طفرات في الحمض النووي
- بكر على بكر 2-الخطوة (راجع الخطوة 4.2 PCR الخطوة 3)
- إجراء PCR6 استخدام كبسولة تفجير 1 + 2 إذا الطفرات في النهاية 5 'أو 2 + 3 إذا الطفرات في 3' إنهاء واستخدام الحمض النووي نوع البرية كقالب للحصول على منتج PCR الثاني (انظر الجدول 1 لبرنامج PCR).
- التحقق من صحة PCR قبل [اغروس] هلام التفريد كما هو الحال في الخطوة 3.2.1 و 3.2.2.
- تنقية المنتج بكر مع مجموعة استخراج هلام (جدول المواد) وقياس تركيز الحمض النووي المنقي مع جهاز المطياف الضوئي (جدول المواد).
- مخزن تنقية الحمض النووي في-20 درجة مئوية (في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات) أو 4 درجة مئوية (في dH2س) حتى المستخدمة في الخطوة 5.
- إجراء PCR6 استخدام PCR المنتج الثاني التمهيدي جنبا إلى جنب مع التمهيدي 3 إذا كانت الطفرات في 5 'نهاية أو التمهيدي 1 إذا الطفرات في النهاية 3' واستخدام الحمض النووي نوع البرية كقالب للحصول على منتج PCR الثالث (انظر الجدول 1 لبرنامج PCR).
- التحقق من صحة PCR قبل [اغروس] هلام التفريد كما هو الحال في الخطوة 3.2.1 و 3.2.2.
- تنقية المنتج بكر مع مجموعة استخراج هلام (جدول المواد) وقياس تركيز لتنقية الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي (جدول المواد).
- مخزن تنقية الحمض النووي في-20 درجة مئوية (في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات) أو 4 درجة مئوية (في dH2س) حتى الخطوة 5.
- بكر على بكر 3-الخطوة
- إجراء PCR6 استخدام كبسولة تفجير 1 + 2 و 3 + 4 في ردود منفصلة واستخدام الحمض النووي نوع البرية كقالب للحصول على منتج PCR الثاني والثالث (انظر الجدول 1 لبرنامج PCR).
- التحقق من صحة تقارير إتمام المشروعات التي [اغروس] هلام التفريد كما هو الحال في الخطوة 3.2.1 و 3.2.2.
- تنقية منتجات PCR مع مجموعة استخراج هلام (جدول المواد) وقياس تركيز الحمض النووي المنقي مع جهاز المطياف الضوئي (جدول المواد).
- مخزن تنقية الحمض النووي في-20 درجة مئوية (في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات) أو 4 درجة مئوية (في dH2س).
- أداء بكر6 استخدام كبسولة تفجير 1 + 4 واستخدام 2-5 نانوغرام لكل منتجات PCR الثاني والثالث كالقوالب (في نفس رد الفعل) للحصول على بكر المنتج الرابع (انظر الجدول 1 لبرنامج PCR).
- التحقق من صحة PCR قبل [اغروس] هلام التفريد كما هو الحال في الخطوة 3.2.1 و 3.2.2.
ملاحظة: أنها ليست غير عادية للحصول على عدة نطاقات غير صحيحة (يمكن أن تخفض في بعض الأحيان باستخدام قالب أقل). ومع ذلك، يمكن تجاهل منتجات PCR غير صحيحة إذا اقتطعت الفرقة الحجم بشكل صحيح واستخراج هلام. - إذا كان صحيحاً، تنقية المنتج بكر مع مجموعة استخراج هلام (جدول المواد) وقياس تركيز لتنقية الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي (جدول المواد).
- مخزن تنقية الحمض النووي في-20 درجة مئوية (في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات) أو 4 درجة مئوية (في dH2س) حتى الخطوة 5.
5-جزئ من نوع البرية ومتحولة version (s) من الحمض النووي داخل المتجهة المختار
ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل في اتباع الخطوات، انظر7.
- خلاصة تنقية منتجات PCR الأول والثالث (من الخطوة 2 PCR) و/أو الرابع (من الخطوة 3 PCR) باستخدام إنزيمات التقييد ذات الصلة.
- في 20 ميليلتر من 1 × الهضم المخزن المؤقت مع 1 ميليلتر لكل إنزيم التقييد، خلاصة 200 نانوغرام من منتج PCR في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
- تنقية المنتج بكر هضمها باستخراج هلام باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام (جدول المواد) وقياس تركيز الحمض الخلوي الصبغي DNA المنقي مع جهاز المطياف الضوئي (جدول المواد)، وتخزينها في-20 درجة مئوية (في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات) أو 4 درجة مئوية (في dH2 س) حتى تستخدم للخطوة 5.6.
- هضم ناقل المنقي مع ذات الصلة قيد الإنزيمات وتعامل مع الفوسفاتيز القلوية انخفاض ناقل إعادة ربط الأحداث. لا تعامل المنتجات PCR مع الفوسفاتيز القلوية.
- في 30 ميليلتر من 1 × الهضم المخزن المؤقت مع 1 ميليلتر لكل إنزيم التقييد و 1 ميليلتر من الفوسفاتيز القلوية، نغ هضم 1,000 ناقل في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
- ناقل هضمها منفصلة من الحمض النووي النفايات (مثل ناقلات تقطيعه وقطع من الحمض النووي) باستخدام [اغروس] هلام التفريد كما هو الحال في الخطوة 3.2.1 و 3.2.2.
- تنقية ناقلات هضمها باستخراج هلام باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام (جدول المواد) وقياس تركيز الحمض النووي لتنقية الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي (جدول المواد)، وتخزينها في-20 درجة مئوية (في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات) أو 4 درجة مئوية (في dH2س) حتى تستخدم الخطوة 5.6.
- اضطر هضمها PCR المنتجات إلى ناقل هضمها مع ردود الفعل المحدد في الجدول 2.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة 2 ح أو بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
- تحويل سلالة المستلم (على سبيل المثال، K12 كولاي ) مع ربط ردود الفعل.
- تنمو سلالة OD600= 0.3-0.5 ونقل 1 مل الثقافة للعديد من أنابيب 1.5 مل كردود فعل ليجاسى.
- تدور في 3,500 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من تحويل المخزن المؤقت (10 مل مرق ليسوجيني (رطل) مع 0.1 غ/مل البولي إيثيلين غليكول 3350، 5% ثنائي ميثيل سلفات و 20 مم مجكل2).
- إضافة ربط رد فعل، ووضع الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- صدمة الحرارة لمدة 2 دقيقة في 42 درجة مئوية.
- إضافة 1 مل رطل إلى أنابيب 1.5 مل، والسماح بالتعبير المظهرية مقاومة المضادات الحيوية لمدة 45 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية.
- تدور الخلايا في س 3,500 ز لمدة 5 دقائق وتجاهل 1 مل من المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في المادة طافية المتبقية.
- لوحة الخلايا على لوحات بالمضادات الحيوية المناسبة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- تحديد ترانسفورمانتس إيواء الناقلة مع الاندماج الناجح لإدراج الحمض النووي (مثلاً، عن طريق PCR باستخدام كبسولة تفجير ناقلات وإدراج محددة).
- التحقق من صحة تسلسل الحمض النووي قبل سانغر التسلسل.
تحذير: لا تستخدم كبسولة تفجير نفسه للتسلسل المستخدمة للخطوة 5.9.
6-استخدام ناقلات شيدت للتجارب في المختبر و/أو في الحية
- في تجربة فيفو
ملاحظة: هذا مثال على استخدام ناقل للتعبير عن نوع البرية/تحور الحمض النووي الريبي تميز التنظيم بوستترانسكريبشونال. لمزيد من التفاصيل عن النشاف الغربية، راجع8.- تنمو سلالات K12 كولاي مع ناقلات شيدت في المتوسط المناسبة وحمل التعبير إذا لزم الأمر. حصاد العينات باستخدام الطرد المركزي.
- إعداد العينات للصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) بإذابة الكريات الخلية في 1 × العازلة عينة الحزب الديمقراطي الصربي (62.5 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، 2.5% الحزب الديمقراطي الصربي، الأزرق bromophenol 0.002%، 5% β-mercaptoethanol، والغليسيرول 10%) ويغلي عند 95 درجة مئوية 5 دقيقة.
ملاحظة: من الممكن أن يلقي هلام أو استخدام هلام الخرسانة الجاهزة متوفرة تجارياً. واستخدمت هذه الأخيرة في النتائج المعروضة في الشكل 3 (جدول المواد). - تحميل خلايا7 10 لكل عينة في آبار منفصلة (تشمل سلم بروتين)، وتشغيل جل 200 الخامس حتى يتم فصل البروتينات (حوالي 45 دقيقة).
- لطخة البروتينات على غشاء السليولوز بنقل شبه الجاف في 80 mA ح 1.
- كتلة الغشاء بمزيج بروتينات (مثلاً 5%-مسحوق الحليب الذائبة في 1 x Tween 20-تريس مخزنة المالحة (تتبس) المخزن المؤقت).
- إضافة جسم الأولية (حله في المخزن المؤقت x TTBS 1) التي تستهدف البروتين للفائدة (مثلاً، التجارة والنقل-العلم-أو معلم له البروتين) واحتضانها ح 1 مع الانفعالات لطيف.
- يغسل الغشاء في x TTBS 1 لمدة 10 دقائق لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. كرر مرتين أكثر.
- إضافة جسم الثانوي (حله في المخزن المؤقت x TTBS 1) التي تستهدف الأجسام المضادة الأساسي والسماح للكشف (مثلاً، الفجل البيروكسيديز (HRP)-مترافق الأجسام المضادة الثانوية. احتضانها ح 1 مع الانفعالات لطيف.
- يغسل الغشاء في x TTBS 1 لمدة 10 دقائق لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. كرر مرتين أكثر.
- تصور الغشاء بأسلوب متوافق مع الأجسام المضادة الثانوية (مثلاً، عن طريق التصوير بعد الحضانة مع تشيميلومينيسسينسي لومينول-مشتقة، إذا كان يستخدم جسم ثانوي مترافق HRP).
- تجربة في المختبر
ملاحظة: هذا مثال على استخدام الناقل كقالب للنسخ في المختبر من الحمض النووي الريبي لوصف التفاعلات الحمض النووي الريبي من البروتين. لمزيد من التفاصيل عن أمسا، انظر9.- جعل النصوص في المختبر باستخدام T7 في المختبر النسخ كيت (جدول المواد) وناقلات من الخطوة 5 كقوالب.
- فصل النصوص الجيش الملكي النيبالي بالصفحة على يوريا 7 م 4.5% يشوه هلام، واستخراج الحمض النووي الريبي مباشرة من الجل شطف الكهربائية بأنابيب الغسيل الكلوي (جدول المواد).
- تسمية الحمض النووي الريبي (مثلاً، راديولابيلينج مع γ-32ف-ATP باستخدام T4-بولينوكليوتيدي كيناز (جدول المواد) وتنقية مرة أخرى مع الأعمدة (جدول المواد).
تنبيه: قبل العمل مع المواد المشعة، أن تتشاور مع مسؤول السلامة الإشعاعية المحلية. - مزيج الحمض النووي الريبي المسمى مع التركيزات المتزايدة للبروتين في ردود منفصلة في 1 × ربط المخزن المؤقت (20 ملم تريس، درجة الحموضة 8، 100 ملم بوكل، 1 مم مجكل2، ديثيوثريتول 1 مم (DTT)).
ملاحظة: في النتائج المعروضة (الشكل 4)، 2 نيوتن متر كسجد راديولابيليد مرناً كانت مختلطة بتدرج من 0 إلى 2 ميكرومتر هفق البروتين (تركيز مونومر). - السماح للبروتين والحمض النووي الريبي هجن قبل تحميل ميكس التهجين في جل polyacrylamide غير يشوه وتشغيل الهلام ل 1.5 ح 200 V.
- تصور الهلام بأسلوب متوافق مع العلامات من الخطوة 6.1.3. (مثلاً، عن طريق فوسفويماجينج إذا تم تطبيق راديولابيلينج).
- قياس كثافة نسبية للعصابات تحولت مع تصوير معالجة البرنامج وتناسب المنحنى (سيجمويدال) للبيانات باستخدام الرسم بياني، وبرامج تحليل البيانات (جدول المواد). استناداً إلى منحنى المجهزة، يمكن تحديد الانفصال المستمر (كد) القيم تلقائياً مع البرنامج.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي التفاعلات بشأن تنظيم بوستترانسكريبشونال كسجد، تم اختيار إعداد ناقلات مزدوجة: واحدة للتعبير عن كسجد مرناً وآخر للتعبير عن الصغيرة غير الترميز الجيش الملكي النيبالي، McaS. تم استنساخ كسجد في pBAD33، وبلازميد أرابينوز إيندوسيبلي متوسطة-نسخة مع المقاومة الكلورامفينيكول وتم استنساخ McaS إلى ميني R1 pNDM220، وبلازميد نسخة منخفضة إيندوسيبلي β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) الأيزوبروبيل مع الأمبيسلّين المقاومة. كان نوع البرية كسجد<...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
موقع الموجه الطفرات مجموعة واسعة من التطبيقات المختلفة، وهنا، أدرجت نتائج الممثل من المجراة في وتجربة في المختبر كأمثلة على كيفية جعل استنتاجات البيولوجية باستخدام هذه التقنية. وقد الطفرات الموجهة من موقع لفترة طويلة المعيار الذهبي لدراسات تفاعل الحمض النووي الريبي. وتكمن قوة هذه التقنية في الجمع بين إدخال طفرات ذات الصلة مع فحوصات المتلقين للمعلومات والتجارب (على سبيل المثال، لطخة غربية أو أمسا) استخلاص استنتاجات بشأن مواقع محددة من الحمض النووي وأهميتها في وظائف الجينات-المنتجات في سؤال. عند اتخاذ قرار بالقيام بالطفرات...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.
شكر وتقدير
المؤلف يود أن يشكر جامعة جنوب الدنمارك الوصول المفتوح سياسة المنح.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الجسم المضاد المضاد ل GroEL المنتج في الأرنب | Merck | G6532 | الجسم المضاد الأساسي |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel محطة عمل التصوير |
| DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | مقياس الطيف الضوئي لقياسات الحمض |
| تحميل هلام الحمض النووي (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| محلول بروميد الإيثيديوم 1٪ | كارل روث | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction | Kit Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA سلم مزيج | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | أنابيب غسيل الكلى للشطف الكهربائي |
| MEGAscript T7 طقم النسخ | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | نظام الرحلان الكهربائي الأفقي |
| الجسم المضاد أحادي النسيلة ANTI-FLAG M2 المنتج في الفأر | Merck | F3165 | الجسم المضاد الأولي |
| للفأر الغلوبولين المناعي | Dako Cytomation | P0447 | HRP مترافق الجسم المضاد |
| الثانوي NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | تنقية الحمض النووي الريبي |
| NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris Protein | Gels Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris Gels لفصل البروتين |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix مع HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC مصدر طاقة عالي التيار | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP مقترن الأجسام المضادة الثانوية |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph وأداة برمجيات تحليل البيانات |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR آلة |
| T4 DNA ligase | نيو إنجلاند Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 عديد النوكليوتيدات كيناز | نيو إنجلاند Biolabs | M0201S | |
| عازلة TAE (ثلاثي الأسيتات-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
المراجع
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
