يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التثبيت أفراد يعيش ايليجانس كاينورهابديتيس باستخدام رقاقة موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان أولتراثين إلكترونية مع "الاحتفاظ بالماء"

7.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59008

⸱

مارس 19, 2019

 ,  , 
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

في هذه المقالة

ملخص

تم إنشاء سلسلة من أساليب التثبيت للسماح تشعيع المستهدفة ليعيش ايليجانس كاينورهابديتيس الأفراد استخدام موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان رقيقة جداً وضعت مؤخرا رقاقة مع الاحتفاظ بالماء. هذا التثبيت على شريحة الرواية أيضا مناسبة للتصوير الملاحظات. يرد شرح معالجة مفصلة وأمثلة التطبيق للرقاقة.

الملخص

الإشعاع يستخدم على نطاق واسع للتطبيقات البيولوجية وتربية أيون-شعاع، ومن بين هذه الأساليب، تشعيع ميكروبيم يمثل وسيلة قوية لتحديد مواقع راديوسينسيتيفي في الكائنات الحية. وتصف هذه الورقة مجموعة من أساليب التثبيت على الرقاقة المتقدمة تشعيع ميكروبيم المستهدفة من الأفراد يعيشون من ايليجانس كاينورهابديتيس. جدير بالذكر أن معاملة رقائق موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) أننا سبق أن وضعت لشل C. ايليجانس الأفراد دون الحاجة للتخدير وهو شرح بالتفصيل. هذه الرقاقة، المشار إليها كورقة دودة، مرونة للسماح للقنوات موائع جزيئية لتوسيع نطاق، والمرونة يسمح الحيوانات أن يلفها بلطف. أيضا، نظراً لقدرة الامتزاز الذاتي PDMS، يمكن مختومة الحيوانات في القنوات التي تغطي سطح الورقة الدودة مع فيلم غطاء رقيقة، وفيها الحيوانات هي لا دفعت إلى القنوات للعلبة. بتحول الغلاف الفيلم أكثر، يمكننا بسهولة جمع الحيوانات. وعلاوة على ذلك، ورقة الدودة يظهر الاحتفاظ بالماء ويسمح للأفراد C. ايليجانس يخضعون للمراقبة المجهرية لفترات طويلة في ظروف العيش. وباﻹضافة إلى ذلك، الورقة هو فقط 300 ميكرون سميكة، مما يسمح لأيونات ثقيلة مثل أيونات الكربون لتمرير من خلال الورقة مرفقا بها الحيوانات، مما يسمح للجزيئات أيون أن يتم الكشف عن والجرعة الإشعاعية التطبيقية التي تقاس بدقة. لأن اختيار الأفلام غطاء يستخدم لإحاطة الحيوانات مهم جداً لنجاح التثبيت طويلة الأجل، نحن إجراء اختيار الأفلام تغطية مناسبة وأظهر أحد الموصى به بين بعض الأفلام. كمثال على تطبيق الرقاقة، قدمنا التصوير مراقبة أنشطة العضلات للحيوانات التي أرفق بها القناة موائع جزيئية الورقة دودة، فضلا عن تشعيع ميكروبيام. هذه الأمثلة تبين أن الأوراق دودة توسعت إلى حد كبير إمكانيات إجراء تجارب بيولوجية.

المقدمة

الإشعاع، بما في ذلك الأشعة السينية وأشعة غاما وأشعة أيونات ثقيلة، يستخدم على نطاق واسع للتطبيقات البيولوجية كما هو الحال في تشخيص مرض السرطان وعلاجه، وتربية أيون-شعاع. وتركز على آثار الإشعاع1،،من23حاليا العديد من الدراسات والتطورات التقنية. تشعيع ميكروبيام وسيلة قوية لتحديد مواقع راديوسينسيتيفي في معيشة الكائنات الحية4. تاكاساكي متقدمة الإشعاع بحوث المعهد من "المعاهد الوطنية" الكم و "العلوم الإشعاعية" والتكنولوجيا (QST-تاكاساكي) وقد تم تطوير تكنولوجيا تشعيع الخلايا الفردية تحت الملاحظة المجهرية باستخدام أيونات ثقيلة microbeams5، وأنشأت طرق لتمكين تشعيع ميكروبيام مستهدفة من العديد من الحيوانات النموذجية، مثل ديدان أسطوانية4، ايليجانس كاينورهابديتيس6،7من دود القز و Oryzias latipes (الميداكا اليابانية)8. تشعيع ميكروبيام المستهدفة من السلكية C. ايليجانس يسمح ضربة قاضية فعالة لمناطق محددة، مثل الحلقة العصبية في منطقة الرأس، مما يساعد على تحديد دور كل من هذه الأنظمة في عمليات مثل الحركة.

وقد وضعت طريقة للتثبيت على شريحة من الأفراد C. ايليجانس دون الحاجة للتخدير للسماح ل تشعيع ميكروبيام4. وبالإضافة إلى ذلك، تحسين موائع جزيئية الرقائق المستخدمة في الدراسة السابقة4، مؤخرا وضعنا رقائق موائع جزيئية قابل للبلل، وأيون-حدودية، بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، المشار إليها كدودة أوراق (انظر الجدول للمواد)، شل حركة الأفراد ايليجانس جيم- 9. تشمل هذه الأوراق الناعمة رقيقة جداً (سمك = 300 ميكرون؛ العرض = 15 مم؛ طول = 15 ملم) مع عدة قنوات موائع جزيئية مستقيمة (20 أو 25) (عمق = 70 ميكرومتر؛ العرض = 60 ميكرومتر أو 50 ميكرومتر؛ طول = 8 مم) على السطح (الشكل 1-د). قنوات موائع جزيئية مفتوحة والسماح للحيوانات متعددة إحاطتها لهم في نفس الوقت (الشكل 1ﻫ). الأوراق مرنة للسماح للقنوات موائع جزيئية لتوسيع (بواسطة ~ 10%، الرقم 1و)، وتسمح المرونة الحيوانات أن يلفها بلطف. أيضا، نظراً لقدرة الامتزاز الذاتي PDMS، يمكن مختومة الحيوانات في القنوات التي تغطي سطح الورقة الدودة مع فيلم غطاء رقيقة، وفيها الحيوانات هي لا دفعت إلى القنوات للعلبة. بتحول الغلاف الفيلم أكثر، يمكننا بسهولة جمع الحيوانات.

القنوات التي لا تؤذي الديدان عندما يجري المحاطة أو عند جمعها. وعلاوة على ذلك، الأوراق مصنوعة من PDMS، الذي أساسا مسعور، ولكن الاحتفاظ بالماء يمكن أن يتحقق بأساليب هيدروفيليسيتي للمواد. الاحتفاظ بالماء، وسمك خصائص مواتية للأوراق دودة. قدرة الاحتفاظ بالماء يمنع جفاف الحيوانات بعد التثبيت طويلة وتمكن الملاحظات الطويلة الأجل الاضطلاع.

وباﻹضافة إلى ذلك، كما هو موضح سابقا9، الأوراق هي فقط 300 ميكرون سميكة، مما يتيح الأيونات الثقيلة مثل أيونات الكربون (مع مجموعة من حوالي 1 ملم في المياه) بالمرور من خلال الورقة مرفقا بها الحيوانات. هذا يسمح للجزيئات أيون للكشف عنها والجرعة الإشعاعية التطبيقية التي تقاس بدقة. وعلاوة على ذلك، الأوراق الدودة يمكن إعادة استخدامها، ومن ثم اقتصادية. مع أسلوب الحقن التقليدية، الحيوانات محاطة بالميت في بعض الأحيان وأنها لا يمكن أن تؤخذ من القناة؛ ويمكن أيضا أن تسد بيضها القنوات. وهذا يجعل من شرائح غير قابل للاستخدام. رقائق وبالتالي تكون أساسا القابل للتصرف، والتكاليف والفوائد نسبة الفقراء.

في هذه الورقة، ونحن تصف بالتفصيل مجموعة من الأساليب للتثبيت على شريحة من العيش C. ايليجانس الأفراد استخدام أوراق دودة. من خلال فحوصات تنقل الحيوانات ح 3 بعد التثبيت على شريحة، يمكننا تقييم الفيلم تغطية مناسبة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أظهرت الأمثلة على التثبيت على شريحة للملاحظات التصوير والإشعاع ميكروبيم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-سلالات والصيانة

  1. حدد سلالة مناسبة C. ايليجانس و الإشريكيّة القولونية (المواد الغذائية) استناداً إلى غرض التجربة.
    ملاحظة: في هذه الورقة، يستخدم البرية من نوع N210C. ايليجانس (الشكل 2أ) عموما، و HBR4:goeIs3 [بميو-3::GCamP3.35::unc-54-3 ' utr, unc-119(+)] الخامس11 يستخدم فقط للتصوير المقايسة. كولاي OP50 كغذاء ل C. ايليجانس. بعض طفرات مع شكل الجسم غير طبيعية، مثل المسخ unc-119(e2498) الثالث بشكل ملفوف (الشكل 2ب)، كما يمكن إحاطتها بالقنوات موائع جزيئية على التوالي (الشكل 2-ج).
  2. الحفاظ على C. ايليجانس عند 20 درجة مئوية في 6 سم بيتري الأطباق التي تحتوي على 10 مل من نمو السلكية المتوسطة (NGM) أن انتشار المحتضنة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية) كولاي كما هو موضح سابقا10. إذا كان ذلك ممكناً، قم بمزامنة مرحلة C. ايليجانس بدءاً من مرحلة الجنين.
  3. استخدام جيدا تغذية الحيوانات الكبار، حوالي 3-4 أيام بعد الفقس بعرض حوالي 50-60 ميكرون، ومناسبة على النحو الأمثل لحجم قنوات موائع جزيئية في صحائف دودة.

2-اختيار الحل المخزن المؤقت للتثبيت على شريحة

  1. أوراق دودة قابل للبلل، استخدم أي حل المخزن المؤقت استناداً إلى الغرض من هذه التجارب.
    ملاحظة: الحلول المناسبة العازلة للتثبيت على شريحة على موائع جزيئية PDMS كانت رقائق تعرف سابقا9 وعرضت الحلول المخزن المؤقت التالية ليس لها أي أثر في حركية الحيوانات بعد التثبيت: S القاعدية المخزن المؤقت الحل (5.85 غرام من كلوريد الصوديوم، 1 مل من نسبة الكولسترول في الدم (5 ملغ/مل في الإيثانول)، 50 مل م 1 pH 6.0 البوتاسيوم الفوسفات، ح2س إلى 1 لتر؛ تعقيمها قبل التعقيم)10 التي تحتوي على كمية كبيرة من كلوريد الصوديوم، M9 الفوسفات المخزن المؤقت الحل (5 غ من كلوريد الصوديوم ، غ 3 خ2ص4، ز 6 غ2هبو4، 1 مل 1 م MgSO4، ح2س إلى 1 لتر؛ تعقيم بالتعقيم)10، والمياه والصرف الصحي المخزن المؤقت الحل (5 مل فوسفات البوتاسيوم pH 6.0 م 1، 1 مل 1 م كاكل2، 1 مل 1 م MgSO4، ز 0.5 pf الجيلاتين، ح2س إلى 1 لتر؛ تعقيمها قبل التعقيم)12 التي تحتوي على الجيلاتين ، والماء عالي النقاوة9. في هذه الورقة، عادة ما يتم استخدام الحل المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، و S القاعدية المخزن المؤقت الحل يعمل فقط لتقييم التثبيت على شريحة باستخدام الأفلام غلاف مختلفة في القسم 3.
  2. لرقائق موائع جزيئية التقليدية دون ويتابيليتي، استخدام حل المخزن مؤقت للمياه والصرف الصحي، الذي يوفر الوسائل الأكثر فعالية للحفاظ على رطوبة في قنوات الرقاقة موائع جزيئية وهكذا يمنع تجفيف C. ايليجانس الأفراد ( بغض النظر عن ويتابيليتي رقائق موائع جزيئية).

3-اختيار الفيلم تغطية مناسبة للتثبيت على شريحة

  1. إعداد أفلام غلاف مختلفة على النحو التالي. استناداً إلى سهولة المناولة، قطع ما يلي شفافة، أفلام غطاء متوافق حيويا لحجم مناسب (أي، عرض 10-15 مم وطولها من 30-50 مم): 130-170 الزجاج غطاء سميك ميكرومتر، 125 ميكرومتر سميكة البوليستر (الحيوانات الأليفة) الفيلم، و ~ 130 ميكرومتر سميكة البوليستيرين (PS) الفيلم.
  2. إجراء التثبيت على شريحة ح 3 استخدام الأفلام غلاف مختلفة على النحو التالي. تستند الخطوات 4.1-4.6، أرفق إيه وان زيرو غسلها الكبار الحيوانات (3.5 أيام بعد الفقس) في ورقة الدودة استخدام كل فيلم الغلاف، على التوالي، وترك ح 3.
  3. ولأغراض المقارنة، تسمح ح 3 حرية التنقل على النحو التالي. إيه وان زيرو مكان تغسل الحيوانات الكبار على صفيحة 3.5 سم تحتوي على 3 مل NGM الطازجة، وتغطي بغطاء ويغادر إلى ح 3.
  4. جمع الحيوانات مباشرة بعد 3 ح للتثبيت على الرقاقة وفقا للخطوات 5.1 5.3. إزالة الفيلم الغطاء من الورقة دودة وإضافة قطره من المخزن المؤقت الحل لكل الحيوانات. التقاط الحيوانات السباحة في الحبرية استخدام منتقي البلاتين ونقلها إلى لوحة 3.5 سم تحتوي على 3 مل NGM جديدة دون طعام (لوحة الفحص).
  5. جمع الحيوانات بعد ح 3 من حرية الحركة. إضافة قطره من المخزن المؤقت الحل لكل الحيوانات. التقاط الحيوانات السباحة في الحبرية على لوحة NGM ونقلها إلى لوحة فحص استخدام منتقي البلاتين.
  6. تقييم آثار الفيلم الغطاء على حركية (مقايسة الحركة).
    1. مدة 5 دقائق على الأقل بعد نقل إلى لوحة المقايسة، عد ' الجسم الانحناءات (defined كعدد الانحناءات في منطقة الجسم الأمامي على فترات 20-s) يدوياً تحت مجهر13.
    2. القيام بفحوصات الحركة خمس مرات بشكل مستقل لكل فيلم الغطاء.
      ملاحظة: في التجارب التي تظهر في نتائج تمثيلية، جرى تقييم الحيوانات 10 لكل التجربة التي الحيوانات متعددة تم إحاطتها في نفس الوقت، مقارنة مع خمسة فقط الحيوانات عدها في الدراسة السابقة13.
    3. حساب متوسط عدد الانحناءات الجسم للحيوانات 10 في كل مجموعة لكل تجربة. ثم متوسط القيم من خمس تجارب مستقلة لتقييم effects للتثبيت على شريحة. تحليل البيانات إحصائيا باستخدام اختبار تحليل تباين أحادي اتجاه (ANOVA) في برنامج جدول بيانات على المستويات أهمية من 0.01 و 0.05.
      ملاحظة: تستند هذه التجارب، فيلم غطاء PS مع نفاذية الأكسجين المرتفعة كانت تعتبر مناسبة (انظر نتائج تمثيلية). وترد هذه الأفلام PS مع أوراق دودة. فيلم الحيوانات الأليفة، التي لديها نفاذية منخفضة الأكسجين، وكان لا تعتبر مناسبة لأن الحيوانات تميل إلى خنق إذا كانت مغطاة بأنه أثناء التثبيت طويلة الأجل على صحائف دودة. من المهم أيضا أن لا يكسر الفيلم الغطاء أثناء سلسلة من الإجراءات؛ يغطي الزجاج بالتالي أيضا غير مناسب (انظر نتائج تمثيلية).

4-تجميد على رقاقة

ملاحظة: يجب أن تلبس القفازات المعقمة، والمتاح لتجنب تلويث الأوراق دودة.

  1. ضع ورقة شفافة رقيقة مثل فيلم غطاء PS أو الزجاج الذي قد لا أوتوفلوريسسينسي، لاستخدامها كفيلم غطاء السفلي، على مكتب التجريبية أو مرحلة مجهرية. ضع ورقة دودة بلطف على الفيلم الغطاء السفلي باستخدام الملقط مسطحة.
    ملاحظة: بالإضافة إلى أوراق الدودة مع 60 قنوات موائع جزيئية على صعيد ميكرومتر (مناسبة للكبار 3-4 أيام بعد الفقس)، أوراق مع 50 ميكرومتر المنظومة قنوات (مناسبة لصغار البالغين 3 أيام بعد الفقس، وطفرات مع هيئة صغيرة في مرحلة الكبار) يمكن أيضا أن تستخدم. حدد ورقة مناسبة استناداً إلى حجم الحيوانات لاستخدامها.
  2. جمع الحيوانات وتلتقط الكبار فردية C. ايليجانس من لوحة الثقافة تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام منتقي البلاتين. كرر هذه العملية إذا كانت هناك حاجة إلى الحيوانات متعددة.
  3. غسل الحيوانات لإزالة المواد الغذائية (البكتيريا).
    1. ضع قطرات ثلاثة على الأقل (5 ميليلتر قطرات) من المخزن المؤقت الحل على السطح من 6 سم غير المعالجة (طارد المياه) بيتري طبق.
    2. نقل الحيوانات إلى الحبرية استخدام منتقي البلاتين والسماح لهم بإزالة أي طعام من السباحة. غسلها مرتين في قطرات منفصلة اثنين، ومن ثم شطف الحيوانات في آخر قطره.
      ملاحظة: من الضروري ممارسة هذا الإجراء لتكون قادرة على القيام بذلك بسرعة قبل القيام بأي تجارب.
  4. 2-3 ميليلتر من محلول المخزن المؤقت على سطح ورقة الدودة الإفلات. التقاط الحيوانات غسلها من الحبرية على طبق بيتري ونقلها إلى الحبرية على الورقة دودة.
  5. ضع الحيوانات في قنوات موائع جزيئية كما يلي. ضع فيلم غطاء PS على الورقة دودة استخدام الملقط مسطحة، واضغط برفق عبر القنوات من نهاية واحد من الورقة إلى أخرى للحفاظ على رطوبة (كما تم وصفه سابقا4،9).
    ملاحظة: ترفق الحيوانات عشوائياً في القنوات. قطرات تحتوي على الحيوانات تنتشر عبر ورقة الدودة التي تغطي الورقة، أسفر عن قطرات يجري على نطاق واسع تمتد عبر عدة قنوات. يمكن أن تكون محاطة كل الحيوانات في أي واحدة من هذه القنوات. والنقطة الهامة فيما يتعلق باستخدام الورقة دودة للتثبيت على شريحة أن تتوفر قنوات متعددة على امتداد منطقة واسعة.
  6. فورا بعد إحاطة الحيوانات في قنوات موائع جزيئية، تؤكد أنهم على قيد الحياة عن طريق فحص لحركة الرأس تحت مجهر (مثلاً، 1 x أو التكبير x 2).
  7. تسجيل موقف الحيوان، وفي الوقت نفسه كالقيام بالخطوة 4، 6، وملاحظة ما يلي على ورقة مخصصة (1 ملف تكميلي): رقم القناة الذي تم تضمينه الحيوان؛ موقف كل حيوان في القناة (يسار/مركز/يمين)؛ واتجاه الرأس.
  8. رسم سهم وضع علامة على موضع كل حيوان في القناة، مع اتجاه السهم المقابل لرأس الحيوان.
    ملاحظة: الأرقام قناة (مثلاً، 1، 5، 10، 15، 20، 25) محفورة على سطح الورقة دودة قرب الحواف اليمنى واليسرى من القنوات موائع جزيئية (الشكل 1ب). هذه المعلومات على ورقة مخصص يسمح الحيوانات تكون موجودة بسرعة، مما يجعل العملية أكثر كفاءة، وأيضا يساعد على منع تسرب الإشعاع أثناء الخطوات اللاحقة.

5-مجموعة من الحيوانات من ورقة الدودة

  1. مباشرة بعد التثبيت، إزالة الفيلم الغطاء من الورقة دودة استخدام الملقط مسطحة.
  2. إسقاط 10-15 ميليلتر محلول المخزن المؤقت على موائع جزيئية القنوات مرفقا بها الحيوانات ومراقبة الحيوانات بدأت تسبح في القطرات تحت ستيريوميكروسكوبي.
    ملاحظة: الحيوانات تبدأ السباحة في الحبرية الجديدة بهم دون أي ضغوط إضافية أو مساعدة أو دفع. مجرد إسقاط بعض العازلة فوقهم ما يكفي لجعلها تسبح خارج القناة. حيوان قد يكون غير قادر على السباحة في معالجة تجميعية إذا قد تم تلف حيوية تشعيع في خطوة 7.9 أو بواسطة عملية التثبيت في الخطوات 4، 2-4-5، على الرغم من أن هذا أمر نادر الحدوث. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان الحيوان تظل متمسكة بالفيلم الغطاء عند إزالته، إضافة القطرات على غلاف الفيلم بدلاً من القنوات.
  3. التقاط الحيوانات السباحة في الحبرية استخدام منتقي البلاتين ووضعها على صفيحة مقايسة.

6-تطبيق أوراق دودة للتصوير الملاحظات

ملاحظة: يمكن دودة أوراق في الملاحظات المجهرية على نطاق واسع. الرقاقة يمكن الاحتفاظ بالمياه، ولا تؤثر في حركية الأفراد C. ايليجانس بعد 3 ح للتثبيت على شريحة9. وبالإضافة إلى ذلك، قد رقاقة نفسها لا أوتوفلوريسسينسي، يجعلها مناسبة للاستخدام في الأسفار التصوير فحوصات. ويرد أدناه تطبيق نموذج للمقايسة التصوير الأسفار.

  1. حدد مجهر الأسفار وجبل الكاميرا الرقمية أو كاميرا الفيديو الرقمية في المجهر لالتقاط الصور أو ملفات الفيديو، على التوالي (الشكل 3أ).
    ملاحظة: أن العامل (WD) مجهر مسافة أكثر من 0.2 مم تبعاً لمواصفات العدسة الهدف (انظر الشكل 3ب، ج). ويرد في الجدول للموادمواصفات النظام مجهر الأسفار المستخدمة في هذه الورقة. غير أن المواصفات لا يقتصر على المثال الخاص بنا لأنه يعتمد على غرض المراقبة أو/والمستخدمين.
  2. حدد أي سلالة C. ايليجانس الفلورسنت والحفاظ على النحو الوارد في الفرع 1.
    ملاحظة: إذا كان من الضروري أن نلاحظ انكماش العضلات في جدار الجسم (انظر نتائج الممثل)، استخدام الشباب البالغين HBR411C. ايليجانس، التي يستخدم فيها جينات مراسل للتعبير عن المؤشر الكالسيوم GCaMP3.35 في جميع خلايا العضلات في جدار الجسم. من المهم استخدام الشباب (دي ثري يوم بعد الفقس) التي أرق من عرض القنوات موائع جزيئية (50 أو 60 ميكرومتر) ورقة الدودة. يعني درجة صغيرة لإزالة الألغام أن الحيوانات يمكن أن ينحني قليلاً، مما يجعل من الممكن لمراقبة انكماش العضلات والإرشاد أثناء عملية تتبع الارتباطات، باستخدام مؤشر أيون كالسيوم.
  3. الاضطلاع بالعلبة حيوانات وفقا لإجراءات التثبيت في القسم 4.
  4. مراقبة البقع الفلورسنت من الحيوانات (مثلاً، أخضر نيون البروتين المسمى سلالات) باستخدام مجهر الأسفار، والتقاط الصور باستخدام كاميرا رقمية التي شنت على المجهر.
    ملاحظة: اتبع الأساليب المتبعة سابقا14،15،16، منذ أساليب المراقبة المجهر (بما في ذلك المراقبة الأسفار) ومواصفات النظام مجهر يعتمد على والغرض من هذه الملاحظة.
  5. صورة أيون الكالسيوم انتشار الموجات باستخدام الحصول على الفيديو لمراقبة الأنشطة الحيوية، مثل تقلص العضلات جدار الجسم وملحق في الديدان HBR4 (1 فيديو).

7-تطبيق أوراق الدودة تشعيع ميكروبيم

ملاحظة: يمكن استخدام نظام تشعيع ميكروبيام كوليماتينج5 الجسيمات الثقيلة أيون عدة تسارع من سيكلوترون الميدانية متفاوتة أزيموثاللي المثبتة في "المسرعات أيون تاكاساكي" لمرفق تطبيق الإشعاع المتقدم (تيارا) من QST-تاكاساكي (الشكل 4أ). وهناك مرحلة تلقائية التشعيع تحت خروج الشعاع (الشكل 4ب). الإجراء الخاص تشعيع ميكروبيم الثقيلة-أيون C. ايليجانس باستخدام هذا النظام على النحو التالي.

  1. تحديد موقع ورقة الدودة أرفق الحيوانات متعددة في إطار ألومنيوم مصنوعة خصيصا لمرفق microbeam-التشعيع ووضعه على المسرح التلقائي التشعيع (الشكل 4ج).
  2. رفع العينة التشعيع (أي، الحيوانات محاطة بورقة دودة على إطار)، إلى مباشرة تحت الخروج (~ 2 مم) الشعاع استناداً إلى صورة الشاشة من مجهر الموجودة ضمن مرحلة التلقائية (الشكل 4د).
  3. بعد الموضع العمودي، حدد موقع كل الحيوانات إلى الهدف مع تشعيع ميكروبيم باستخدام البرمجيات مصنوعة خصيصا تشعيع الحيوانات والثقافات الخلية المستهدفة. لتحديد موقع كل الحيوانات المغلقة في القناة موائع جزيئية، الرجوع إلى الورقة مكرسة الموصوفة في الخطوة 4.7-4.8 (انظر 1 ملف تكميلي) وتأكيد رقم القناة قرب الحواف اليمنى واليسرى من القنوات.
  4. التحكم في مرحلة التلقائية في X واتجاهات Y لوضع الحيوانات تحت الشعاع الخروج باستخدام نظام التحكم وماوس ليزر تعمل مع البرمجيات التشعيع.
  5. تقريبا اللحن منطقة التشعيع بمشاهدة العرض من المجهر الموجودة ضمن مرحلة التلقائية للعينة، وتحريك المؤشر إلى الموضع تشعيع الحيوانات هدفا.
  6. بعد تحديد المواقع الخام، إنهاء وإغلاق الغرفة التشعيع والانتقال إلى غرفة المراقبة المجاورة لتجنب الإشعاعية المشغلين.
  7. تعيين العدد المطلوب من الجزيئات أيون لواحد التشعيع الداخلي، المقابلة للإشعاع لمنطقة معينة من الحيوان، باستخدام وحدة التحكم المرتبطة بنظام لايون-العداد.
    ملاحظة: هذا يتكون من سسينتيلاتور بلاستيك ومضاعف النانومترية في النظام تشعيع ميكروبيم كوليماتينج.
  8. من غرفة التحكم التشعيع، ضبط موضع الحيوانات استناداً إلى صورة الشاشة من المجهر الموجودة ضمن مرحلة التلقائية، وهي نفس الصورة المسقطة على جهاز العرض في قاعة التشعيع (الشكل 4ه).
  9. استهداف تشعيع ميكروبيم عن طريق النقر على زر تشعيع للبرمجيات التشعيع.
    ملاحظة: في المثال المبين في الشكل 4و، نحن استهداف البلعوم في منطقة الرأس ويتهددها بالعدد المناسب من أيونات الكربون ميكروبيام. حيث أنه يتم حساب عدد الجسيمات أيون مرورا بالعينة باستخدام نظام عداد أيون مرتبطة بوحدة التحكم والبرمجيات التشعيع، توقفت التشعيع بعد التسليم بالعدد المطلوب من الجزيئات أيون.
  10. حدد موقع كل الحيوانات المسجلة على الورقة المخصصة والاضطلاع تشعيع المستهدفة لكل الحيوانات. كرر الخطوات من 7.8 و 7.9 حتى قد تم المشع جميع الحيوانات.
  11. فورا بعد التشعيع، أدخل الغرفة التشعيع وأدنى مرحلة الإشعاع التلقائي. إزالة عينة على الإطار مصنوعة خصيصا تقع على المسرح التلقائي.
  12. جمع الحيوانات كما هو موضح في الخطوات 5.1 5.3.
  13. القيام بالتحليلات السلوكية و/أو الجزيئية كما هو مطلوب لتقييم آثار تشعيع المستهدفة، تبعاً لغرض الدراسة.
    ملاحظة: تحليل الحركة الموضحة في الخطوة 3، 6 وسيلة فعالة لتقييم آثار الإشعاع على حركية4،9.

8-معاملة دودة أوراق للاستخدام المتكرر

ملاحظة: يمكن أن تكون أوراق الدودة تستخدم مرارا وتكرارا من 10 مرات على الأقل9 مع أي آثار سلبية على الحيوانات إذا تنظيفها وتعقيمها بشكل صحيح بعد استخدام كما يلي.

  1. التنظيف
    1. ضع ورقة الدودة المستخدمة على سم 6 طبق بيتري وقطره حوالي 100 ميليلتر من الماء المعقم عالي النقاوة على ورقة كاملة.
    2. مجداف الماء على سطح الورقة باستخدام القفاز أصابع يغسل الاوساخ مثل الغبار والمواد الغذائية البكتيرية وأي البيض وضعت في القنوات.
    3. يمسح الرطوبة خارج الورقة دودة دقة باستخدام المسحات يمكن التخلص منها.
  2. التعقيم
    1. ضخ حوالي 5 مل إيثانول 70% في طبق بتري يحتوي على ورقة الدودة ومجداف سطح الورقة باستخدام أصابع القفاز ليغسل التراب.
  3. تجفيف
    1. إزالة الرقائق من طبق بيتري مليئة الإيثانول 70% والسماح ليجف طبيعيا.
  4. تخزين
    1. بعد التجفيف، ضع ورقة الدودة على طبق بتري معقم وتغطية ذلك. يمكن أيضا تخزين أوراق على طبق بتري معقم مليئة إيثانول 70%.
      ملاحظة: من الأفضل التخلص من الأفلام الغطاء بعد استخدامها، ولكن إذا أريد لها أن تكون إعادة استخدامها، تنظيفها كما فعلت لكشف الفيروس المتنقل. بيد إذا وضع الطيات على الفيلم الغطاء بعد استخدام أنها ستلتزم لم يعد إلى شرائح، أسفر جفاف الحيوانات، والاستعاضة عنها لذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نشاط الأفراد C. ايليجانس يمكن أن تكون معطلة بنجاح باستخدام PDMS رقيقة جداً، وقابل للبلل، رقاقة موائع جزيئية (دودة ورقة). نحن التحقيق في مدى ملاءمة الأفلام تغطية مختلفة لختم الورقة دودة، كما هو موصوف في المادة 3 من البروتوكول. لتقييم آثار الختم من الأفلام الغطاء، عقدنا العزم حركية الحيوانات ح 3 بعد التثبيت على شريحة باستخدام الزجاج غطاء (سمك: ميكرون 130-170)، فيلم الحيوانات الأليفة (سمك: 125 ميكرومتر)، والفيلم PS (سمك: ~ 130 ميكرومتر)، على التوالي. كما هو موضح في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تمكين التثبيت على شريحة من C. ايليجانس تحت ظروف العيش باستخدام رقاقة موائع جزيئية PDMS قابل للبلل تشعيع ميكروبيم الكفاءة المستهدفة للحيوانات متعددة. سهولة المناولة والميزات لمنع تجفيف جعل هذا النظام مناسب للتطبيقات في تشعيع ميكروبيم، بل أيضا في العديد من الاختبارات السلوكية. هذه الأوراق دودة الفعل تم تسويقها تجارياً ويمكن الحصول عليها بسهولة. رقائق موائع جزيئية التقليدية، مثل رقائق حاسة الشم، وترتبط بالمشاكل بما في ذلك انسداد الحيوانات والبيض في قنوات موائع جزيئية مغلقة مما يجعل من الصعب على جمع الحيوانات، وهكذا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الدكتور أتسوشي هيجاشيتاني لنوع المشورة فيما يتعلق بمعاملة C. ايليجانس والدكتور يويا هاتوري ويوكوتا يويشيرو كوباياشي ياشوهيكو للمناقشات القيمة. يشكر المؤلفون كاينورهابديتيس الوراثية مركز توفير سلالات ايليجانس جيم و هاء القولونية. ونحن نشكر طاقم سيكلوترون تيارا في تاكاساكي QST على مساعدتهم الطيبة مع تجارب التشعيع. ونحن نشكر الدكتور سوزان فورنس لتحرير مسودة لهذه المخطوطة. هذه الدراسة وأيده في جزء كاكينهي (منحة الأرقام JP15K11921 و JP18K18839) من JSPS لماجستير

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
C. ايليجانس < / em> سلالة من النوع البريمركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكيةN2سلالة من النوع البري C. elegans< / em> سلالة تستخدم بشكل عام في هذه الدراسة
C. elegans unc-119 (e2498) III < / em> السلالة الطافرةCaenorhabditis مركز علم الوراثة (CGC) ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكيةCB4845C. ايليجانس< / إم> سلالة تستخدم فقط كمثال على المسوخ ذات شكل الجسم غير الطبيعي 
C. ايليجانس سلالة معدلة وراثيا< / em> HBR4مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC) ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكيةHBR4النمط الجيني لهذه السلالة المعدلة وراثيا C. elegans< / em> هو HBR4: goeIs3 [pmyo-3:: GCamP3.35:: unc-54 & ndash; 3 ' utr ، unc-119 (+)] V< / em >. تم استخدام هذه السلالة فقط لمراقبة التصوير.
بكتريا القولونية سلالة < / em>مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC) ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكيةOP50 E. القولونية < / em> سلالة تستخدم كغذاء ل C. elegans< / em>
ورقة الدودة IR (50/60)Biocosm، Inc. ، Hyogo ، اليابانBCM17-0001رقاقة Microfluidic مع 25 مستقيما 50/60-& micro ؛ قنوات عرض m المستخدمة في جميع التجارب والملاحظة في هذه الورقة  
ورقة الدودة 60Biocosm، Inc. ، هيوغو ، اليابانBCM18-0001رقاقة Microfluidic مع 20 مستقيما 60 & micro ؛ قنوات عرض M. هذا مناسب للبالغين بعد 3-5 أيام من الفقس عند 20 درجة مئوية ؛
ورقة الدودة 50Biocosm، Inc. ، Hyogo ، اليابانBCM18-0002رقاقة Microfluidic مع 20 مستقيما 50 & micro ؛ قنوات عرض M. هذا مناسب للبالغين ~ 3 أيام بعد الفقس عند 20 درجة مئوية ؛
صغير زجاجماتسونامي للزجاج الصناعي المحدودةC030401غطاء الزجاج (السماكة: 130-170 وميكرو ؛ م) المستخدمة في فحوصات الحركة في البروتوكول 3
Polystyrene FilmBiocosm، Inc. ، Hyogo ، اليابانBCM18-0001 / BCM18-0002العناصر المجمعة من صفائح الدودة. PS filim (السماكة: ~ 130 & micro; م) المستخدمة في فحوصات الحركة في البروتوكول 3.
فيلم البوليستر LumirrorTORAY INDUSTRIES، INC. ، طوكيو ، اليابانLumirror T60 (t 125 & micro ؛ م)PET filim (السماكة: 125 ومايكرو ؛ م) تستخدم في فحوصات الحركة في البروتوكول 3
IWAKI 60 مم / طبق غير معالجAGC Techno Glass Co.، Ltd. ، Shizuoka ، اليابان).1010-060طبق غير معالج يستخدم في تركيب C. elegans< / em> في البروتوكول 1
IWAKI 35 مم / طبق غير معالجAGC Techno Glass Co.، Ltd. ، Shizuoka ، اليابان).1010-035طبق غير معالج يستخدم في فحوصات الحركة في البروتوكول 3
Milli-QMerck ، فرنساالمياه فائقة النقاء
Kimwipe S-200Nippon Paper Crecia Co.، Ltd. ، طوكيو ، اليابان62020120 مم × 215 مم ؛ 200 ورقة / صندوق
WormStuff Worm PickGenesee Scientific Corporation ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)59-AWPمنتقي Platina مخصص لالتقاط C. elegans< / em>
نظام مجهر ستيريوبحثي OLYMPUS CORPORATION ، طوكيو ، اليابانSZX16Micriscope المستخدم في جميع التجارب والملاحظات في هذه الورقة
حامل التركيز الآلي لشركة SZX16OLYMPUS CORPORATION ، طوكيو ، اليابانSZX2-ILLBتم استخدام هذا لمراقبة المجال الساطع في البروتوكول 3-8.
عدسة موضوعية (& 1)شركة أوليمبوس ، طوكيو ، اليابانSDFPLAPO1 وتايمز ؛ PFNA: 0.15 ؛ WD: 60 ملم. وقد استخدمت هذه الإعارة لرصد المجال الساطع في البروتوكول 3-8.
عدسة موضوعية (& 2)شركة أوليمبوس ، طوكيو ، اليابانSDFPLAPO2XPFCNA: 0.3 ؛ WD: 20 ملم. هذا  تم استخدام الإقراض لملاحظات التصوير.
مصدر ضوء الزئبقOLYMPUS CORPORATION ، طوكيو ، اليابانU-LH100HGيتيح طيف الانبعاثات الواسع إجراء مجموعة من تجارب التصوير الفلوري باستخدام جميع الفلوروفورات الشائعة.
وحدة مرشح الفلورسنت SZX16 (عالية الأداء ل YFP)OLYMPUS CORPORATION ، طوكيو ، اليابانSZX2-FYFPHQEx: 490-500 نانومتر ؛ EM: 510-560. تم استخدام هذا لمراقبة تصوير سلالة HBR4.
كاميرا رقمية عالية السرعة EXILIMCASIO COMPUTER CO., Ltd, طوكيو, اليابانEX-F1 الشكل 1B, 1E, 1F, الشكل 2A-C, والفيديو 1 تم الحصول عليها باستخدام هذه الكاميرا الرقمية.
Office 2013Microsoft Co. Ltd ، ريدموند ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكيةبرنامج Excel المستخدم في التحليلات الإحصائية
غطاء

المراجع

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التثبيت أفراد يعيش ايليجانس كاينورهابديتيس باستخدام رقاقة موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان أولتراثين إلكترونية مع "الاحتفاظ بالماء"
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.