يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الثقافة الأولية من خلايا الفئران البطاني وفحوصات لوظائف ستيرويدوجينيك

8.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59016

⸱

مارس 12, 2019

 , 
1Graduate Institute of Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, 2Department of Anatomy, School of Medicine, Kaohsiung Medical University, 3Department of Cell Biology and Anatomy, College of Medicine, National Cheng Kung University

في هذه المقالة

ملخص

هرمون يفرز من قشرة الغدة الكظرية حيوية بالنسبة للحيوانات ضد الإجهاد والأمراض. وهنا نقدم بروتوكولا لثقافة الفئران الابتدائي خلايا الغدة الكظرية. يمكن أن يكون منبرا جيدا في المختبر للتحقيق في آليات كاشف الفائدة في الغدة الكظرية ستيرويدوجينيسيس والحيوي الدهن.

الملخص

الهرمونات التي تفرز قشرة الغدة الكظرية حيوية بالنسبة للحيوانات ضد الإجهاد والأمراض. الأسلوب الموصوفة هنا هو الإجراء من خلايا الغدة الكظرية الأولية الفئران مثقف والاختبارات الوظيفية ذات الصلة (الفلورة تلطيخ الدهني الحبرية البروتين السطحية، فضلا عن تحليل القشري). خلافا لنموذج في الحية، وتفاوت إينتيريكسبيريمينتس في ثقافات أحادي الطبقة الغدة الكظرية أقل وحالة تجريبية من السهل التحكم. وعلاوة على ذلك، أيضا مصدر للفئران أكثر استقرارا من غيرها من الحيوانات مثل الأبقار منها. وهناك أيضا عدة خطوط الخلايا البشرية الغدة الكظرية (NCI-H295، NCI-H295R، SW13، إلخ) التي يمكن استخدامها في الدراسات الغدة الكظرية. بيد سيتأثر إنتاج المنشطات من هذه الخطوط لا تزال بعوامل عديدة، والتي تشمل رقم الشحنة المصل، رقم مرور المسخ/فقدان الجينات متميزة، إلخ. باستثناء تفتقر إلى 17α-hydroxylase، ثقافة الفئران البطاني الخلايا الأولية تقنية أفضل وأكثر ملاءمة لدراسة فيزيولوجيا الغدة الكظرية. وباختصار، يمكن الثقافات الغدة الكظرية الأولية الفئران منصة في المختبر جيدة للباحثين للتحقيق في آليات الكاشف للفائدة في نظام الغدة الكظرية.

المقدمة

نظام الغدد الصماء المسؤولة عن تنظيم الأنشطة الفسيولوجية والتوازن1. الغدد الكظرية الموجودة في القطب الجمجمة الكلي هي أحد الأجهزة الرئيسية الغدد الصماء التي تفرز مينيرالوكورتيكويدس والكورتيزون الاندروجين2،3. هناك اثنين من الأجزاء المميزة في الغدة الكظرية: القشرة ولب. قشرة الغدة الكظرية تتكون من ثلاث طبقات: glomerulosa الخارجي، فاسسيكولاتا المتوسط، و قد الداخلية3. جلوميرولوسا زونا هو موقع المبيضي الأصلي الدوستيرون، مينيرالوكورتيكويد، الذي يساعد في استيعاب أيون الصوديوم والماء في الكلي3. وتنتج فاسسيكولاتا زونا أساسا مستوى القاعدي الكورتيزون في الظروف الفسيولوجية العادية3. القشرية في القوارض وهرمون الكورتيزول في قانون البشر مساعدة الهيئة في التعامل مع الإجهاد بتنظيم الجلوكوز في الدم3. إلى حد ما، أنها تمنع الردود التحريضية وتنظيم الجهاز المناعي4،5. خلافا لغيرها من الثدييات، والفئران والجرذان لا تملك قد زونا فنية نظراً لعدم وجود تعبير 17α-hydroxylase في6،الغدة الكظرية7. وهكذا، الغدة الكظرية من الفئران والجرذان تخلو من إفراز الغدة الكظرية C-19 المنشطات (هرمون الكورتيزول ومنشطات الغدة الكظرية).

خلايا البطاني مثقف الأولية أظهرت أن تكون مفيدة للتحقيق في آليات مراقبة فيزيولوجيا الغدة الكظرية8. مثل الأنسجة الأخرى ستيرويدوجينيك، يجمع كل منطقة الغدة الكظرية المنشطات من الكوليسترول الحرة9. عند تنشيط هرمون ﻫﺭﻣﻭﻧ (ACTH)، الكوليسترول الحر أطلق سراحه من قطرات الدهن انهيار، وهكذا، يعزز إنتاج الستيرويد في فاسسيكولاتا وقد10.

وحاولت العديد من المجموعات إنشاء خطوط الخلايا مستقرة من الأورام السرطانية البطاني. ومع ذلك، العديد من الشواغل محدودة استخدام خطوط الخلية البطاني كما هو الحال في المختبر نماذج8. قد تختلف الردود ستيرويد من خطوط الخلايا بين الممرات، والعدد الكثير من المصل، ونوعية المصل، إلخ. وعلاوة على ذلك، خطوط خلايا الغدة الكظرية التجارية (Y1 و SW13) لا تفرز القشري، مما يجعل من الصعب أكثر دراسة الغدة الكظرية ستيرويدوجينيسيس8. استخدام الغدة الكظرية الأبقار والخيول كما السابقين فيفو نماذج قد يكون اختياراً جيدا، على الرغم من الأنسجة من هذه الأسواق قد يحجب بعض المخاطر غير معروف. مقارنة لهم، إدارة الغدد الكظرية الجرذ أسهل والمصدر نسبيا أكثر استقرارا وخالية من مسببات الأمراض. أخذت معا، يمكن استخدام هذا الأسلوب الموصوفة هنا للتحقيق ذات الصلة إليه التوليف القشري في خلايا الغدة الكظرية فاسسيكولاتا الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

عليها جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة كاوشيونغ الطبية الجامعية.

1-الإجراء التجريبية

  1. التضحية الفئران SD الإناث والذكور البالغين (8 إلى 12 أسبوع من العمر) بالقتل الرحيم2 CO.
  2. تطبيق الإيثانول 70% والسماح لها يتم استيعابهم في الجلد ومن ثم مسح الجلد بورقة الأنسجة.
  3. وضعت الفئران في صفيحة بلاستيكية نظيفة في موقف ضعيف.
  4. رفع الجلد مع الملقط منحنى "الخارجية" في خط الوسط والقيام تشريح كليلة بإنشاء شكل "Y" (من مستوى الفخذ للزاوية سوبكوستال).
    1. شطف مقص مع الإيثانول 70%، وثم قطع العضلات، أيضا إنشاء شكل "Y".
  5. البحث عن الغدة الكظرية اليسرى خلف المعدة.
    ملاحظة:     يمكن العثور على الغدة الكظرية اليمنى العميق وراء الكبد.
    1. استخدام زوج واحد من الملقط لرفع المعدة أو الكبد وعزل الغدة الكظرية مع الملقط منحنى آخر.
  6. بعد وضع الغدد الكظرية في طبق عقيمة، بعناية إزالة الكبسولة الغدة الكظرية مع الملقط غرامة.
  7. مع زوج حساس من مقص، قص الغدة الكظرية إلى قطع صغيرة مع القليل القليل من دولبيكو خالية من المصل تعديل المتوسطة النسر (دميم)/F-12 المتوسطة.
  8. إعداد ثلاثة مختلفة الحجم المسام باستور بيبيتس واستخدم بيبيت باستور الأولى لنضح كل قطعة الغدة الكظرية في أنبوب 50 مل مخروطية تحتوي على المتوسط مع كولاجيناز الثاني (~0.5–0.8 mg/mL).
    1. تريتوراتي بلطف قطع الأنسجة حول 10 x. استخدام باقي بيبيتس وكرر الخطوات المذكورة أعلاه حتى تصبح كل قطعة أصغر.
      ملاحظة: يمكن إنشاء أحجام مختلفة المسام بيبيتس باستور بتدفئة لهم بالنار. بيبيت الأول هو الحجم الأصلي (حوالي 1 ملم) وحجم المسام والثانية حوالي 0.8 ملم بيبيت باستور الثالث حوالي 0.5 ملم. أثناء الهضم، سيصبح أصغر القطع من الغدة الكظرية. وهكذا، عن طريق الإجراء الميكانيكية، الغدة الكظرية يمكن هضمها أكثر أكمل. احتضان الأنبوبة في حمام مائي (عند 37 درجة مئوية) واهتز كل 5 دقائق، x 4 في المجموع.
  9. وبعد تفريخ 20 دقيقة، إضافة متوسطة طازجة وباردة (ستة إضعاف حجم؛ وعلى سبيل المثال، 5 مل من الأنسجة + 25 مل من بارد دميم/و-12 المتوسطة) تحتوي على 2.5% الجنيني البقري المصل (FBS) ومصل الحصان 5% لوقف مفعول إنزيم.
  10. جمع الكريات الخلية باستخدام الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 10 دقائق.
  11. إضافة وحدة تخزين مناسبة من المتوسطة تعليق الخلايا.
    ملاحظة: يمكن جعل كل الغدة حوالي ~ 3 × 105 إلى ~ 4 × 105 خلايا.
  12. لوحة الخلايا في لوحات المطلوب أو أطباق مع متوسط النمو (1:1 [v/v] مزيج من دميم ولحم الخنزير في المتوسط F-12، تستكمل مع البنسلين هيبيس و 1% 25 مم وستربتوميسين) بين عشية وضحاها (يوم 0) عند 37 درجة مئوية، في بيئة هوميديفيد من 95% الهواء و 5% CO2.
    ملاحظة: عادة، نحن لوحة خلايا في لوحات 24-جيدا (أربعة الغدد في اللوحة) للمقايسة القشري وفي 35 مم الأطباق (واحد غدة/حوالي واحد إلى اثنين من الأطباق) الغربية لطخة تحليل.
  13. أغسل بعناية الخلايا 2 x مع خالية من مصل الدم الحار دميم/و-12 المتوسطة (1 يوم). استبدال المتوسطة النمو الجديدة.
  14. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة هوميديفيد من 95% الهواء و 5% CO2 حتى يوم 3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام الإجراء الموضح هنا، يمكن تمييز خلايا الغدة الكظرية مثقف أولية تحت مجهر تباين مرحلة (الشكل 1A). لزيادة التأكيد على أن الحويصلات داخل السيتوبلازم قطرات الدهن، تلطيخ الفلورة من البروتينات الدهنية المتصلة بالتمايز (أدرب) يمكن أن تجري على الثقافات اليوم-3 (الشكل 1B). وقد نمت الخلايا على كوفيرسليبس الزجاج. الخلايا تم غسلها ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) والثابتة مع بارافورمالدهيد 4%. بعد الغسيل ثلاث مرات مع برنامج ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الغدد الكظرية دوراً رئيسيا في التكيف مع البيئة3. ويمكن تنظيم الهرمونات التي تفرز قشرة الغدة الكظرية وضبط الوظائف الفسيولوجية والتوازن3. ويعكس نموذج المجراة في الآثار الفسيولوجية الحقيقية في الجسم. بيد أنها لا تزال تتأثر بالعديد من العوامل المعقدة، تتسبب في آثار غير مستقرة في التجارب. وفي المقابل، مزايا نموذج الخلايا في المختبر مما يجعله لا تضاهي لنموذج الحيوان. أولاً، الظروف البيئية من السهل التحكم في النظام في المختبر. الهرمونات التي يحتمل أن تتأثر بأي حافز. عادة ما ينتج ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل بمنحه من تايوان مجلس العلوم الوطني (NSC102-2320-B-037-008-MY3) والوطني تشنغ-الكونغ "جامعة مستشفى منحة بحثية" (نكوه-10102045).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إناث / ذكور ، فئران SD / Wistar (8-12 أسبوعا)BioLASCOمناسبة للتجارب. الغدد الكظرية للإناث أكبر من ذكور الفئران ، ومع ذلك ، تمتلك إناث الفئران دورات الشبق التي قد تؤثر على التجارب
الكولاجيناز ، النوع الثانيSigmaC-6885عزل خلايا الغدة الكظرية
DMEMThermoFisher12800-017مسحوق وسائط لخلايا الغدة الكظرية
Ham's F12ThermoFisher21700-075مسحوق وسائط لخلايا الغدة الكظرية
HEPESJT.baker4018العازلة (مسحوق)
NaHCO3< / sub>JT.baker3506-1
مصل الحصانHyclone16050014
مصل بقري الجنينSAFC12103C
البنسلين (10,000 U) - ستربتومايسين (10,000 ميكروغرام / مل)Corning30-002-Clالمضادات الحيوية
ملقط منحنيBRAUNBD343R
ملقطBRAUNBD331R
مقصBRAUNBC224Rقطع جلد الفئران والعضلات
مقص رقيقBRAUNBC101Rقطع الغدد الكظرية
البروتين المرتبط بالتمايز الدهنيAbcamab108323الجسم المضاد لقطرات الدهون المرتبطة بالبروتين
Corticosterone ELISA كيتكايمان500655مقايسة لتخليق الكورتيكوستيرون
المجهر الضوئي المقلوبمجهر لايكا
الفلورينيكون
تريتون X-100JT.bakerX198-07لتلوين التألق المناعي
الماعز المضاد للأرانب IgG Alexa 488 الفلور الجسم المضاد الثانويThermoFisherA-11034لتلوين
التألق المناعي108323 Abcam المضاد ل ADFPلتلوين التألق المناعي
ProLong Gold المضاد للبهتانThermoFisherP36935لتلوين التألق المناعي
الفئران الذكور أو الأنثوية

المراجع

  1. Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
  2. Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
  3. Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
  4. Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
  5. Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
  6. Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
  7. van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
  8. Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
  9. Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
  10. Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24(2016).
  11. Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
  12. Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
  13. Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
  14. O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
  15. Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
  16. Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
  17. Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
  18. O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

زراعة الغدة الكظرية الأوليةمقايسات الوظيفة الستيرويديةهضم الأنسجةكولاجيناز IIصبغ التألق المناعيتحليل الكورتيكوستيرونالهرمون الموجه لنخامية الكظرالكشف عن القطيرات الدهنيةمجهر تباين الطور
الثقافة الأولية من خلايا الفئران البطاني وفحوصات لوظائف ستيرويدوجينيك
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.