رصد المورفولوجية والفسيولوجية طولية من الماغنيسيوم الورم ثلاثي الأبعاد باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري

السرطان هو السبب الرئيسي الثاني للوفاة في العالم¹. وضع المخدرات تستهدف السرطان من الأهمية بالنسبة للمرضى. ومع ذلك، يقدر أن أكثر من 90 في المائة عقاقير المضادة للسرطان الجديدة تفشل في مرحلة التطوير بسبب عدم فعالية وسمية غير متوقعة في التجارب السريرية². جزء من السبب الذي يمكن أن يعزى إلى استخدام نماذج الثقافة خلية ثنائية الأبعاد (2D) بسيطة لفحص المركبة، التي توفر النتائج مع القيم التنبؤية محدودية نجاعة المركب وسمية للمراحل التالية ل اكتشاف المخدرات^{2 , 3 , 4}. في الآونة الأخيرة، تم تطوير نماذج كروي الورم ثلاثي الأبعاد (3D) لتوفير البيانات ذات الصلة سريرياً الفسيولوجية والدوائية لعقار مضاد للسرطان اكتشاف^3،،من^{45 ،6،،}من^{78،9،10،11،،}من^{1213،14، 15،16،17،،}من^{1819،20،21،،}من^{2223، 24،25}. حيث يمكن أن تحاكي هذه الماغنيسيوم الخصائص الخاصة بالانسجة من الأورام في فيفو، مثل المغذيات والأكسجين التدرج، التاكسج الأساسية، فضلا عن العقاقير المقاومة¹⁹، استخدام هذه النماذج يمكن أن يحتمل أن تقصير مواعيد اكتشاف المخدرات، تقليل تكاليف الاستثمار، وجلب أدوية جديدة إلى المرضى أكثر فعالية. نهج نقدي واحد لتقييم فعالية المركب في التنمية كروي الورم 3D لرصد النمو كروي وتكرار تحت العلاج^9،26. للقيام بذلك، لا بد من الأوصاف الكمية مورفولوجيا الورم، تتعلق القطر والحجم، مع طرائق التصوير عالي الدقة،.

طرائق التصوير التقليدية، مثل مشرق الميدانية ومرحلة التباين^7،9،،من²²²⁴fluorescence مجهرية^8،،من^{916، 18،22} يمكن أن توفر مقياسا للقطر كروي ولكن لا يمكن حل الهيكل العام كروي في الفضاء ثلاثي الأبعاد. هناك عوامل كثيرة تؤدي إلى هذه القيود، بما في ذلك اختراق الضوء السبر في كروي؛ نشر الأصباغ الفلورية إلى كروي؛ التي تنبعث منها إشارات مضيئة من الأصباغ الفلورية متحمس داخل أو على سطح كروي بسبب امتصاص القوى ونثر؛ المعاكس والتصوير ريسولفابيليتي عمق هذه الطرائق. وهذا غالباً ما يؤدي إلى قياس حجم غير دقيقة. التنمية الأساسية نخرية في الماغنيسيوم يحاكي نخر في فيفو الأورام^6،،من^1015،،من¹⁹²⁵. تعتبر هذه الميزة المرضية غير المحتمل المستنسخة في 2D خلية الثقافات^19،25،،من²⁷²⁸. مع حجم كروي أكبر من 500 ميكرومتر في القطر، وهيكل ثلاثة طبقة متحدة مركز، بما في ذلك طبقة خارجية من الخلايا المتكاثرة، وطبقة وسطى من خلايا هادئة، ونواة نخرية، يمكن ملاحظتها في كروي^{6،10 ،،}من^1519،25، بسبب نقص الأوكسجين والمواد المغذية. الخلية الحية والميتة fluorescence التصوير هو نهج موحد لتسمية الحدود الأساسية نخرية. بيد مرة أخرى، اختراقات لكل هذه الأصباغ الفلورية والضوء المرئي تعوق القدرة على التحقيق في صلب نخرية لرصد تطورها في شكلها الفعلي.

3D بديلة التصوير طريقة، هو عرض التصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT) لتوصيف الماغنيسيوم الورم. أكتوبر هو تقنية تصوير الطبية غير قادرة على الحصول على بيانات 3D خالية من التسمية، وغير المدمرة من يصل إلى عمق 1-2 مم في الأنسجة البيولوجية^29،،من^3031،،من^{3233 ،34}. أكتوبر توظف التداخلي تماسك منخفضة كشف الإشارات المنتشرة في الظهر من أعماق مختلفة من العينة وتوفر الصور حل عمق أعيد بناؤها في قرارات ميكرون-المستوى المكاني في الاتجاهين الأفقي والرأسي على حد سواء. أكتوبر قد اعتمدت على نطاق واسع في طب العيون^35،،من³⁶³⁷ والأوعية^38،39. واستخدمت الدراسات السابقة أكتوبر لمراقبة مورفولوجية في المختبر الماغنيسيوم ورم في الغشاء مصفوفة (مثلاً، ماتريجيل) وتقييم استجاباتها للعلاج الضوئي^40،41. في الآونة الأخيرة، لدينا فريق منصة تصوير أكتوبر الفائق بمنهجية رصد وقياس حركية النمو للورم 3D الماغنيسيوم في لوحات متعددة جيدا⁴². وقد عرضت دقيقة التحديد الكمي الحجمي الماغنيسيوم الورم ثلاثي الأبعاد باستخدام فوكسل عد النهج وكشف النسيج المتنخر خالية من التسمية في الماغنيسيوم استناداً إلى التباين التوهين البصري الجوهرية. وتصف هذه الورقة تفاصيل كيف كان شيدت منصة التصوير في أكتوبر والمستخدمة للحصول على صور عالية الدقة 3D من الماغنيسيوم الورم. ويرد وصف التحليلات الكمية خطوة بخطوة لحركية النمو من الماغنيسيوم الورم ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك قياسات دقيقة لوحدات التخزين، وقطرها كروي. ويرد أيضا، طريقة الكشف عن مناطق النسيج المتنخر استخدام OCT، استناداً إلى التباين التوهين البصري الأصيلة غير المدمرة.

1-إعداد الخلايا

1. الحصول على خطوط الخلايا من أحد الموردين مؤهلين.
   ملاحظة: تأكد من أن الخلايا من خطوط الخلايا من الفائدة يمكن أن تشكل كروي في وسائط الثقافة، أو بالمساعدة من الركازة (مصفوفة الغشاء مثل ماتريجيل). ننظر إلى الأدب⁹ أو القيام بجولة واحدة من تجربة سابقة للاختيار.
2. ذوبان الجليد الخلايا المجمدة وفقا للإجراءات المحددة المقدمة من الموردين خط الخلية. يمكن الاطلاع إجراءات عامة في أماكن أخرى⁴³.
3. ثقافة الخلايا للفقرات 1-2 في قوارير الثقافة² 25 سم. ثم الخلايا على استعداد لاستخدام لثقافة خلية ثلاثية الأبعاد.
4. مراقبة الحالة الصحية للخلايا كل يوم والمحافظة عليها في حاضنة تحت الظروف القياسية (37 درجة مئوية، 5% CO₂، 95% رطوبة). تحديث وسائل الإعلام حسب الحاجة.
   ملاحظة: يتكون المتوسطة الثقافة دميم (الجلوكوز 4.5 غرام/لتر)، 1% مضاد حيوي فطري، 10% مصل بقرى الجنين. خلايا فرعية قبل أن تصل إلى التقاء في قارورة الثقافة. اتبع هذا المبدأ التوجيهي ثقافة الخلية المقدمة من المورد. ويمكن الاطلاع على إجراءات عامة السوري⁴⁴.
5. أداء الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد في لوحات متعددة جيدا استناداً إلى البروتوكول العام التالي⁹.
   1. قم بإزالة وسائط الثقافة من قارورة الثقافة وغسله مع تعقيم الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني، ساخنة إلى 37 درجة مئوية).
   2. ريسوسبيند الخلايا بإضافة 1 مل حمض التربسين الإيثيلين (يدتا، 0.5 ٪) في قارورة لمدة 3 دقائق. ثم إضافة وسائط الثقافة تمييع التربسين.
   3. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ز ودرجة حرارة الغرفة.
   4. إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 4 مل من قبل حرارة الثقافة المتوسطة. "الماصة؛" قطره واحدة من العينة على هيموسيتوميتير لخلية العد لتحديد تركيز الخلية. تمييع الخلايا للتركيز المناسب للبذر (مثلاً، 3,000 خلايا/مل).
      ملاحظة: تحسين تركيز الخلية الأولى كروي لكل خط الخلية وكل نوع من لوحة متعددة جيدا (96، حسنا، 384، حسنا أو 1536-جيدا).
   5. خلايا البذور في مرفق منخفضة للغاية (العلا) القاع المستديرة من لوحة متعددة جيدا. إضافة 200 ميليلتر من تعليق الخلايا في كل بئر في تركيز 3,000 خلايا/مل حتى يكون كل منهما أيضا الخلايا حوالي 600.
   6. في الرايت، الطرد المركزي لوحة كاملة باستخدام محول لوحة لمدة دقيقة 7، الحق بعد البذر، بسرعة 350 × ز أو أقل سرعة متوفرة.
      ملاحظة: يساعد أجهزة الطرد المركزي جمع الخلايا إلى مركز البئر لتسهيل تشكيل كروي واحدة وموحدة. خطوة الطرد المركزي يتم مرة واحدة فقط في بداية تشكيل الماغنيسيوم الورم. لن يتكرر ذلك عندما تبدأ الماغنيسيوم الورم في النمو.
   7. الحفاظ على لوحة متعددة جيدا في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ في حاضنة ثقافة وتحديث وسائل الإعلام ثقافة كل 3 أيام.
      ملاحظة: قد تختلف الوقت النمو لظروف مختلفة الثقافة 3D. في دراستنا، هو استخدام 3,000 خلايا/مل لخطوط الخلايا ملغ U-87 وكليات 116 في لوحات 96-جيدا، وحيث كروي يمكن أن تنمو إلى ~ 500 ميكرومتر في الأيام 4\u20127 للخلايا HCT 116. النظر في إضافة ملاحق وسائط الإعلام وعوامل النمو لنماذج مختلفة كروي، استناداً إلى العام البروتوكول الثقافة 3D.
   8. إجراء تصوير أكتوبر من الماغنيسيوم الورم كل أيام 3\u20124 لدراسة طولية نموها.
      ملاحظة: النقاط الزمنية الموصى بها لتصوير أكتوبر سيكون يوم 7، يوم 11 ويوم 4 ويوم 21، ويوم 14، يوم 18.

2-الفائق أكتوبر التصوير منصة

ملاحظة: انظر المشار إليه عمل^{29،30،31،32،33،34} لإجراء استعراض شامل لمبادئ وتطبيقات من أكتوبر. انظر الشكل 1 وهوانغ et al. ⁴² للحصول على التفاصيل الخاصة ب OCT المخصصة المستخدمة في هذه الدراسة نظام التصوير.

1. اختر مصدر ضوء واسع النطاق مناسب لنظام أكتوبر لتصوير كروي الورم.
   ملاحظة: هنا، صمام ثنائي سوبيرلومينيسسينت (تحالف اليسار الديمقراطي، الشكل 1 أ،ب) بطول موجي مركزية من ~ 1,320 نيوتن متر و ~ 110 تم استخدام عرض النطاق الترددي شمال البحر الأبيض المتوسط كمصدر ضوء ذات النطاق العريض.
2. بناء مرجع الذراع والذراع عينة نظام أكتوبر بعد الخطط (انظر الشكل 1 أ،ب لمزيد من التفاصيل). انظر الجدول للمواد للحصول على قائمة مكونات البصرية لبناء نظام OCT. ضمان أن تتم مطابقة طول المسار الضوئي إشارة الذراع والذراع عينة عن كثب.
3. بناء المطياف، بما في ذلك صيد تلسكوب [غرتينغ] وعدسة F-ثيتا وكاميرا خط المسح الضوئي (انظر الشكل 1 للإعداد³⁴) بدلاً من ذلك، حدد تفاصيل تصميم مطياف من أكتوبر مطياف تجارية التي تطابق مركز الطول الموجي لمصدر الضوء. تأكد من أن والمطياف يتم محاذاتها بشكل صحيح لتغطية النطاق الترددي ليزر كامل، لتحقيق كفاءة جمع فوتون عالية ولتوفير خارج الغسيل البطيء لنمط التدخل.
4. تميز أداء النظام أكتوبر، بما في ذلك المقاييس التالية مثل عينة ذراع السلطة، مجموع التصوير عمق، تعتمد على عمق حساسية، القرار المحوري، وعمق القرار التركيز والوحشي. ضع عاكس ضعيفة (مثل، مرآة مع مرشح كثافة محايدة) كعينة قياس حساسية تعتمد على عمق والقرار المحوري، وعمق التركيز. ضع هدفا مخطط اختبار قرار USAF كعينة للتحقق من أن القرار الأفقي.
   ملاحظة: انظر مراجع^34،45 للحصول على تعريفات لمقاييس الأداء OCT والبروتوكولات لتوصيف هذه المقاييس⁴⁵. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة المعلمات المقاسة لنظام أكتوبر المخصصة المستخدمة في هذه الدراسة.
5. حدد مرحلة ترجمة إليه لتوفير الحركة الأفقية للوحة متعددة جيدا إلى صورة الورم الماغنيسيوم في آبار مختلفة (انظر الشكل 1B). استخدام مرحلة مع مجموعة سفر أكبر من 108 ملم × 72 ملم لضمان المسح الكامل لجميع الآبار للوحة متعددة جيدا. استخدام مرحلة ترجمة إليه ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد مع التحكم في البرنامج لتمكين الموقع الدقيق لكل بئر وأتمتة نظام أكتوبر للتصوير الفائق.
6. استخدام محول لوحة أو تصميم حامل لوحة (عن طريق الطباعة 3D) لعقد لوحة متعددة جيدا في وضع ثابت.
7. تصحيح إمالة ودوران لوحة متعددة جيدا باستخدام 2D إمالة مرحلة تناوب التي شنت على مرحلة متعدية الجنسيات (انظر الشكل 1 دال)، وقبل إجراء أي أكتوبر التصوير للتقليل من تباين الطائرة التركيز من آبار مختلفة. استخدام D2، D11، B6، D6، G6 الآبار التوجيهية عند رصد مواقعها النسبية في أكتوبر الصور (الشكل 1A).
8. ضبط استدارة اللوحة لضمان حواف اللوحة بالتوازي مع اتجاه الحركة المرحلة حتى تظل الآبار في نفس المواضع الأفقية في أكتوبر الصور (الشكل 1E). ضبط إمالة لوحة لتكون موازية للجدول البصرية حيث أن الآبار التي تبقى في نفس المواقع الرأسي لاكتوبر التصوير (الشكل 1F).
   ملاحظة: تعديل زاوية إمالة وتركيز المساعدة في تحسين جودة الصورة أكتوبر لجميع الآبار. بيد أن الاختلافات الارتفاع ووسائط الثقافة في آبار مختلفة قد يسبب تغييرات في المسارات الضوئية التي قد تؤدي إلى عدم الصورة كروي. ويمكن تنفيذ التركيز التلقائي للتحكم في المستوى البؤري للتصوير أكتوبر لتحقيق جودة الصورة الأمثل. خطوة التعديل لا تحل رداءة نوعية الصورة أكتوبر كروي الورم بسبب القضايا التالية: decentering كروي نظراً لموقع بذر الأولية؛ ارتفاع كروي عند جزءا لا يتجزأ من مصفوفات بيوفابريكاتيد خارج الخلية؛ نوعية لوحة الفقيرة مع وجود اختلافات كبيرة في الارتفاع قيعان جيدا. يمكن تنفيذ مراقبة برامج إضافية مع وظائف التركيز التلقائي أو الذاتي المحاذاة الأداء الأمثل لنظام التصوير OCT.
9. استخدام برنامج حاسوبي مخصص للتحكم في اكتساب صورة أكتوبر وحركة مرحلة جمع البيانات من كل جيدا تسلسلياً.

3- أكتوبر مسح وتجهيز الماغنيسيوم الورم

1. في يوم تصوير أكتوبر الماغنيسيوم الورم، تأخذ لوحة متعددة جيدا من الحاضنة. نقل لوحة متعددة جيدا تحت OCT نظام التصوير. ووضعه على رأس محول لوحة.
   ملاحظة: يمكن تنفيذ التصوير أكتوبر من الماغنيسيوم الورم مع غطاء لوحة البوليسترين أو إيقاف تشغيله. بيد أن كوندينسيشنز الماء على الغطاء نتيجة التبخر من الآبار قد تؤثر على نقل الضوء وتشوه مسار الضوء، الغلة أقل الصور أكتوبر الأمثل من الماغنيسيوم.
2. ضبط ارتفاع اللوحة التي تسير في اتجاه z-مرحلة الترجمة. الحفاظ على موقف البؤري ~ 100-200 ميكرومتر تحت السطح العلوي لكل كروي، تقليل التأثير غير موحدة ديبثويسي الشخصية المحورية.
3. تعيين نطاق أكتوبر مسح سليم (مثلاً، 1 مم × 1 مم) في برامج مخصصة لتغطية كروي الورم كله وفقا لمراحله الإنمائية. انقر فوق حفظ معلمات لحفظ الإعداد.
4. استخدام برامج مخصصة للحصول على صور OCT 3D للورم الماغنيسيوم واحداً تلو الآخر لجميع الآبار لصفيحة تحتوي على الماغنيسيوم. انقر فوق الزر معاينة لعرض معاينة الصورة، وانقر فوق الزر الحصول على الحصول على الصورة OCT.
   ملاحظة: تأكد من أن تجمع البيانات كروي أكتوبر عند المرحلة ليس في الحركة. كروي يقع عادة في مركز يو-الأسفل جيدا. ومع ذلك، قد تكون إزاحة كروي في وسائل الإعلام الثقافة عند المرحلة تسارع أو تباطؤ بسبب القصور الذاتي كروي في وسائل الإعلام الثقافة.
5. عملية 3D datasets أكتوبر الماغنيسيوم الورم توليد صور OCT الهيكلية مع رمز c + + معالجة مخصصة. انظر الشكل 2 ألف لمخطط انسيابي لتجهيز البيانات أكتوبر.
   ملاحظة: انظر الشكل 4A للصور الهيكلية أكتوبر ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها.
   1. انظر الفصل 5 من دريكسلر وفوجيموتو³⁴ وجيان et al. ⁴⁶ للحصول على وصف تفصيلي خطوات تجهيز البيانات أكتوبر. معايرة حجم بكسل في جميع الأبعاد الثلاثة. إعادة تحجيم الصور الهيكلية أكتوبر على تصحيح جداول.
      ملاحظة: المسافة في اتجاه محوري (z-اتجاه) أكتوبر الصور مقياس لمسار بصري الفرق بين مرجع الذراع والذراع عينة. وهكذا، يحتاج الانكسار من العينة (ن) أن تؤخذ في الاعتبار عند معايرة حجم بكسل في اتجاه محوري لإعادة قياس. في هذه الدراسة، ونحن استخدام n = 1.37 الانكسار كروي الورم⁴².
6. توليد مجمعة الصور كروي باستخدام 2D أكتوبر الصور في ثلاث طائرات من طراز XY و XZ YZ مستعرضة عبر centroid كروي. انظر الشكل 3-ه لإخراج تمثيلية للفن التصويري الصور كروي. إجراء تسجيل صورة لجميع الماغنيسيوم، استخدام دفتريجيستريشن MATLAB الدالة⁴⁷، للتأكد من أن سينترويدس لكل كروي تقع تقريبا في نفس الموقع.
7. الحصول على عرض ثلاثي الأبعاد من كروي استخدام برمجيات التجارية أو مخصص.
   ملاحظة: تظهر الخطوات التالية كيفية الحصول على عرض ثلاثي الأبعاد من الماغنيسيوم الورم باستخدام برمجيات تجارية.
   1. تحميل بيانات أكتوبر 3D في البرنامج.
   2. انقر فوق لوحة تفوق . ثم انقر فوق إضافة إلى وحدة التخزين الجديدة. اختر حالة المزج لاستخدامها لعرض ثلاثي الأبعاد.
   3. قم بضبط زاوية العرض عن طريق سحب الصورة باستخدام مؤشر الماوس.

4- التقدير الكمي المورفولوجية الماغنيسيوم الورم 3D

ملاحظة: تعليمات برمجية مخصصة مكتوبة في MATLAB عمليات هذا التحديد الكمي. انقر فوق الزر تشغيل للشروع في هذه العملية. انظر الشكل 2 لمخطط انسيابي خطوات للتحديد الكمي المورفولوجية الماغنيسيوم.

1. قياس القطر كروي والارتفاع، ووحدة التخزين المستندة إلى قطر.
   1. حدد الصور 2D أكتوبر في ثلاث طائرات XY و XZ YZ مستعرضة الصليب centroid كروي.
   2. قياس القطر والارتفاع من كروي في طائرات XY و XZ، على التوالي.
   3. حساب كروي المستندة إلى القطر باستخدام وحدة التخزين: ، مع افتراض كروية الشكل للورم.
2. التحديد الكمي لحجم كروي المستندة إلى فوكسل.
   1. تطبيق عامل تصفية حساب المتوسطات 3D على بيانات هيكلية أكتوبر كروي لإزالة البقع.
   2. الجزء الماغنيسيوم الورم استخدام حافة ماكرة الكشف عن⁴⁸ عامل التصفية، الإطار حسب الإطار، عتبة سليم الذي يفصل المنطقة كروي الورم من أسفل جيدا.
   3. مجموعة فوكسيلس الضام للبيانات ثلاثي الأبعاد (انظر دالة مضمنة: بوكونكومب).
   4. حساب متوسط المسافة بين كل فوكسل الضام في المجموعة و centroid كروي (اختياره يدوياً)، لكل مجموعة. تحديد منطقة كروي كالمجموعة مع الحد الأدنى للمسافة الوسطية.
   5. حساب عدد فوكسيلس داخل المنطقة كروي وثم ضرب الحجم الفعلي فوكسل الفردية (حجم/فوكسل)، مما أسفر عن الحجم الإجمالي كروي.

5-كشف المنطقة الميت-خلية من الماغنيسيوم الورم 3D

ملاحظة: في متوسط متجانسة، كثافة منتشرة في الظهر أكتوبر كشف كدالة للعمق (أنا(z)) يمكن وصفها ب "قانون" بير لامبرت⁴⁹: ، حيث يمثل z العمق، μ هو التوهين البصري معامل، و أنا₀ شدة حادث بالعينة. ومن هنا يمكن التعبير عن معامل التوهين البصري المشتقة ك: . إذ غالباً ما يتم رسم الصور أكتوبر على مقياس لوغاريتمي، يمكن استرداد المنحدر من التشكيل الجانبي كثافة OCT لاشتقاق معامل التوهين البصري. انظر الشكل 2 لمخطط انسيابي لتوليد خرائط التوهين البصري.

1. إجراء تجزئة لإزالة المناطق غير المرغوب فيها خارج كروي. إجراء تصفية متوسط 3D لمنع الضجيج البقع واللطخ المتأصل في أكتوبر الصور.
2. الحصول على بيكسيلويسي معاملات التوهين البصري بخطى تركيب الشخصية كثافة أكتوبر مقياس لوغاريتمي على مدى عمق نطاق معين (نافذة متحركة)، استخراج، المنحدر، وضرب المنحدر-1/2.
   ملاحظة: معامل التوهين في كل فوكسل داخل المنطقة مجزأة كروي يحسب استناداً إلى المنحدر من أكتوبر كثافة الشخصية في إطار عمق 10-فوكسل (~ 40 ميكرومتر في العمق)، مع فوكسل يقع في وسط الإطار.
3. تطبيق الأساليب (الخطوات 5.1 و 5-2) أعلاه على كل المسح المحوري في إطار وكل إطار في مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد تحتوي على منطقة كروي مجزأة حتى يتم حساب معاملات التوهين البصري لكل فوكسيلس من منطقة كروي مجزأة.
4. أداء العتبة ثنائي لتسليط الضوء على منطقة عالية-التوهين.
   ملاحظة: انظر هوانغ et al. ⁴² لتحديد عتبة لمنطقة عالية-التوهين باستخدام تحليل الرسم البياني.
5. وتبرز الخريطة التوهين البصري بيناريزيد في الصورة الأصلية تسمية المنطقة الميت-الخلية (مزج). إنشاء صورة الخريطة التوهين المخلوطة لتصور توزيع المنطقة الميت-خلية ثلاثية الأبعاد 3D-المقدمة.

6-علم الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري

ملاحظة: علم الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) الملون صور الماغنيسيوم الورم يتم الحصول على الربط بين نتائج أكتوبر المقابلة.

1. عند نقطة زمنية محددة، حدد الماغنيسيوم الورم 1-2 من لوحة متعددة جيدا لعلم الأنسجة وتلطيخ المدينة. استخدام ماصة مع نصائح ماصة 1 مل لنقل كروي من البئر إلى أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل.
   ملاحظة: قطع طرف ماصة 1 مل قبل النقل لضمان أكبر من حجم كروي الورم لتجنب إتلاف هيكل كروي افتتاح التلميح.
2. جمع كل كروي ورم في أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد 1.5 مل مليئة بنسبة 10% فورمالدهايد وإصلاح ح 48.
3. أداء في علم الأنسجة والعمليات المدينة لكل كروي، استخدام البارافين قياسي تضمين تقنيات.
   ملاحظة: وصمة عار 5 ميكرومترات أبواب سميكة من الماغنيسيوم الورم الهيماتوكسيلين وويوزين (H & E) ومحطة ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز dUTP نك نهاية الوسم الكشف المبرمج (TUNEL). يتم تطبيق كونتيرستينينج الهيماتوكسيلين TUNEL. تم استخدام ماسح ضوئي شريحة رقمية لمسح العينة الملون والحصول على الاستبانة غذائها وصور المدينة.

التصوير التصوير المقطعي التماسك الضوئية عالية الإنتاجية من الماغنيسيوم في صفيحة 96-جيدا

الشكل 3 معارض نتيجة المسح HT، تشرين الأول/أكتوبر لصفيحة 96-جيدا مع HCT 116 الورم الماغنيسيوم في يوم 3. يبدأ التفحص متسلسلة من لوحة كاملة من البئر أسفل اليمين (H12). ويبين الشكل 3B في الرسم البياني لتنفيذ برامج نظام HT، تشرين الأول/أكتوبر. بعد أن تم جمع البيانات كروي واحد ومعالجتها، اللوحة سينتقل إلى حسنا، انتظر القادم ~ 2 s السماح كروي للراحة، وجمع البيانات كروي القادم. أكتوبر كل البيانات يتكون من 400 × 400 × 1024 فوكسيلس، التي تقابل على حجم الفعلي من 1.0 × 0.84 × 2.3 مم3. يبين الشكل 3 مجمعة من الوجه أون أكتوبر صور من الماغنيسيوم 116 كليات التقنية العليا التي تم إنشاؤها من البيانات المجهزة. والنتيجة قابلة للمقارنة مع الصور من غيرها 2D الفائق التصوير النظام22. نظراً للقدرة على التصوير ثلاثي الأبعاد من OCT، أننا يمكن أن تولد أيضا مجمعة الصور 2D كروي مستعرضة من الآبار 96 (الشكل 3D) لرصد مرتفعات كروي وتصور إينهوموجينيتي كروي في الاتجاه العمودي. مجمعة صور 3D-المقدمة كروي الممكن أيضا من أي زاوية محددة مسبقاً (الرقم 3E) لتصور الشكل ثلاثي الأبعاد الشاملة وتقييم استدارة كروي. لاحظ أن عملية التصوير عموما باكتوبر والوقت للوحة كاملة 96-جيدا سيكون ~ 21 دقيقة ودقيقة ~ 25 عندما يتم تشغيل الكاميرا خط المسح الضوئي بسرعة من 92 كيلو هرتز و 47 كيلو هرتز، على التوالي. مشاهدة فيديو 1 على سبيل مثال.

رصد الخصائص المورفولوجية والفسيولوجية طولية كروي الورم

بعد أن حصلنا على صور هيكلية أكتوبر الماغنيسيوم الورم من لوحة لنقاط زمنية متعددة، ويمكن كذلك نحلل هذه البيانات بالتحديد الكمي للمعلومات الفسيولوجية والمورفولوجية الماغنيسيوم الورم. ويبين الشكل 4 نهج مختلفة لوصف الورم الماغنيسيوم والحصول على معلومات الخصائص المورفولوجية والفسيولوجية طولية من لهم.

ويبين الشكل 4B طرق مختلفة لتصور كروي الورم. مع المعونة من البرامج التجارية أو المجانية، يمكن تحميل البيانات 3D في البرنامج وإنشاء "وحدة" من ورم كروي (عرض ثلاثي الأبعاد)، الذي يبين الهيكل العام لورم كروي في الفضاء ثلاثي الأبعاد. مع مستوى العتبة المناسبة، يمكن أن تتولد لدينا قطعة سطح كروي الورم (الشكل 4 باء)، التي يمكن أن تستخدم لتقسيم كروي وقياس الحجم. يمكن أيضا إنشاء الشرائح المتعامدة (اورثو الشرائح) من طائرات قطاعات مختلفة في توجهات مختلفة (الشكل 4 باء، XZ، YZ، و XY) وقياس قطرها وارتفاعها كروي الورم من هذه الشرائح اورثو.

جمع بيانات أكتوبر كروي نفسه من النقطة الزمنية متعددة، يمكن تحديد مقدار المعلومات المورفولوجية وتوليد النمو منحنى كروي لإظهار التغييرات طولية. ويبين الشكل 4 بيانات تمثيلية من كروي الورم HCT 116 التي يجري رصدها لمدة 21 يوما. ومن بيانات مجزأة والشرائح اورثو، قمنا بقياس القطر والارتفاع والمستندة إلى فوكسل حجم كروي لجميع النقطة الزمنية، التي تم سردها في الجدول. ونحن أيضا حساب حجم المستندة إلى قطر لإجراء مقارنة. وقد رسم منحنيات النمو في حجم وحجم، على التوالي. من منحنيات النمو، يمكن أن نرى أن هذا كروي الورم HCT 116 يتبع نمط نمو الطولي في وحدة التخزين قبل يوم 11. قبل ذلك الوقت، كروي أبقى المتنامية والإبقاء على شكل موحد نسبيا. بيد بعد يوم 11، كروي أصبح تعطلت وسويت بالأرض وانهارت تماما في يوم 21. منحنى النمو لوحدات التخزين على أساس فوكسل يبين بوضوح الاتجاه، مع كميات تناقص تدريجيا بعد يوم 11.

استناداً إلى بيانات أكتوبر، يمكننا أيضا الحصول على المعلومات الفسيولوجية لتوزيع الخلايا الميت داخل الماغنيسيوم الورم من خلال تحليل التوهين بكسل بكسل بصري من 2D الصور المقطعية. أثر الأساليب الموضحة في الشكل 2 و 5 من البروتوكول، يمكننا كمياً تحديد المناطق خلايا ميتة ورصد نمو هذه المناطق كدالة للزمن. يبين الشكل 4 نتيجة ممثل لتعقب طولية لزيادة عدد المناطق خلايا الميت في كروي الورم. مجالات تمييز باللون الأحمر، الذي كان التوهين بصرية عالية، تظهر المناطق المسماة نخرية. من 3D تقديم خريطة التوهين البصري أثناء تطوير يوم 14، يمكن أن نرى قطاع الأحمر توسيع، مما يشير إلى زيادة مناطق نخرية. كنسبة مئوية مناطق نخرية زيادة، يمكن أن لا تحتفظ كروي الورم شكل مثالي. ولذلك، أنها تميل إلى تقويض وانهيار، التي شوهدت في رصد طولية مورفولوجيا الورم في الشكل 4.

تم التحقق من أسلوب الكشف عن المنطقة المقترحة النسيج الميت غير تدميري بمقارنة خريطة التوهين البصري OCT HCT 116 ورم كروي مع الصور المقابلة التي حصلت عليها علم الأنسجة والمدينة. ويعرض الشكل 4 هذه مقارنة مع كروي 116 HCT 14 يوم. مباراة جيدة بين التوهين أكتوبر خريطة والمقابلة ح & ه و TUNEL شرائح تم العثور عليها، التي أشارت بتحليل الميزات داخل المناطق في شرائح ح & ه و TUNEL تميزت خطوط داش المستمدة من الكفاف من أكتوبر توهين عالية المناطق. في شرائح ح & ه، تم تبين المناطق النسيج الميت بأقل بنية كثيفة ومجمعة وتقع ضمن منطقة خط متقطع. شرائح TUNEL، لوحظ مباراة جيدة بين منطقة التوهين العالية والمسمى TUNEL أبوبتوتيك الخلوية.

رقم 1: بناء نظام التصوير المقطعي (HT-أكتوبر) التماسك البصري الفائق لتصوير كروي الورم. (أ) الخطط نظام HT، تشرين الأول/أكتوبر. يتم رسم تخطيطي لصفيحة 96-جيدا جوار النظام OCT. وتستخدم خمسة آبار (D2، D11، B6، D6، G6) المسمى باللون الأصفر لتسوية غرامة من المراحل في (د). (ب) التكوين الفعلي لنظام HT، تشرين الأول/أكتوبر. انظر الجدول للمواد للمكونات البصرية المستخدمة لكل جزء من النظام. مطياف (ج) تصميم لنظام HT، تشرين الأول/أكتوبر. (د) مرحلة الإعداد لنظام HT، تشرين الأول/أكتوبر. المحاذاة الصحيحة للمرحلة 6-المحور والتزامن بين اقتناء OCT وحركة مرحلة مطلوبة من أجل تصوير الفائق. (ﻫ) و (و) إظهار آثار دوران وآماله على الصورة النهائية لآبار مختلفة. يؤدي التناوب الصور أكتوبر آبار مختلفة لتحول أفقياً بينما إمالة سوف يؤدي إلى تحويل الرأسي من آبار مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: تجهيز البيانات للصور أكتوبر من الماغنيسيوم الورم. (أ) تخطيط انسيابي من الخطوات ما بعد المعالجة العامة للبيانات أكتوبر. (ب) تخطيط انسيابي للتحديد الكمي المورفولوجية كروي الورم. (ج) مخطط انسيابي لكشف المنطقة خلية ميتة كروي الورم. شريط الحجم: 100 ميكرومتر لجميع سوبفيجوريس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 3: أكتوبر الفائق المسح من 96 جيدا لوحة تحتوي على الماغنيسيوم الورم ملغ U-87. (أ) الإعداد الفعلية مع 96-لوحة جيدا في إطار الهدف. (ب) الرسم البياني لتنفيذ برامج نظام HT، تشرين الأول/أكتوبر. كليات 96 تواجه أون (ج) ومستعرضة (د) والإسقاط 3D المقدمة أقصى شدتها (MIP) (ﻫ) أكتوبر صور من يوم 3 كليات 116 الماغنيسيوم تم إنشاؤها من البيانات المجهزة. شريط الحجم: 200 ميكرومتر لجميع سوبفيجوريس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: المورفولوجية الطولي والتقدير الكمي الفسيولوجية للورم الماغنيسيوم مع بيانات أكتوبر ثلاثية الأبعاد- (أ) حصل على 3D أكتوبر صور الهيكلية كروي الورم بعد المعالجة بعد انتهاء أكتوبر العام. من بيانات أكتوبر، نحن تولد مؤامرة سطحية ثلاثية الأبعاد وشرائح متعامد XZ YZ وتخطيط س وص لتصور هيكل كروي الورم في أي اتجاه (ب). يمكننا تنفيذ الرصد الطولي لورم واحد كروي (ج)، وتميز القطر والارتفاع والحجم على أساس فوكسل (المدرجة في الجدول للمواد) ورسم منحنيات النمو في حجم وحجم خلال ال 21 يوما التنمية. في المثال، كروي البلدان المتقدمة النمو، وأصبحت تعطل في يوم 11 وانهار تماما في يوم 21. يمكننا مواصلة رصد حالة فيزيولوجية كروي ورم طوليا استناداً إلى التباين التوهين مضمن بصري (د). وأظهرت 3D الصور لورم كروي المقدمة ظهور ونمو المناطق خلايا الميت من يوم 7 إلى 14 يوم. مجالات الميت-خلية عالية-التوهين-المسمى باللون الأحمر كانت مطابقة مع غذائها ونتائج المناعي (المدينة). خريطة التوهين أكتوبر ح & ه و TUNEL يتم تعديل النتيجة في الشكل 4 من الرقم 42. تغيير حجم أشرطة: 100 ميكرومتر لجميع سوبفيجوريس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

1 فيديو: تصوير أكتوبر الفائق للورم الماغنيسيوم. وقدم سير عمل 3D أكتوبر تصوير وتجهيز أكتوبر الأساسية والحركة المرحلة في الفيديو مع سرعة 5 x. وعرضت أيضا معاينات لمعالجة الصور الهيكلية أكتوبر من الماغنيسيوم. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

المؤلفون بالإفصاح عن لا مصلحة منافسة.