نقدم هنا، بروتوكولا لعزل غشاء البلازما والسيتوبلازم والميتوكوندريا U937 الخلايا دون استخدام الطرد المركزي عالية السرعة. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتنقية الكسور سوبسيلولار لدراسة لاحقة للتعريب البروتين عن طريق إيمونوبلوتينج.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وجود خلية من خلايا U937 في غياب الطرد المركزي عالية السرعة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذا البروتوكول أننا بالتفصيل طريقة الحصول على كسور سوبسيلولار U937 الخلايا دون استخدام تنبيذ فائق أو المنظفات عشوائية. ويستخدم هذا الأسلوب المخازن المؤقتة ناقص التوتر، ديجيتونين، وتحلل الميكانيكية والطرد المركزي التفاضلي لعزل السيتوبلازم، الميتوكوندريا وغشاء البلازما. العملية يمكن تحجيمها لاستيعاب احتياجات الباحثين، وهي غير مكلفة وبسيطة. سيسمح هذا الأسلوب الباحثين لتحديد التعريب البروتين في الخلايا دون المتخصصة أجهزة الطرد المركزي، ودون استخدام مجموعات تجارية، والتي يمكن أن تكون باهظة التكاليف. أننا استخدمت بنجاح هذا الأسلوب لفصل سيتوسوليك وغشاء البلازما والبروتينات المتقدرية في خط الخلية الوحيدات البشرية U937.
المقدمة
الهوية موثوقة للتعريب البروتين ضروري غالباً عند دراسة مسارات الجزيئية في الخلايا حقيقية النواة. وتستخدم أساليب الحصول على كسور سوبسيلولار من الباحثين بدراسة المكونات الخلوية من اهتمام أوثق.
معظم أساليب تجزئة الخلية الحالية عموما تندرج في فئتين عريضتين، تستند إلى المنظفات1،2 و على أساس تنبيذ فائق3،4،5، التي يمكن أن تكون متباينة بالسرعة والدقة والتكلفة. المنظفات البروتوكولات استناداً إلى الاعتماد على استخدام المخازن المؤقتة مع زيادة قوة المنظفات جعل العناصر المتميزة للخلية. وهذا هو طريقة سريع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة
ملاحظة: انظر الجدول 1.
- إعداد الحلول من المخزن المؤقت A والعينة المخزن المؤقت وتحلل المخزن المؤقت ب ديجيتونين.
- إعداد المخزن المؤقت A بإضافة 8.77 غرام من كلوريد الصوديوم و 50 مل من حبيس (1 م، ودرجة الحموضة 7.4) إلى 900 مل منزوع الماء، ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر مع المياه.
ملاحظة: التركيزات النهائية هي كلوريد الصوديوم 150 و 50 ملم حبيس. - إعداد تحلل المخزن المؤقت ب بإضافة 20 مل حبيس (1 م، ودرجة الحموضة 7.4) ز 0.75 من بوكل، ز 0.19 مجكل2، 2 مل حمض الإيثيلين (0.5 م يدتا)، 2 مل من جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N '، ن'--حمض tetraacetic (0.5 م ....
- إعداد المخزن المؤقت A بإضافة 8.77 غرام من كلوريد الصوديوم و 50 مل من حبيس (1 م، ودرجة الحموضة 7.4) إلى 900 مل منزوع الماء، ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر مع المياه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وأنجزت تجزئة ناجحة من خلايا غير متمايزة من8 U937 تزرع في تعليق استخدام بروتوكول المفصلة أعلاه، وهو موضح في الشكل 1. العينات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة قد تعرضوا لغربي النشاف9 استخدام أسلوب نقل رطب لغشاء الفينيليدن فلوريد (PVDF). الغشاء كان بحث في وقت لاحق مع الأجسام المضادة ضد هيولى، الميتوكوندريا والغشاء المترجمة علامات البروتين (الشكل 2، رقم 3،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وضع هذا البروتوكول قد نشأت من عدم قدرة على فصل mitochondrial وعينات الغشاء، باستخدام مجموعات المتاحة تجارياً، بتحليل للتعريب البروتين خلال نيكروبتوسيس14. القيود الأساسية لمجموعات premade هي قدرتها على أن تتكيف مع احتياجات الباحثين من الأفراد، التكلفة لكل عينة وعدد محدود من العينات قادراً على معالجتها. يمكن تنفيذ الطريقة المعروضة هنا دون استخدام الكواشف باهظة الثمن، ودون الحاجة إلى معدات مكلفة. هذا الأسلوب يمكن تحجيمها لاستيعاب أي عدد من الخلايا ويمكن أن يتم تعديلها لتناسب احتياجات الباحثين. يسمح ه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن عدم تضارب المصالح
شكر وتقدير
وأيده عمل المعاهد الوطنية للصحة-1R15HL135675-01 إلى تيموثي ج. لاروككا
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | لاستخراج السيتوبلازم |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | للمخزن المؤقت للتحلل B |
| الخالط Dounce | VWR | 22877-282 | للتجانس |
| دوار نهاية إلى طرف | Barnstead | N / A | لاستخراج السيتوبلازم |
| الإيثيلين جلايكول مكرر (& بيتا ؛ أمينوإيثيل الأثير) -N ، N ، N ' ، N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | للمحلول المؤقت B |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | للمحلول المؤقت للتحلل B |
| GAPDH (14C10) | تقنيات إشارات الخلية | 2118 | للكشف عن الكسور السيتوبلازمية على اللطخة الغربية ، التخفيف< / u>: 1: 10000 |
| HEPES | VWR | J848 | لمخازن التحلل A و B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | للمخزن المؤقت للتحلل B |
| MgCl2< / sub> | Alfa Aesar | 12315 | للمخزن المؤقت للتحلل B |
| Na ، K-ATPase a1 (D4Y7E) | تقنيات إشارات الخلية | 23565 | للكشف عن كسور غشاء البلازما على اللطخة الغربية ، التخفيف < / u>: 1: 1000 |
| كلوريد الصوديوم | سيجما-ألدريتش | 793566 | للمخزن المؤقت للتحلل أ |
| فينيل ميثان سولفونيل فلوريد (PMSF<قوي>) < / strong> | VWR | M145 | لاستخراج السيتوبلازم والتجانس مسبار عازلة |
| صوتي | Qsonica | Q125-110 | للعينات النهائية |
| كوكتيل مثبط البروتياز ، الاستخدام العام | VWR | M221-1ML | لاستخراج السيتوبلازم |
| جهاز طرد مركزي مبرد | Beckman-Coulter | N / A | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | VWR | 227 | لعينة العازلة |
| لأورثوفانادات الصوديوم (SOV) | 450243 سيجما ألدريتش | لمخازن التحلل A و B | |
| السكروز | سيجما ألدريتش | S0389 | للمحلول الملحي للتحلل B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | للعينة العازلة |
| VDAC (D73D12) | تقنيات | إشارات الخلية4661 | للكشف عن كسور الميتوكوندريا على اللطخة الغربية diltion< / u>: 1:1000 |
المراجع
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
