Method Article

قياس إعادة عرض العظام وإعادة إنشاء بيئة الورم والعظام الدقيقة باستخدام ثقافة كالفاريا المشتركة والقياس الHISTOMORPHometry

DOI:

10.3791/59028

⸱

March 14th, 2020

 ,  , 
1Biomedical Innovation Department, Center for Scientific Research and Higher Education at Ensenada

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تكون ثقافة الجسم الحي السابق للنباتات العظمية أداة قيمة لدراسة فسيولوجيا العظام والتقييم المحتمل للأدوية في إعادة عرض العظام وأمراض العظام. ويصف البروتوكول المقدم إعداد وثقافة الكلفاريا المعزولة عن جماجم الفئران حديثي الولادة، فضلا عن تطبيقاتها.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العظام هي نسيج ضام يتكون من العظام، والعظام، والعظام ومصفوفة معدنية خارج الخلية، مما يعطيها قوتها والمرونة ويسمح لها بالوفاء بوظائفها. يتعرض العظم باستمرار لمجموعة متنوعة من المحفزات ، والتي في الحالات المرضية يمكن أن تؤدي إلى تحرير إعادة عرض العظام. لدراسة بيولوجيا العظام والأمراض وتقييم العوامل العلاجية المحتملة ، كان من الضروري تطوير في المختبر وفي نماذج الجسم الحي.

تصف هذه المخطوطة عملية تشريح الكلفاريا المعزولة عن الفئران الوليدية والظروف الثقافية التي تُعزل عن الفئران الوليدية لدراسة تكوين العظام والبيئة الدقيقة لأورام العظام. على النقيض من نماذج المختبر وفي الجسم الحي ، يسمح هذا النموذج السابق للفحص الحي بالحفاظ على البيئة ثلاثية الأبعاد للأنسجة وكذلك التنوع الخلوي للعظم أثناء الزراعة في ظل ظروف محددة لمحاكاة البيئة الدقيقة المطلوبة. لذلك ، من الممكن التحقق من إعادة عرض العظام وآلياتها ، وكذلك التفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى ، مثل التفاعلات بين الخلايا السرطانية والعظام.

والتجارب ذكرت هنا استخدام calvarias من 5-7 اليوم القديمة BALB / C الفئران. يتم استزراع الهيمي-كالفاريا التي تم الحصول عليها في وجود الأنسولين أو خلايا سرطان الثدي (MDA-MB-231) أو المتوسطة المكيفة من ثقافات خلايا سرطان الثدي. بعد التحليل ، ثبت أن الأنسولين يسبب تكوين العظام الجديدة ، في حين أن الخلايا السرطانية وارتشاف العظام متوسط الحجم. وقد استخدم النموذج الكلوري بنجاح في البحوث الأساسية والتطبيقية لدراسة تطور العظام وأمراض العظام الناجمة عن السرطان. وعموما، بل هو خيار ممتاز لسهولة، ومفيدة، ومنخفضة التكلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العظام هي نسيج ضام ديناميكي له عدة وظائف، بما في ذلك دعم العضلات، وحماية الأعضاء الداخلية ونخاع العظام، وتخزين وإطلاق الكالسيوم وعوامل النمو1،2. للحفاظ على سلامتها ووظيفتها السليمة ، فإن أنسجة العظام تخضع باستمرار لعملية إعادة عرض. بشكل عام ، يمكن تقسيم دورة إعادة عرض العظام إلى ارتشاف العظام وتكوين العظام1. يمكن أن يؤدي عدم التوازن بين هاتين المرحلتين من إعادة عرض العظام إلى تطور أمراض العظام. أيضا, أمراض مثل سرطان الثدي غالبا ما تؤثر على سلامة العظام; ما يقرب من 70٪ من المرضى في المراحل المتقدمة لديهم أو سيكون لديهم نقائل العظام. عندما تدخل خلايا سرطان الثدي العظام ، فإنها تؤثر على استقلاب العظام ، مما يؤدي إلى ارتشاف مفرط (آفات العظام) و / أو تشكيل (آفات العظام)3.

لفهم بيولوجيا أمراض العظام وتطوير علاجات جديدة ، من الضروري فهم الآليات التي ينطوي عليها إعادة عرض العظام. في أبحاث السرطان ، من الضروري التحقيق في عملية الانبثاث العظمي وعلاقته بالبيئة الدقيقة النقيلية. في عام 1889 ، افترض ستيفن باجيت أن الانبثاث تحدث عندما يكون هناك توافق بين الخلايا السرطانية والأنسجة المستهدفة ، واقترح أن الموقع النقيلي يعتمد على تقارب الورم للبيئة الدقيقة4. في عام 1997، قدم موندي وغيس مفهوم "الحلقة المفرغة لنقائل العظام" لشرح كيفية تعديل الخلايا السرطانية للبيئة الدقيقة للعظام لتحقيق بقائها والنمو، وكيف تعزز البيئة الدقيقة للعظام نموها من خلال توفير الكالسيوم وعوامل النمو5،6،7.

لتوصيف الآليات المشاركة في إعادة عرض العظام والانبثاث العظام وتقييم الجزيئات مع إمكانات علاجية ممكنة، فقد كان من الضروري لتطوير في المختبر وفي نماذج الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج تقدم حاليا العديد من القيود ، مثل التمثيل المبسط للبيئة الدقيقة للعظام ، وتكلفتها8،9. ثقافة العظام explants السابقين في الجسم الحي لديه ميزة الحفاظ على منظمة ثلاثية الأبعاد، فضلا عن تنوع خلايا العظام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التحكم في الظروف التجريبية. نماذج explant تشمل ثقافة عظام مشط القدم، رؤساء الفخذ، calvarias، والنوى الفك السفلي أو trabecular10. وقد تم إثبات مزايا نماذج الجسم الحي السابقين في دراسات متنوعة. في عام 2009 ، ذكرت Nordstrand والمتعاونين إنشاء نموذج الثقافة المشتركة على أساس التفاعلات بين خلايا سرطان العظام والبروستاتا11. أيضا، في عام 2012، أفاد كورتين والمتعاونين تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام ex vivo cocultures12. والغرض من هذه النماذج الجسم الحي السابق هو إعادة ظروف البيئة الدقيقة العظام بأكبر قدر ممكن من الدقة لتكون قادرة على توصيف الآليات المشاركة في إعادة عرض العظام العادية أو المرضية وتقييم فعالية العوامل العلاجية الجديدة.

ويستند البروتوكول الحالي إلى الإجراءات التي نشرها غاريت13 ومحمد وآخرون14. وقد استخدمت ثقافات كالفاريا الفأر الوليدية كنموذج تجريبي، لأنها تحتفظ بالهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للعظم قيد التطوير والخلايا العظمية، بما في ذلك الخلايا في جميع مراحل التمايز (أي العظام، والعظام، والخلايا العظمية، والخلايا النجمية) التي تؤدي إلى العظام الناضجة والعظام، فضلا عن المصفوفة المعدنية14. نموذج الجسم الحي السابق لا يمثل العملية المرضية لأمراض العظام تماما. ومع ذلك، يمكن قياس الآثار على إعادة عرض العظام أو انسياب العظام الناجم عن السرطان بدقة.

وباختصار ، يتكون هذا البروتوكول من الخطوات التالية : تشريح calvarias من الفئران القديمة 5-7 أيام ، calvaria preculture ، تطبيقات ثقافة calvaria (على سبيل المثال ، الثقافة في وجود الأنسولين والخلايا السرطانية أو المتوسطة مكيفة ، وحتى وكلاء مع الإمكانات العلاجية ، وفقا لهدف التحقيق) ، تثبيت العظام وإزالة الكلس ، معالجة الأنسجة ، التحليل النسيجي ، وتفسير النتائج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على جميع الفئران المستخدمة في هذه المقالات من سلالات فئران BALB/c ، باستخدام الفئران الذكور والإناث بشكل عشوائي. كما تم إجراء تجارب الثقافة السابقة باستخدام سلالات أخرى، مثل FVB، الفئران السويسرية، CD-1، والفئران CsA11،,12،,14. تم إيواء جميع الفئران وفقا للمعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) المبادئ التوجيهية ، التذييل س. تمت الموافقة على الإجراءات التي تشمل الحيوانات الموضوعات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية (IACUC) في مركز البحث العلمي والتعليم العالي في Ensenada (CICESE).

1- تشريح كالفاريال

  1. تعقيم أدوات تشريح (على سبيل المثال، 1 × 2 ملقط أنسجة الأسنان، مقص الجراحية على التوالي، تشريح مقص، ملاقط غرامة ذات رؤوس، طرف منحني غرامة تشريح ملقط، تشريح ملقط، مشرط). يمكن استخدام الماء المقطر المعقم لتنظيف الأدوات الجراحية بين كل تشريح ، ويمكن استخدام 1x PBS المعقم لتنظيف كل هيمي كالفاريا.
  2. ضع أدوات التشريح المعقم ، الماء ، 1x PBS ، والمواد المطلوبة لتنفيذ الإجراء (على سبيل المثال ، المايكروبيبات ، النظارات المترسبة ، أطباق بيتري العقيمة) في غطاء تدفق لامينار.
    ملاحظة: تنفيذ الإجراء بأكمله في ظل ظروف معقمة.
  3. أضف 12 مل من 1x مقسم تلفزيوني معقم إلى طبقين 10 سم بيتري.
  4. حدد الجراء ووضعها بالقرب من غطاء محرك السيارة.
    ملاحظة: تشريح calvarias من الجراء 5-7 أيام القديمة.
  5. اختيار وعقد الماوس بعناية باستخدام ملقط تشريح.
  6. قطع رأس الماوس باستخدام مقص تشريح ووضع الرأس في طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: قطع الرأس غير مناسب للفئران الأكبر سناً. إذا كان يجب إجراء التجربة مع الفئران الأكبر سنا ، يجب تعديل طريقة القتل الرحيم وفقًا لقواعد التجارب الحيوانية.
  7. عقد الرأس بحزم من قبل منطقة الأنف مع 1 × 2 ملقط الأسنان الأسنان وإزالة الجلد على الجمجمة حتى calvaria مرئية.
  8. تحديد الغرز (أي الترهل، الإكليلي، واللامبيد) من الجمجمة على كالفاريا المكشوفة.
  9. اختراق مع غيض من المقص الدقيق حوالي 2 ملم وراء خياطة lambdoid وجعل قطع مستقيم جنبا إلى جنب معها.
  10. أدخل طرف المقص الصغير على الجانب الخلفي من الجمجمة. جعل قطع على التوالي على طول الجانب القاصي من خياطة اللامبيد نحو خياطة الإكليل. المضي قدما على نحو مماثل مع خياطة اللامبيد الأخرى.
  11. جعل قطع آخر (بزاوية 45 درجة) لربط نهاية القطع المحرز مع قطع فونتانل الأمامي.
  12. كرر الخطوات 1.10 و 1.11 مع خياطة اللامبيد الأخرى.
    ملاحظة: من المهم تحديد الغرز لإجراء التخفيضات المناسبة ولتكون قادرة على إجراء تضمين كاف وتحليل البيانات.
  13. استخدام ملقط غرامة تلميح لإزالة calvaria ووضعها في طبق بيتري. مع مشرط، وجعل قطع على التوالي من فونتانل الخلفي على طول خياطة القوس من خلال خياطة التاجيو وتنتهي في فونتانل الأمامي للحصول على اثنين من هيمي كالفارياس.
  14. التقاط كل من هيمي-calvarias مع ملاقط غرامة يميل ووضعها في طبق بيتري جديدة تحتوي على برنامج تلفزيوني.

2- ثقافة كالفاريا

  1. إضافة 1 مل من متوسط DMEM عالية الجلوكوز تستكمل مع 0.1٪ الزلال مصل البقر (BSA) و 1٪ مضاد حيوي / مضاد للميكولتيك (أي البنسلين والعقدية) في آبار لوحة 24 جيدا. مع ملقط طرف غرامة، والتقاط كل هيمي-كالفاريا ووضعها في بئر.
    ملاحظة: ضع الجانب المقعر hemi-calvarias لأسفل.
  2. احتضان الهيمي-كالفاريا لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.
  3. قم بإزالة وسط الثقافة من كل بئر وإضافة 1 مل من الوسائط الطازجة التي تحتوي على المركب لاختبار أو وسائط مكيفة من خلايا أخرى.
    ملاحظة: استخدم ثلاثة على الأقل من السعرات الحرارية من hemi-calvarias لكل مجموعة معالجة واستخدم عناصر تحكم سالبة وإيجابية.
  4. احتضان هيمي-كالفاريا لمدة 7 أيام، وتغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام.

3. الثقافة مع الخلايا السرطانية

  1. حدد طبق بيتري مع الخلايا السرطانية في التقاء 80-90٪ والتربسينات لهم. لالتربسينزية، اغسل الخلايا السرطانية 1x باستخدام PBS (5 مل لكل 75 سم2 قارورة) تليها الحضانة في محلول HBSS يحتوي على 0.05٪ التربسين و 0.53 mM EDTA (2 مل لكل 75 سم2 قارورة).
  2. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. إزالة وتجاهل supernatant.
  4. إعادة تعليق بيليه في 2 مل من DMEM تحتوي على 2٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1٪ المضادات الحيوية / مضاد الأميكتيك. عد الخلايا الحية.
  5. تعيين هيمي-كالفارياإلى كل مجموعة دراسة (أي، مجموعة التحكم السلبي والثقافة المشتركة لالحمض النووي الريبي أو تحليل الأنسجة).
  6. إزالة وسائل الإعلام الثقافة من الكالفاريات هيمي وإضافة 1 مل من DMEM تحتوي على 2٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية / antimycotic تستكمل أو لا تستكمل مع الخلايا السرطانية.
    ملاحظة: يمكن أن يتغير مقدار الخلايا التي يجب إضافتها اعتمادًا على خط الخلية الذي تم اختباره. مع الخلايا السرطانية مثل MDA-MB-231 أو PC-3، 500،000 خلية لكل عمل جيد يعمل بشكل مناسب.
  7. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. تمرير كل هيمي كالفاريا إلى بئر جديد للاحتفاظ فقط الخلايا السرطانية التي تلتزم الأنسجة العظمية.
  8. احتضان لمدة 7 أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 وتغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام.

4- التثبيت

  1. قطع مربعات من ورق الأنسجة لالتفاف هيمي-كالفارياس.
    ملاحظة: يمكن أيضًا استخدام منصات رغوة الخزعة أو كبسولات الصلب للخزعات الصغيرة.
  2. استخدام ملقط غرامة على التوالي لالتقاط كل من هيمي-كالفوريا من خياطة القوس، ووضع هاعلى ورقة الأنسجة، والتفاف.
  3. ضع الهيمي-كالفاريا الملفوفة داخل كاسيت تضمين مكتوب عليه.
  4. ضع الكاسيت في حاوية مع 10٪ فورمالين فوسفير المخزنة.
  5. إصلاح لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية.

5- إزالة الكلسة

  1. إزالة الفورمالين، إضافة 1x PBS، وتحريك الأنسجة لمدة 30 دقيقة لشطف هيمي-كالفارياس.
  2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 10٪ EDTA (درجة الحموضة = 8، 0.34 M).
    ملاحظة: تحقق من أن الحل يغطي الأنسجة بالكامل.
  3. إزالة الكليسسيف الأنسجة لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية.
  4. تجاهل محلول EDTA وإضافة 1x PBS لشطف الأنسجة.
  5. تخزين هيمي كالفاريا سفي 70٪ الإيثانول حتى تجهيز الأنسجة.

6- معالجة الأنسجة

  1. تجفيف الأنسجة مع جولات من الإيثانول 96٪ ، 60 دقيقة (3x) ، تليها الإيثانول 100 ٪ ، 60 دقيقة (3x).
  2. استبدال الإيثانول بنسبة 100٪ xylene، 60 دقيقة (3x).
  3. احتضان الأشرطة في شمع البارافين، 60 دقيقة (2x).

7- التضمين

  1. فتح الأشرطة، وإزالة بعناية ورقة الأنسجة، وفك calvaria.
  2. التقاط كل calvaria بعناية وكومة جميع هيمي-calvarias من نفس المجموعة في نفس الاتجاه.
  3. ضع بعض البارافين في قالب
  4. التقاط جميع هيمي-calvarias مع ملقط ووضعها داخل القالب مع خياطة القوس أسفل نحو قاعدة القالب.
    ملاحظة: اتجاه الهيمي-كالفاريا في القالب أثناء التضمين أمر بالغ الأهمية للحصول على أقسام النسيجية المتسقة والنتائج القابلة للتكرار لأن هذا التوجه سيسمح بالتعرف الخلفي للعظام الأمامية والجدارية من الكلفاريا والخياطة الإكليلية التي تسهل التقييم الكمي.
  5. الافراج عن ملقط والتحقق من أن هيمي كالفاريا ستبقى في مكانها.
  6. ضع الكاسيت المسمى فوق القالب واملأه بالمزيد من البارافين لتغطية الهيمي-كالفارياس.
  7. نقل القوالب إلى السطح البارد.

8- قسمة

  1. تقليم 500-600 ميكرومتر من خياطة القوس مع microtome.
  2. قطع 4 ميكرومتر أقسام سميكة، وجمع المقاطع اللازمة.
  3. تقليم آخر 300 ميكرون.
  4. قص وجمع آخر ستة أقسام سميكة 4 ميكرون.
  5. تقليم كتلة 300 ميكرون كذلك وجمع المزيد من المقاطع.
  6. قم بتركيب المقاطع على شرائح المجهر الزجاجي.
  7. تجفيف الشرائح في RT.

9. تلطيخ

  1. تزج المقاطع في 100٪ xylene لمدة 3 دقيقة.
  2. الغمر في الإيثانول 100٪ لمدة 1 دقيقة.
  3. دمج في 96٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
  4. تزج في الإيثانول 80٪ لمدة 1 دقيقة.
  5. الغمر في الإيثانول 70٪ لمدة 1 دقيقة.
  6. شطف في الماء لمدة 3 دقيقة.
  7. غمر في هيماتوكسيلين لمدة 3 دقيقة.
  8. شطف في الماء حتى القسم واضح.
  9. غمر في محلول كربونات الليثيوم المشبعة لمدة 10 ثوان.
  10. شطف في الماء لمدة 3 دقيقة.
  11. مغمورة في 96٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
  12. غمر في إيوسين لمدة 3 دقيقة.
  13. تزج في 96٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
  14. الغمر في الإيثانول 100٪ لمدة 1 دقيقة.
  15. غمر في 100٪ xylene لمدة 3 دقيقة.
  16. أضف بعضًا لكل وسط جبل إلى الشريحة وقم بحمايتها باستخدام قسيمة تغطية.
    ملاحظة: يمكنك استكمال هيماتوكسيلين وإيوسين (H & E) تلطيخ مع الفوسفاتاتا حمض مقاومة الترطانات (TRAP) تلطيخ لتقييم هشاشة العظام وهشاشة العظام.

10 - التقييم الكمي: تحديد مجال التحليل

  1. فحص المقاطع تحت قوة منخفضة (أي 4x) لتحديد الاتجاه والغرز.
  2. تحديد خياطة الإكليلية وتحديد سطح العظام طويلة على جانب واحد وسطح قصير على الجانب الآخر.
  3. تحديد خياطة الإكليلتحت التكبير 40x، ونقل اثنين أو ثلاثة حقول بصرية بعيدا عن خياطة على طول السطح الطويل. التقط صورًا لهذه المنطقة لتحليلها.
  4. حدد منطقة العظام القديمة ومنطقة العظام الجديدة. وإيوسين Y مع البرتقالي G البقع العظام القديمة أغمق وأخف وزنا العظام الجديدة.
  5. قياس المساحة الإجمالية للعظم القديم والجديد مع برنامج Image J باستخدام أداة عتبة اللون. التعبير عن النتائج كما μm2.

11 - تحليل البيانات

  1. تحليل النتائج باستخدام البرامج الإحصائية. يمكن تحديد الاختلافات الكبيرة بين المجموعات باستخدام الاختبارات المناسبة (على سبيل المثال، اختبار مان ويتني يو غير البارامترية كما هو الحال في هيرل).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقييم تكوين العظام في نموذج الكلفاري، قمنا بزراعة الهيمي-كالفاريا في الوسائط مع أو بدون 50 ميكروغرام/مل من الأنسولين. تم إعداد أقسام الأنسجة وملطخة بـ H & E. في هذه الظروف ، أظهر علم الأنسجة أنه تم الحفاظ على السلامة الهيكلية للعظم الكلوري ، مما يسمح بتحديد مكوناته المختلفة(الشكل 1). قدمت الكلفاريات المعالجة بالأنسولين زيادة في كمية الأنسجة العظمية مقارنة بالتحكم(الشكل 2A). أكد التحليل الكمي للمقاييس الهيمتو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، ونحن نصف بروتوكول لنموذج الجسم الحي السابق calvari لتقييم تكوين العظام أو ارتشاف ودراسة تفاعلات الخلايا السرطانية مع عظم الفأر ة calvarial. الخطوات الحاسمة لهذه التقنية هي تشريح ، والثقافة ، والتضمين ، وتحليل الكالفتريا. خلال تشريح الكالفاريات ، من الأهمية بمكان قطع الهيمي -كالفاريا إلى شبه منحرف ، لأنه سيسهل بقوة التوجه أثناء إدراج البارافين. عند دراسة تفاعلات الخلايا السرطانية مع الكلفاريات، من المهم استخدام لوحات متعددة الآبار التي لا يتم علاجها لثقافة الخلايا لمنع الخلايا السرطانية من التمسك والنمو على...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون ماريو نومورا، دكتوراه في الطب ورودولفو دياز لمساعدتهم في علم الأنسجة، وبييرك فورنييه، دكتوراه لتعليقاته القيمة لتحسين نوعية الورقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24 ثقافة خلية بئرCorningCLS3524
24 بئر غير مزرعة الأنسجةFalcon15705-060
2 مل CROVIALSSI2341-S0S
المضادات الحيوية المضادة للفطرياتCorning30-004-CI
BSABiowestP6154-100GR
الطرد المركزيEppendorf22628188جهاز طرد مركزي 5810R
CoverslipsCorning2935-24X50
راتنج Cytosealريتشارد ألين8310-10
DMSOD2650-100ML
تعديل Dulbecco للنسور المتوسطة ، مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و L-glutamine ، بدون بيروفات الصوديومCorning10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)Corning20-031-CV
أشرطة EbeddingSigmaZ672122-500EA
EDTAGolden26400
تضمين محطة عملThermo ScientificA81000001
EosinGolden60600
Ethanol absoluteJALMEKE5325-17P
مصل الأبقار الجنينيBiowestBIO-S1650-500
مرشحاتكورنينجCLS431229
ملقط ومقصLANCETA HG74165
فورمالين مخزن 10٪شرائح زجاجية HT501320
سيجما 25 × 75 ممPremiere9105
Harris's HematoxylinJalmekSH025-13
شفرات رفيعةThermo Scientific1001259
HistoquinetThermo Scientific813150STP 120
الأنسولين من البنكرياس البقريSigma16634
مجهرZEISSAxio Scope.A1
MicrotomeThermo Scientific905200MICROM HM 355S
طعام الفأر ، 18٪ بروت ، 2018SHarlanT.2018S.15
NeubauerVWR631-0696
برتقالي GبيوبياسيكOB0674-25G
بارافينبارابلاست39601006
قسم البارافين التعويم حمامMH8517X1كهروحراري
بتريكورنينجCLS430167
فلوكسين ببروبيوتيك166-02072
تريبان بلوموزع شمع سيجماT8154
تريبسين-EDTAكورنينج25-051-CI
MH8523BX1كهروحراري
زيلينذهبي534056-500 مل
المستوى طبق

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
  2. Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
  3. Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
  4. Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
  5. Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
  6. Mundy, G. R. Mechanisms of bone metastasis. Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).
  7. Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
  8. Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
  9. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
  10. Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818(2016).
  11. Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
  12. Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
  13. Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
  14. Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone RemodelingCalvaria CultureTumor Bone MicroenvironmentHistomorphometric AnalysisEx Vivo ModelCancer Cell Co cultureInsulin TreatmentMDA MB 231 CellsTissue ProcessingQuantitative Analysis

Related Articles