توصيف مستقلة تماما وجمع البيانات من بلورات جزيئات البيولوجية

Summary

وهنا، نحن تصف كيفية استخدام الفرز الآلي وخيارات جمع البيانات المتاحة في بعض بيملينيس السنكروتروني. العلماء إرسال عينات كريوكوليد إلى السنكروتروني، ويتم فحص خصائص الحيود ومجموعات البيانات التي تم جمعها ومعالجتها و، حيثما أمكن، حل هيكل ينفذ — كل ذلك دون تدخل بشري.

Abstract

الحزم الأشعة السينية عالية-تألق مقترنة بأتمتة أدت إلى استخدام بيملينيس على أساس السنكروتروني البلورات بالأشعة السينية الجزيئات (MX) للمشاريع الأكثر تحديا حتى في الأحياء الهيكلية. ومع ذلك، معظم المرافق لا تزال تتطلب وجود عالم في الموقع لإجراء التجارب. جيل جديد من بياملينيس الآلي مخصصة لتوصيف التلقائي بالكامل، وجمع البيانات من بلورات الجزيئات البيولوجية الكبرى قد وضعت مؤخرا. وتمثل هذه بياملينيس أداة جديدة لعلماء الأحياء الهيكلية لفحص نتائج المحاكمات تبلور الأولية و/أو جمع عدد كبير من مجموعات البيانات الحيود، المستعملين دون الحاجة إلى التحكم في بيامليني بأنفسهم. هنا نعرض كيفية إعداد تجربة للفرز التلقائي، وجمع البيانات، وكيف يتم إجراء تجربة على بيمليني، كيفية معالجة مجموعات البيانات الناتجة عن ذلك، وكيف، عندما يكون ذلك ممكناً، يتم حلها بنية بلورية جزيء ضخم البيولوجية.

Introduction

تحديد هيكل ثلاثي الأبعاد للبروتينات معينة أمر حاسم في علم الأحياء. المعلومات مشتق من القيام حتى يلقي الضوء على الوظيفة البيولوجية وعلى الشكل والنوعية للمواقع النشطة و/أو الملزمة الواردة في جزيء قيد الدراسة. في كثير من الحالات، وهذا ما يسمح آليات العمل تحديد، أو عند الاقتضاء، المحتملة جزيئات علاجية توضع. الإرسال المتعدد هو الأسلوب الأكثر استخداماً للحصول على المعلومات الهيكلية، ولكن عنق زجاجة هو تحديد الظروف المثلى للحصول على بلورات ديفراكتينج جيدا. ولذلك، تبلور المحاكمات تجري في ظروف مختلفة عديدة وفرزا، ثم العثور على بلورات أفضل التي ستستخدم لجمع البيانات الحيود. أتمتة برنامج الإعداد من بلورة تجارب¹ وضوح ساعد في هذا الصدد. ومع ذلك، الخطوات اللاحقة (أي تركيب الكريستال والفرز الحيود وجمع البيانات الحيود) عادة ما تنفذ يدوياً، تناول الكثير من الوقت والجهد والموارد. أتمتة حيود التحري وجمع البيانات، لذلك، يعني مكسب هائل في الوقت والكفاءة.

حيود التحري وجمع البيانات في نطاق يتم في أغلب الأحيان في بيملينيس السنكروتروني MX التي سهلت التشغيل الآلي إلى حد كبير هذه العملية. ومع ذلك، في معظم الحالات، من الضروري للعلماء أن يكونوا موجودين في بيمليني أثناء تجربة أو لتشغيلها عن بعد. جيل جديد من بيملينيس MX مؤتمتة بالكامل في الآونة الأخيرة نمواً². وهنا، لا يحتاج المستخدمون يكون حاضرا، أما جسديا أو عن بعد، خلال جلسة تجريبية. يسمح هذا العلماء إلى أنفاق المزيد من الوقت على أقل من المهام الروتينية، بدلاً من أيام أسرة الإنفاق، وكثيراً ما ليال وبلورات التحري وجمع البيانات الحيود. بيامليني مؤتمتة بالكامل الأول في العالم هو "واسع الآلي عينة مختارة متكاملة مرفق" (ماسيف-1، ID30A-1)^2،3 في مرفق الإشعاع السنكروتروني الأوروبية (أسرف). أنها بيئة عينة فريدة من نوعها التي تعمل فيها ديوار المحتوية على العينة ذات قدرة عالية بالترادف مع مغير عينة روبوتية التي تعمل أيضا بيمليني جونيوميتير^4،5. كتلة صخرية-1 هو بيمليني أوندولاتور مجهزة بمفرده-فوتون-عد هجين بكسل كاشف⁶، التي تعمل في موجه ثابتة من 0.969 (12.84 كيلو إلكترون فولط) مع شعاع الأشعة سينية مكثفة (2 × 10¹² الفوتونات/s). يمكن ضبط حجم الحزمة في الموضع عينة بين الحد أدنى من 10 ميكرون (جولة شعاع) بحد أقصى 100 ميكرومتر x 65 ميكرومتر (الأفقية بحجم شعاع عمودي). في المتوسط، يمكن بيمليني العملية، في تلقائية تماما أزياء بلورات 120 (انظر أدناه)، في 24 ساعة. تشغيل بيامليني يستند إلى سلسلة من مهام سير العمل⁷، كل منها يأخذ قرارات ذكية استناداً إلى نتائج الخطوات السابقة في سير العمل، لضمان قياس أفضل البيانات الممكنة من العينة قيد الدراسة. على وجه الخصوص، تقييم خصائص الحيود عينة فردية تأخذ بعين الاعتبار كريستال حجم والتمويه ويضمن، حيث الكريستال أكبر من شعاع الأشعة السينية، أن يستخدم فقط المنطقة أفضل من الكريستال للبيانات اللاحقة جمع. وهكذا، الأمثل مجموعات البيانات الحيود للقرار كحد أقصى مع الإشعاع المصغر الأضرار^2،3. تطالب بروتوكولات جمع البيانات، مثل استراتيجيات جمع حلزونية الزائفة (موقف متعدد) البيانات لكلا حيود الشاذة الأصلية وطول موجي واحد (SAD) جمع البيانات، وهي أيضا متاحة⁸.

تجارب تلقائية تماما في كتلة صخرية-1 إشراك كريوكولينج وتركيب البلورات على جبل مغناطيسي عينة مناسبة لمستوى المعدات المطلوب بيامليني دبابيس العمود الفقري⁹، إدخال المعلمات التجريبية المرغوب في ' الحيود خطة 'الجدول في"النظام المتكامل""البروتين البلوري" بيملينيس (إيسبيب)¹⁰، نظام إدارة معلومات المستندة إلى ويب لتجارب MX، وإرسال العينات إلى بيمليني. في أسرف، جميع تكاليف النقل للعينات من بيامليني التي يدعمها "مكتب المستخدم أسرف" (انظر الموقع الإلكتروني ل أسرف¹¹ لمزيد من التفاصيل). كتلة صخرية-1، لا توجد قيود على حجم التكرار الحلقي أو نوعية الكريستال. عند اختيار خطة حيود لبلورة معين، يمكن للمستخدم استخدام الإعدادات الافتراضية أما أو اختر من سير العمل المحددة، والتي يمكن أن تكون مخصصة لكل عينة. وتتوفر العديد من مهام سير العمل مبرمجة مسبقاً. في سير العمل مكسبريسي³ ، تتم محاذاة الحلقة المحتوية على عينة أولاً إلى موقف العينة استخدام التوسيط الضوئية. ثم، المستندة إلى أشعة X توسيط يضمن أن المنطقة أفضل من الكريستال يتم توسيط لشعاع الأشعة السينية. ثم تحسب استراتيجيات جمع البيانات استخدام عيدنا، إطارا لتطوير التطبيقات المستندة إلى البرنامج المساعد خاصة لتحليل البيانات على شبكة الإنترنت في مجال تجارب الأشعة السينية، آخذا في الاعتبار كريستال حجم والتمويه في الوقت الحقيقي في بيمليني. عقب جمع مجموعة من البيانات حيود كامل، هذا هو ثم معالجتها باستخدام سلسلة من أنابيب معالجة البيانات الأوتوماتيكية¹² وتتاح النتائج التفتيش وتحميل في إيسبيب. سير العمل³ SAD مكسبريسيتهدف إلى سيلينوميثيونيني التي تحتوي على بلورات البروتين المستهدف ويستغل حقيقة أن الطاقة التشغيلية من كتلة صخرية-1 فقط فوق حافة ك سراج الدين. هنا، هو استراتيجية جمع البيانات عيدنا مكسبريسي الأمثل لجمع البيانات حزين (أي التكرار عالية، ومع قرار تعيين إلى حيث R_الدمج بين أزواج بيجفوت أقل من 5%). شاشة خصائص الحيود سلسلة من بلورات دون جمع البيانات اللاحقة، يمكن استخدام سير العمل³ مكسسكوريلإجراء تقييم جودة كاملة من بلورات تحليلها. في سير العمل³ مكسبريسي، جمعت 180 ° للتناوب البيانات باستخدام ذبذبات 0.2 ° واستخدام زاوية phi البداية والقرار تحدد استراتيجية عيدنا. مكسبريسو ³ يتضمن قرارا بريوبسيرفيد في سير العمل (الافتراضي: د_دقيقة = 2). جعل تقييما أولياً لبلورات الناتجة عن بلورة لمحاكمة، وتقدم سير العمل³ مكسبريسم. وهذا ينفذ شبكة جرعة عالية المسح الضوئي عبر اتجاه أوسع لدعم نموذج مع لا جمع البيانات أو توسيط. في الآونة الأخيرة، كانت اثنين سير التجربة الجديدة، مكسبريسب ، و MXPressP_SAD، والقيام بعمليات جمع البيانات بسيودوهيليكال، نفذت⁸. تنفيذ كافة الخطوات في كافة مهام سير العمل التي يمكن اتباعها على الإنترنت وفي الوقت الحقيقي من المستخدم، وعن طريق إيسبيب.

هنا نعرض كيفية إعداد تجربة MX مؤتمتة بالكامل في كتلة صخرية-1 وكيفية استرجاع وتحليل البيانات الناتجة عن هذه التجربة. على سبيل مثال، نحن نستخدم جليكاين المتقدرية البشرية الانقسام ونظام البروتين ح (جكش). هذا البروتين الذي يحتوي على حامض يبويتش جزء من نظام الانقسام جليكاين المسؤولة عن تدهور جليكاين. يتضمن هذا النظام كذلك البروتين ف، decarboxylase بيريدكسال جليكاين تعتمد على الفوسفات والبروتين T، إنزيم تيتراهيدروفولاتي-التي تتطلب والبروتين L، نازعة ليبواميدي. جكش ينقل مجموعة ميثيلاميني جليكاين من البروتين ف للبروتين T. عيوب في البروتين ح هي السبب في هايبرجليسينيميا نونكيتوتيك (نخ) في¹³من البشر.

Protocol

ملاحظة: إنتاج وتنقية، وبلورة جكش موصوفة في التكميلية الملف 1.

1-وصف موجز لإعداد اتصال وتركيب كريستال

1. موقف حلقة نايلون أو دعم تركيب كريستال آخر الفعل ثابتة لدبوس العمود الفقري تحت بلورات واحد أو أكثر وانتشالهم من الحل هطول الأمطار (20 ميليلتر من الصوديوم 0.5 M فورمات pH 4.0 + 25 ميليلتر من حل البروتين).
   1. إزالة السائل الأكبر حول crystal(s) بلمس الجبل مع فتيلة ورقة تمتص قبالة أي سائل الزائدة.
2. نقع في crystal(s) في حل كريوبروتيكتيفي التي تحتوي على حل هطول الأمطار بالإضافة إلى 30% والغليسيرول؛ ثم، قم بإزالة دعم الكريستال و crystal(s).
   1. إزالة السائل الأكبر حول crystal(s) بلمس الجبل مع فتيلة ورقة تمتص قبالة أي سائل الزائدة.
3. يغرق في الجبل في العمود الفقري قنينة مملوءة بالنيتروجين السائل وتخزينه، جنبا إلى جنب مع أي من بلورات أخرى وبالمثل أعد، في مختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي (EMBL)/نموذج أسرف مغير عفريت⁹ في درجة حرارة النتروجين السائل.
   ملاحظة: crystal(s) مستقرة في هذا الشرط حتى يتوفر بيمتيمي.

2-طلب بيمتيمي على كتلة صخرية-1

1. طلب بيمتيمي لها في أقرب وقت ممكن على الصفحة الرئيسية أسرف (في http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   ملاحظة: هناك عدة طرق ممكنة للوصول إلى بياملينيس MX أسرف. يمكن تطبيق المختبرات جماعياً كجزء من مجموعة تخصيص كتلة (حقيبة)، أن يكون بيمتيمي المخصصة لمدة 2 سنة. إذا كانت مجموعات ترغب في تطبيق على حدة، يمكن انطباقها المتداول الوصول، مما يتيح لهم إمكانية الوصول السريع إلى بيملينيس بعد استعراض الأقران. سوف استعرض على اقتراح الفريق ومسح مجموعة السلامة أسرف الذين قد يطلبون الحصول على تفاصيل إضافية. إذا تم قبول هذا الاقتراح، سوف يبلغ عدد التجربة وكلمة مرور. يمكن إجراء البحوث الملكية عن طريق شراء بيمتيمي.
2. إكمال السلامة المطلوبة التدريب على الإنترنت (في http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. كتاب بيمتيمي على "التقويم" كتلة صخرية-1.
   ملاحظة: من الممكن أن الكتاب إلى حد أقصى 50 أصحاب العينة لتحليل كل نوبة.
4. تعبئة نموذج لتعريف البريد في تجربة (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form)، جنبا إلى جنب مع معلومات الأمان المطلوبة، للعينات التي يمكن قياسها.

3-وضع خطة حيود في إيسبيب

ملاحظة: الخطة حيود يحمل جميع المعلومات اللازمة عن عينة في إيسبيب ويمكن أن تحتوي على معلومات إضافية لتكييف هذه التجربة لكل عينة.

1. فتح إيسبيب (في https://exi.esrf.fr/).
2. اختر تجارب MX.
3. تسجيل الدخول باستخدام رقم التجربة وكلمة المرور.
4. انقر فوق الشحن | إضافة جديدة وتوفير المعلومات اللازمة. انقر فوق حفظ.
5. انقر فوق إضافة قطعة وتعبئة المعلومات المطلوبة. انقر فوق حفظ.
6. ثم انقر فوق إضافة حاويةوتعطي الرمز الشريطي الصولجان كالاسم واختر عفريت العمود الفقري. انقر فوق حفظ.
7. انقر فوق رمز حاوية و تحريرها، وملء المعلومات الضرورية، مثل اسم البروتين، سير العمل المفضل، موقف كريستال في الصولجان، وما إلى ذلك، فيما يتعلق بالعينات.
8. اختر البروتين (على سبيل المثال، جكش أو lysozyme) التي وافقت عليها مجموعة السلامة أسرف.
9. قم بإدخال اسم نموذج فريد لتحديد كل عينة الفردية. فمن الممكن مسح الباركود pin اختيارياً. بقية المعلومات الواردة أدناه اختياري.
10. أدخل معلومات اختيارية.
    1. لكل عينة الفردية، أدخل نوع التجربة (أي MXPressE_SAD أو نقاط، أو مكسبريسو، إلخ، الافتراضية مكسبريسي) تحت نوع [ااكسب]. وهذا يحدد سير العمل التلقائية التي ستستخدم لمعالجة كل كريستال. نظراً لأن البلورات جكش هي الإبر، اختر مكسبريسب.
    2. أدخل مجموعة الفضاء (على سبيل المثال، C2، P1 أو P2₁2₁2₁)، إذا كانت معروفة. إذا كانت موجودة، ستستخدم هذه لحسابات استراتيجية جمع البيانات وعن طريق خطوط الأنابيب التجهيز الآلي للبيانات المتاحة.
    3. أدخل الدقة المطلوبة (الافتراضي: د_دقيقة = 2.0 Å). وهذا يحدد المسافة كريستال لكاشف لمسح الشبكة الأولى ووصف، وجمع البيانات الافتراضية.
    4. تعيين دقة الحد الأدنى المطلوب (على سبيل المثال، 1.5 Å أو 2.3Å)، لمنع مجموعة مجموعات كاملة من البلورات التي لا ديفراكت إلى هذا الحد. هذا يمكن أن يوفر تخزين البيانات الفضائية وتحليل الوقت.
    5. تعيين اكتمال المطلوب (الافتراضي: 0.99). تعيين التعدد مطلوب (الافتراضي: 4). إذا كان كريستال أكثر من يرد على دعم عينة، تعيين العدد الأقصى من بلورات يتم تحليلها. القيمة الافتراضية هي 1 أو 5 مكسبريسب.
    6. حدد حجم الحزمة المناسبة (الافتراضي: 50 ميكرومتر). إذا لم يتم تحديد قيمة محددة، سيتم إجراء أشعة X التوسيط وحسابات استراتيجية جمع البيانات مع حجم شعاع 50 ميكرومتر.
       ملاحظة: أثناء أي جمع مجموعات البيانات اللاحقة، حجم الحزمة سيتم تكييفها تلقائياً.
    7. وضع في مجموعة الفضاء، إذا كان معروفا، في العمود المجموعة الفضاء القسري. تعيين الإشعاع-حساسية البلورات (0.5-2.0 لحساسية على ارتفاع منخفض، مع قيمة افتراضية 1).
11. إذا رغبت في ذلك، بتعيين زاوية الاستدارة الإجمالية التي سيتم جمعها لجمع البيانات الكاملة (الافتراضي: زاوية الاستدارة المجموع يحدده عيدنا).
12. حفظ القيم. انقر فوق العودة إلى الشحنات. اضغط على إرسال الشحنة إلى أسرف.
13. طباعة التسمية الشحن وإرسال العينات. وينبغي ترتيب المستخدمين سيارة بيك آب مع ساعي، باستخدام معلومات حساب أسرف.
    ملاحظة: من المهم جداً لتحديد تضمين تسمية العودة السماح بعودة السلس من عينات (انظر https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4-جمع البيانات وعرضها واسترجاعها

ملاحظة: اليوم من التجربة، يتم نقل العينات إلى كتلة صخرية-1 عالية القدرة ديوار (HCD). ثم إطلاق العلماء بيمليني في جمع البيانات، والتي يمكن اتباعها من قبل المستخدمين عن بعد. لكل نوع من أنواع مختلفة من عينة يتلقى المستخدمون رسالة بريد إلكتروني تم إبلاغهم بأنه قد بدأت عملية جمع البيانات. كما سبقت الإشارة، يمكن أن يتبع تنفيذ كافة الخطوات في كافة مهام سير العمل على الإنترنت وفي الوقت الحقيقي بالمستخدم عن طريق إيسبيب، الذي يمكن عرض النتائج وتحميلها.

1. لكل عينة تم تحليلها، دراسة نتائج التجربة التلقائية في إيسبيب (https://exi.esrf.fr/).
   1. تسجيل الدخول، باستخدام رقم التجربة وكلمة المرور، ثم انقر فوق الدورة التجريبية المطلوبة في ID30A-1.
   2. حدد المفضلة (سجل أعلى) حدث خط الأنابيب (على سبيل المثال، قنابل يدوية أو XDS_APP) وتحميل البيانات المكتوبة في مجموعة الفضاء الصحيح مع اكتمال أعلى وأعلى دقة بالنقر فوق نتائج جمع آخر ، ثم تحميل.
      ملاحظة: جميع الصور مش، والخط، وتوصيف في دليل فرعي لكل عينة، ودعا/MXPressE_01. أسرف تلقائياً بتشغيل خمس مجموعات معالجة منفصلة، هي: EDNA_proc¹²وقنابل¹²، XDS_APP¹⁴، أوتوبروك¹⁵و XIA2¹⁶. تكامل البيانات يستند إلى XDS، باستثناء XIA2، الذي يرتكز على الأوجه. يتم تشغيل كافة الحزم أيضا في أوضاع شاذة ونونانومالوس، مما يتيح الكشف التلقائي لإشارة شاذة، إذا كانت موجودة في البيانات، التي ستستخدم في الساحل والتدريجي للبروتوكولات. كل حزمة يستخدم معلمات مختلفة وأشجار القرار، مما يعني أن بعض مجموعات تعمل بشكل أفضل مع بعض العينات. ومع ذلك، هذا يمكن أن يجعل لعدد كبير من النتائج عندما يحسب عدد الحزم والمجموعات الفضائية المحتملة. ولذلك، أن النتائج تصنف تقريبا على أساس القرار والمقاييس النوعية الأخرى، مثل البحث والتطوير_دمج في شل القرار أدنى، CC(1/2)، واكتمال. وهذا يهدف إلى توجيه المستخدم إلى مجموعات بيانات أفضل، ولكن جميع المجموعات الفضائية المحتملة والنتائج ينبغي تفتيشها بدقة.
2. فك مجلد التحميل، التي ستشمل جميع ملفات السجل و XDS_ASCII غير مدمجة. HKL وملفات.mtz المدمجة وتوسيع نطاقها.
   ملاحظة: في حال تم إيداع الهيكل (في تنسيق PDB) البروتين الفائدة أو هومولوج وثيق إيسبيب في بداية التجربة، خط الأنابيب حدث في أسرف سوف تلقائياً إجراء بديل جزيئية (السيد) تشغيل استخدام هذه البنية نموذج البحث عن أفضل سجل الحل. نتائج خط الأنابيب السيد يتم عرضها في إيسبيب ويمكن العثور في مجلد البيانات المجهزة (على سبيل المثال،/data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir/). وهنا سيتم تسمية النموذج النهائي coot1.pdb و sidechains.mtz بيانات الانعكاس. لاحظ أن خط الأنابيب قد تقلل من التماثل للخلية (الحد من خلية بدائية) من أجل زيادة احتمالات التوصل إلى حل. في الحال هنا، كتب السيد خط الأنابيب إلى الحل في خلية أحادي ميل (C2) بدلاً من خلية أورثورهومبيك (C222₁). تفاصيل حول كيفية القيام باستبدال جزيئية تشغيل يدوياً (مثال للحل الثاني حدث أفضل سجل) مضمنة في ملفات تكميلية.

Results

تم استخدام سير العمل مكسبريسب في بيامليني أسرف ماسيف-1 تلقائياً تماما، جبل، مركز في شعاع الأشعة السينية، تميز، وتجميع مجموعات البيانات حيود الكامل من سلسلة من بلورات جكش البشرية. تم تحميل العينات وتحليل الحلقة لمنطقة المسح الضوئي (الشكل 1، يسار). وبعد تحليل حيود، اختيرت أربع نقاط داخل البلورة لجمع البيانات (الشكل 1، حق). معالجة بواسطة أنابيب التحليل الآلي للبيانات، بما في ذلك خط الأنابيب السيد، تسفر عن مجموعات بيانات عالية الجودة (الجدول 1) التي عثر على حل السيد اللاحقة. هذا الأخير يسمح للمستخدمين بسرعة تقييم ما إذا كانت مجموعة البيانات التي تم الحصول عليها ونموذج البحث المستخدمة مناسبة للتخلص التدريجي قبل الاستبدال الجزيئي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الحكم وجود يغاندس، مما يتيح للمستخدم التركيز فقط على مجموعات البيانات الأكثر تبشيرا بالنجاح لمزيد من التحليل. تصميم بنية دليل بالسيد أسفرت عن خارطة كثافة الإلكترونات عالية الجودة بعد واحد الآلي دورة الصقل (الشكل 2a). قطع خط الأنابيب الآلي dataset هذه البيانات في 1.32 القرار؛ ومع ذلك، يمكن للمستخدمين تحديد ما زال قص البيانات بدقة أقل للوصول إلى إحصاءات نوعية مختلفة (CC R_1/2، < I/σ(I) >،_{الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف}) في شل القرار أعلى. بنية بلورية البشرية جكش هيكل شبيه بالبروتين البقري (3KlR)¹⁶.

كثافة الإلكترونات المستمر مرئياً لسلسلة كاملة من الأحماض الأمينية، وبصرف النظر عن علامة الحامض الأميني الطرفي ن. استبدالات الأربع التي تميز جكش البشري والبقري، ثلاثة يمكن تحديدها بسهولة في كثافة الإلكترونات (إيل/Val66، وآسيا والمحيط الهادئ/Glu98، ولوي/Phe149؛ الشكل 2 -د). وهذا أقل وضوحاً لاستبدال Asp/Lys125 التي كثافة الإلكترونات سلسلة الجانب يتم حلها جزئيا فقط بسبب المرونة (الشكل 1e). النموذج الذي تم الحصول عليه حاليا قد آر_العمل وقيم R_مجاناً من 20.4 في المائة و 23.8 في المائة، على التوالي، ويمكن أن يكون الأمثل المزيد من دورات إضافية لبناء نموذج الآلية واليدوية وصقل.

	أنابيب قنابل يدوية	أنبوب XDS_APP
جمع البيانات وتجهيزها
الأشعة السينية المصدر/شعاع خط	أسرف/ماسيف-1
الطول الموجي (Å)	0.966
القرار (Å)	41.88 – 1.48 (1.53 – 1.48)	41.86-1.32 (1.39-1.32)
المجموع/فريد التأملات	127670/28644	177332/40134
	(12178/2775)	(23772/5714)
مجموعة الفضاء للفهرسة، والقياس، ودمج	C222	C2221
أبعاد الخلية
أ، ب، ج ()	42.20، 83.75، 95.85	42.19، 83.72، 95,82
موسيسيتي	0.05	0.05
Rالاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (%)	10.0 (110.7)	11.1 (198.2)
< I/σ(I) >	9.6 (1.3)	7.6 (0.7)
ج ج1/2 (%)	99.7 (53.9)	99.7 (19.1)
كمال (%)	99.6 (99.6)	99.5 (98.6)
تعدد	4.5 (4.4)	4.4 (4.2)
استبدال الجزيئية وصقل نموذج أولى
مجموعة الفضاء للتخلص التدريجي	C2	C2221
أبعاد الخلية
أ، ب، ج ()	83.74، 42.18، 95، 82	42.19، 83.72، 95,82
Α، Β، Γ (°)	90, 90.03, 90	90، 90، 90
نموذج بحث للسيد (PDB)	3KLR	3KLR
جزيئات البروتين/جامعة ولاية أريزونا	2	1
بقايا البروتين	250	125
Rالعمل/Rالحرة (%) بعد التنقيح 1	24.3/26.5	20.4/23.8
رمسد بوند طول (Å) بعد التنقيح 1	0.01	0.01
رمسد بوند زاوية (°) بعد التنقيح 1	1.2	1.83
روتامير الخارجة (%) بعد التنقيح 1	1.07	4.29
راماشاندران يحبذ/السماح/غير مسموح به (%) بعد التنقيح 1	95.93/4.07/0	95.12/4.88/0

الجدول 1: إحصاءات جمع، والصقل، والتحقق من صحة البيانات حيود الأشعة السينية- يتم إعطاء قيم لشل القرار أعلى بين قوسين معقوفين.

رقم 1: نموذج تحليل قبل جمع البيانات- (أ) المنطقة المحددة للمسح الضوئي ويتضح من مربع أحمر. (ب) تحليل الصور حيود يظهر كخريطة حرارة. واختيرت أربعة مناصب داخل البلورة يقع لجمع البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: التحقق من الصحة البصرية من خرائط كثافة الإلكترونات التي تم الحصول عليها بعد الصقل. خرائط كثافة الإلكترونات أحيط 2 x مستوى التربيعي حول () Trp143، (ب) Val66 (إيل في جكش البشرية)، و (ج) Glu98 (آسيا والمحيط الهادئ في جكش البشرية) وخرائط أحيط في 1 x مستوى r.m.s حول (د) Phe149 (لوي في جكش البشرية) و (ه) Lys125 (آسيا والمحيط الهادئ في جكش البشرية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

بياملينيس التلقائي بالكامل توفر الآلي توصيف وجمع البيانات من إعداد كبيرة من بلورات الجزيئات دون الوجود عالم، أما في بيامليني أو عن بعد، يجري المطلوبة. وقد بياملينيس مؤتمتة بالكامل باستخدام العديد من المزايا مقارنة بالتشغيل اليدوي. المثال، النموذج الآلي التوسيط، استناداً إلى شبكة الأشعة السينية، وخط المسح الضوئي، وهو أكثر دقة من التي يؤديها بالعين البشرية أنه لا يتأثر بالتأثيرات الحرارية أو الضوئية. في الواقع، توفر هذه الشبكة وخط بمسح بيانات إضافية (أي أبعاد مفصلة للبلورة وأفضل ديفراكتينج منطقة الكريستال) التي تعتبر هامة في تحديد حجم الحزمة الصحيحة لاستخدامها لجمع البيانات – خاصة بالنسبة لبلورات صغيرة ¹⁸-وكثيراً ما يؤدي إلى تحسين نوعية البيانات الحيود التي تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، بالاستفادة من المعلمات المعرفة من قبل المستخدم في إعداد تجارب التلقائي، خطوات سير العمل المحددة في يمكن تكييفها لتناسب النظام قيد الدراسة، وبالتالي زيادة تحسين معدل نجاح التجربة.

آخذا معا، موثوقية مهام سير العمل المتوفرة، الوصول مباشرة إلى بيمليني (المستخدمين جدولة ذاتيا، باستخدام تقويم [انظر أعلاه])، ونهج مؤتمتة بالكامل لكتلة صخرية-1 يوفر صارمة، الفائق، وتوفير الوقت بديل لتجارب MX العملي الكلاسيكي والقدرة على تنفيذ إجراءات أكثر تقدما والتطبيقات في مهام سير العمل التلقائية. في المستقبل القريب، سيتم تنفيذ كريستال رسم الخرائط في 3D¹⁹ لتحسين الدقة من الأشعة السينية التوسيط، بينما سيكون آليا بروتوكولات أكثر تعقيداً، مثل كريستال الجفاف تجارب²⁰،. ويؤمل أن تصبح جمع بيانات مستقلة تماما أسلوب قياسي في MX، توفير بيانات عالية الجودة للشاشات جزء جزيء صغير، والاستفادة المثلى من فحص عدد كبير من سوء ديفراكتينج بلورات وتوفير المرحلة تلقائياً مزيد من المعلومات لحل الكريستال هياكل حيثياته. في تركيبة مع التطورات في حصاد الآلي لبلورات²¹، بإمكانية حل بنية بلورية البروتين كخدمة الآلي يمكن أن يصبح حقيقة واقعة.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	نيو إنجلاند بيولابز	C2527I
كلورامفينيكول	روث	3886.1
المكثفات: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
غشاء	الكلى Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA مثبطات البروتياز الخالية	من Roche	4،693،159،001
الجلسرين	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazole	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB متوسط	سيجما ألدريتش	L3022
حمض ليبويك	سيجما ألدريتش	T5625
حلقة	هامبتون ريسيرش	HR8-124
ليزوزيم	روش	10 837 059 001
مونوك 5/50 GL	GE الرعاية الصحية	17-5166-01
كلوريد الصوديوم	فيشر الكيميائية	S / 3160/60
خلية فيبرا سونيكاتور 75/15	سونيكس
كرات الصولجان اللولبية	MiTeGen	كود التخزين التعريفي: M-CSM003-0001A
تريس قاعدة	يوروميدكس	26-128-3094-B
فورمات الصوديوم	سيجما ألدريتش	1064430500
GCSH عازلة تنقية	20 ملي مولار TRIS درجة الحموضة 8 ، 200 ملي مولار كلوريد
GCSH عازلة حماية بالتبريد	0.25 م فورمات الصوديوم 4 ، 30٪ جلسرين
<قوي>البرامج: < / strong>
MxCube		Gabadinho، J. et al. MxCuBE: بيئة تحكم في خط شعاع السنكروترون مخصصة لتجارب علم البلورات الجزيئية. مجلة إشعاع السنكروترون. 17 (5) ، 700-707 ، doi: 10.1107 / S0909049510020005 (2010)	التنمية المحلية
ISPyB	ESRF	Solange Delageni & egrave ؛ إعادة ، باتريس برينشيرو ، لودوفيك لونر ، ألون دبليو أشتون ، ريكاردو ليل ، سانت إيكوت. فاني فيرير ، جوس إيكوت. جابادينيو ، إلسبيث جيه جوردون ، صموئيل دي جونز ، كارل إريك ليفيك ، سي & aacute. ن M. McSweeney, Sté فاني موناكو ، ماكس ناناو ، دارين سبروس ، أولوف سفينسون ، مارتن أ. والش ، جوردون أ. ليونارد. ISPyB: نظام إدارة معلومات لعلم البلورات الجزيئية السنكروترون ، المعلوماتية الحيوية ، المجلد 27 ، العدد 22 ، 15 نوفمبر 2011 ، الصفحات 3186-3192 ، https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	التنمية المحلية
MXCube2	ESRF	Gabadinho، J. et al.< / em> MxCuBE< / em> : بيئة تحكم في خط الحزمة السنكروترون مخصصة لتجارب علم البلورات الجزيئية. مجلة السنكروترون الإشعاع < / م >. <قوي>17< / قوي> (5) ، 700-707 ، DOI: 10.1107 / S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19) ، 24-226 (2014).	التنمية المحلية
	سير عمل BES	Brockhauser, S. et al. استخدام سير العمل في تصميم وتنفيذ التجارب المعقدة في علم البلورات الجزيئي الكبير. Acta Crystallographica القسم D علم البلورات البيولوجية. 68 (8) ، 975-984 ، DOI: 10.1107 / S090744491201863X (2012).
DOZOR	، ESRF	، Bourenkov و Popov ، التطوير المحلي غير المنشور
، التحكم		Guijarro، M. et al. BLISS - التحكم في التجارب لخطوط شعاع ESRF EBS. وقائع المؤتمر الدولي السادس عشر حول المسرع وأنظمة التحكم التجريبية الكبيرة ، ICALEPCS2017 ، برشلونة ، إسبانيا. دوي: 10.18429 / jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	التنمية المحلية
المعالجة التلقائية للصور		Monaco، S. et al. المعالجة التلقائية لبيانات حيود الأشعة السينية لعلم البلورات الجزيئي في ESRF. مجلة علم البلورات التطبيقي. 46< / strong> (3) ، 804-810 ، doi: 10.1107 / S0021889813006195 (2013)	التنمية المحلية
BEST و EDNA		Incardona ، M.-F. ، Bourenkov ، GP ، Levik ، K. ، Pieritz ، RA ، Popov ، A.N. ، Svensson ، O. EDNA: إطار عمل للتطبيقات القائمة على المكونات الإضافية المطبقة على تحليل البيانات عبر الإنترنت لتجربة الأشعة السينية. مجلة إشعاع السنكروترون. <قوي>16< / قوي> (6) ، 872-879 ، دوي: 10.1107 / S0909049509036681 (2009).	التنمية المحلية
CCP4		Winn، M.D. et al.< / em> نظرة عامة على مجموعة CCP< / em> 4 والتطورات الحالية. Acta Crystallographica القسم D علم البلورات البيولوجية< / em>. 67< / strong> (4) ، 235-242 ، doi: 10.1107 / S0907444910045749 (2011).
فيزر إم آر		ماكوي ، إيه جيه ، جروس كونستليف ، آر دبليو ، آدامز ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه في الطب ، ستوروني ، إل سي ، ريد ، آر جيه <إم >فيزر< / إم> برنامج بلوري. مجلة علم البلورات التطبيقي< / إم >. <قوي>40< / قوي> (4) ، 658-674 ، دوي: 10.1107 / S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley ، P. ، Cowtan ، K. Coot: أدوات بناء النماذج للرسومات الجزيئية. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr < / em>. 60< / strong> ، 2126-32 (2004).
refmac5		Murshudov، G.N.، Vagin، A.A.، Dodson، E.J. صقل الهياكل الجزيئية الكبيرة بطريقة الاحتمالية القصوى. Acta Crystallographica القسم D< / em>. 53< / strong> ، 240--255 (1997).
ماثيوز		ماثيوز ، BW محتوى المذيبات في بلورات البروتين. مجلة البيولوجيا الجزيئية. 33 (2) ، 491-497 (1968).