سير عمل بسيطة هجرة/غزو تصوير خلية يعيش الآلي باستخدام

Summary

ويصف البروتوكول الحالي بأسلوب متكامل يحقق سرطان الخلية الهجرة والغزو على منصة واحدة في الوقت الحقيقي، وتوفير خيار استنساخه بسهولة وكفاءة من حيث الوقت لدراسة التنقل خلية ومورفولوجيا.

Abstract

سرطان الخلية التنقل أمر حاسم للبدء بورم خبيث. ولذلك، التحقيق في حركة الخلية والقدرة الغازية ذات أهمية كبيرة. توفير فحوصات الهجرة البصيرة الأساسية لحركة الخلية على مستوى ثنائي الأبعاد، حين غزو فحوصات ذات الصلة أكثر فسيولوجيا، محاكاة المجراة في سرطان الخلية ديسلودجمينت من الموقع الأصلي والغازية عن طريق المصفوفة خارج الخلية. ينص البروتوكول الحالي على سير عمل واحد لفحوصات الهجرة والغزو. جنبا إلى جنب مع كاميرا مجهرية الآلي المتكاملة للصور عالية الدقة في الوقت الحقيقي ووحدة التحليل المدمج، أنه يعطي الباحثين الوقت-الكفاءة، خيار بسيط واستنساخه تجريبي. ويشمل هذا البروتوكول أيضا بدائل للمواد الاستهلاكية وأساليب تحليل بديلة للمستخدمين للاختيار من بينها.

Introduction

الهجرة الخلية وغزو من العمليات البيولوجية الهامة التي تمكن الوظائف الطبيعية في الجسم البشري، مثل إغلاق الجرح، غزو المشيمة في الرحم والغدة الثديية morphogenesis^1،،من²³. الجسم البشري لديه مراقبة دقيقة وصارمة لهذه الأحداث البيولوجية؛ ومع ذلك، هناك بعض الاستثناءات. على سبيل المثال، الأورام الخبيثة، قادرون على الهروب من هذه الضمانات، ويحمل انتشار غير طبيعي وتغزو الأنسجة المجاورة، وهو ما يسمى ورم خبيث. ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفيات المتصلة بالسرطان⁴.

سرطان الثدي هو الأكثر شيوعاً تشخيص السرطان في النساء، وهو ثاني أكبر سبب للوفيات المتصلة بالسرطان بين النساء في البلدان المتقدمة في العالم⁵. ينشأ سرطان الثدي من القنوات أو الفصيصات التي تتكون من واحد أو أكثر من طبقات من الخلايا الظهارية. في الثدي الطبيعي، تنضم الخلايا الظهارية لبعضها البعض والغشاء الطابق السفلي عن طريق بروتينات الغشاء مثل ه-كادهيرين وإينتيجرينس⁶. ولكن خلايا سرطان الثدي الغازية فقدوا قطبية والالتصاق خلية خلية، وتقليدياً الخضوع الظهارية الانتقالية الوسيطة (EMT) واكتساب القدرة على التحرك. بعد التسرب، هذه الخلايا تتحرك عبر المصفوفة خارج الخلية (ECM) وإدخال الأوعية الدموية أو اللمفاوي، تليها ثم إينترافاسيشن والنمو المنتشر⁷. فهم الآليات التي يحدث هذا يتسم بأهمية كبيرة، نظراً لورم خبيث هو السبب الأكثر شيوعاً للوفيات المتصلة بالسرطان، ويرتبط ارتباطاً وثيقا بسرطان الخلية الهجرة/الغزو. تصور حركة الخلايا السرطانية، فحوصات الهجرة والغزو، نماذج مثالية لدراسة حركة الخلية في 2D و 3D، على التوالي. ويقيم الهجرة مباشرة حركة الخلايا حين غزو ينطوي على تفاعل مع المكروية والقدرة على تخفيض الحواجز البيولوجية. هاتين العمليتين ليست مستقلة تماما عن بعضها البعض، كما الهجرة شرط للغزو.

وقد وضعت عدة طرق لدراسة الهجرة والغزو. كما استعرض بها كرامر et al، فحوصات الهجرة قبيل التئام الجروح، السور وفحوصات الصغرى-الناقل إنشاء منطقة خالية من الخلية السماح بالانتقال إلى الخلايا تقييم تغيير المنطقة؛ في حين، فحوصات ترانسويل والشعرية تستند إلى العدد الخلايا التي تتحرك نحو جاذبة⁸. لفحوصات الغزو، بيئة إدارة المحتوى في المؤسسة إعداد باستخدام الكولاجين أو هلام إدارة المحتوى في المؤسسة وعلى سبيل المثال، ويمكن تقييم الحركة ثلاثية الأبعاد من خلال رصد التهم غزو المنطقة والمسافة وخلية (مثل التحليل ترانسويل، الإنزيم خلد الماء)⁸. نوع آخر من الفحص الغزو هو الجمع بين الخلايا الغازية مع الخلايا غير الغازية وتقييم سلوك الخلايا الغازية (مثل فحوصات كروي). الأساليب المذكورة أعلاه الإيجابيات والسلبيات، وطريقة سهلة للنهج، سهل لتكرار، والجمع بين التحليل الهجرة والمقايسة الغزو في سير عمل مماثلة تفضيلية في التصميم التجريبي.

ويصف هذا البروتوكول قياس الهجرة الخلية والغزو تصوير الخلية تعيش باستخدام. خلية في الوقت الحقيقي رصد النظام المثبتة في حاضنة ثقافة خلية قياسية. فإنه يأخذ صور عالية الوضوح ووفقا لمجموعة مسح الفواصل الزمنية والقياسات عن طريق تطبيق أقنعة مناسبة للخلايا أو أهداف الفلورسنت. الوحدة النمطية للهجرة/غزو المقايسة تتضمن استخدام أداة 96-دبوس الصفر، ومناسبة لصنع الجروح الصفر متجانسة على أحادي الطبقة خلية في صفيحة 96-جيدا. وتستند الآلية الجرح في المختبر شفاء فحوصات، ورصد حركة الخلية 2D على البلاستيك أو سطح مصقول. ويمكن أيضا تقييم الغزو أو الحركة ثلاثية الأبعاد عبر المحتوى إضافية داخل الصفر الجرح. سير عمل موجزة يتضح في الشكل 1.

Protocol

ملاحظة: اثنين من خطوط الخلايا ينبغي التعامل معها بشكل منفصل. وينبغي تطبيقها على سطر واحد في خلية مفردة الإجراءات التالية إذا لم المحدد.

1-تحسين كثافة الخلية قبل إصابة

1. الثقافة الخلايا ملتصقة في T75 سم² قوارير زراعة الأنسجة إلى حوالي 80% التقاء في تعديل النسر المتوسطة (دميم الفينول الأحمر دولبيكو مجاناً ل) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 200 ملم لام الجلوتامين و 2 ميكروغرام/مل الأنسولين عند 37 درجة مئوية مع 5% أول أكسيد الكربون₂ ( شروط الحضانة القياسية لمعظم خطوط خلايا السرطان، تركيبات الثقافة هي الخلية تعتمد على الخط).
2. قم بإزالة وسائط الثقافة التي بيبيتينج قبالة في حاوية نفايات. بيبيت 2 مل من قبل حرارة 0.1% التربسين يدتا إيجاز شطف خلية أحادي الطبقة وبيبيت. إضافة آخر 2 مل من 0.1% التربسين-يدتا ومكان قارورة تحت الظروف القياسية الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. اضغط برفق قارورة لضمان المفرزة من الخلايا ثم قم بإضافة 10 مل وسائط الثقافة المعالجون مسبقاً التوقف عن رد فعل بروتيوليتيك.
4. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وزيادة ونقصان لأسفل في 200 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). بعناية إزالة المادة طافية دون التحريض بيليه الخلايا وريسوسبيند مع 10 مل المعالجون مسبقاً آخر ثقافة وسائل الإعلام.

2-عد عدد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية (أو أي أساليب العد)

1. ميليلتر 200 مخفف من تعليق خلية حراكه مع 800 ميليلتر من 1 × الفوسفات دولبيكو مخزنة المالحة (دببس) في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل.
2. إرفاق جهاز استشعار عد خلايا 60 ميكرومتر العداد الخلية واضغط باستمرار التبديل ودمج هذه المعلومة في تعليق خلية. ببطء الإفراج التبديل حتى تعليق خلية يتم رسمها بنجاح إلى أجهزة الاستشعار. تركيز خلية معروضة في خلايا/مل.
3. حساب عدد الخلايا في تعليق خلية 10 مل.

3-خلية الطلاء

1. لوحة خلايا في طائفة من كثافة الخلية (40,000-90,000 الخلايا/جيد) في ثلاث نسخ في صفيحة 96-جيدا.
2. ضع اللوحة في تصوير خلية يعيش، وجدولة فحص كل ح 2 عن 24 ساعة.
   1. في البرنامج، انقر فوق مسح الجدول من قائمة المهام. في جزء الإعداد درج، تحديد الموضع اللوحة، انقر فوق إضافة سفينة واختر نوع اللوحة. في جزء تفحص الإعداد ، اختر أو تحرير نمط المسح وفقا لإعداد لوحة تجريبية، وتعيين نوع المسح الضوئي معيار.
   2. انقر على الحق في الجدول الزمني وتحديد تعيين الفواصل الزمنية. تعيين إضافة فحص كل ح 2 في جدول 24-ح. انقر فوق تطبيق.

4-تحديد الخلية أمثل البذر الكثافة لفحص الهجرة

1. شالبروتوكول الاختياري المسح بعد 24 ساعة، تطبيق التقاء تجهيز أداة تحليل للصور عالية الدقة-المرحلة التباين التي يتم جمعها تلقائياً، وتوليد منحنى انتشار خلايا مع الزمن-
   1. تحديد الصور التمثيلية 3-6 ووضعها في مجموعة الصورجديدة.
   2. تحديد قناع مناسب تعريف المعالجة.
   3. البدء بعمل تحليل.
   4. تحديد كثافة الخلية الأمثل وفقا لالتقاء مع الزمن (حوالي 100% في التقاء داخل 6-18 ح اعتماداً على عندما تبدأ مقايسة الهجرة).
      ملاحظة: يختلف مقدار الوقت المستغرق لنمو الخلايا لالتقاء تمييع البذر.

5-أيام 1 و 2: التحضير للهجرة وفحوصات الغزو

1. في يوم 1، معطف لوحة لغزو المقايسة.
   ملاحظة: هلام ECM ينبغي دائماً التعامل معها على الجليد، ومع النصائح التي تم وضعها في الثلاجة بين عشية وضحاها.
   1. تمييع جل ECM مع وسائل الإعلام ثقافة المثلج إلى 100 ميكروغرام/مل وإضافة 50 ميليلتر المخفف جل ECM/وسائط الإعلام إلى الآبار المعينة.
   2. مكان اللوحة في الظروف القياسية الحضانة بين عشية وضحاها.
2. في اليوم الثاني، بلطف نضح وسائط الإعلام الزائدة. لوحة خلايا ذات الكثافة الأمثل الخلية إلى 2 96-جيدا لوحات مخصصة لفحص الهجرة (غير مصقول) والمقايسة الغزو (المغلفة) في تريبليكاتيس بعد الأجزاء 1-3 في وقت متأخر من بعد الظهر (في البروتوكول الحالي، كثافة نثر البذور المحسنة كانت ZR75-1 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 90,000/حسنا و 50,000/جيدا، على التوالي).
3. وضع لوحات في الظروف القياسية الحضانة بين عشية وضحاها.

6-يوم 3: الجرح الصفر

1. رذاذ ومسح الأداة الصفر و 2 الغسيل قوارب مع الإيثانول 70% قبل وضعها في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. تعبئة القارب الغسيل 1 و 2 بالضبط 45 مل العقيمة الإيثانول 70% والماء المقطر (يعقم) على التوالي.
2. للتعقيم ووضع كتلة دبوس أداة الصفر (أعلى) في الغسيل قارب 1 و 2 لمدة 5 دقائق.
3. تبدأ مع لوحة المقايسة الهجرة.
   1. نقل اللوحة التي تحتوي على خلايا من الحاضنة وتأكد من لا بئر جافة لتجنب ضرر أداة الصفر. إزالة لوحة الغلاف وإدراج صاحب الصفيحة القاعدية للأداة الصفر بعناية وضع الجزء العلوي على الجزء الأساسي من توجيه المسامير. اضغط واضغط على ذراع سوداء، وفي الوقت نفسه رفع كتلة دبوس بعناية. الثغرات في كل بئر عادة ما تكون مرئية بالعين المجردة وتحت المجهر.
   2. سرعة امتصاص الدبابيس في المياه؛ وهذا يكفي لتنظيف الأداة التسويد قبل الخدش لوحة المقايسة الغزو إذا كان إعداد لوحة غير متطابقة. خلاف ذلك، كرر الخطوات التعقيم بالماء المقطر المعقم ومن ثم الإيثانول 70% لمدة 5 دقائق.
4. أغسل أوراق مرات بلايت 1 أو 2 مع وسائل الإعلام ثقافة المعالجون مسبقاً لتجنب فصل الخلايا أو الخلايا reattaching إلى البئر.
5. إضافة 100 ميليلتر من وسائل الإعلام الحارة الطازجة في الآبار المعينة مع أو بدون علاج.
6. خطوات إضافية من أجل غزو المقايسة.
   1. ضع لوحة المقايسة الغزو عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حجته ونضح وسائط الإعلام الباردة بعناية.
   2. تمييع جل ECM مع وسائل الإعلام ثقافة المثلج إلى 5 ملغ/مل وإضافة 50 ميليلتر من جل ECM المخفف في مكان مخصص آبار ومكان تحت حضانة القياسية لمدة 30 دقيقة.
   3. إضافة 100 ميليلتر من وسائل الإعلام تصل درجة حرارة مع أو بدون اختبار المركبات.
7. ضع اللوحة في تصوير خلية يعيش والسماح لها حجته لأدنى 5 اختر نوع السفينة كلوحة إيماجيلوك. تعيين نوع المسح الضوئي نقطة الصفر الجرحواختيار أو تحرير نمط المسح الضوئي وفقا لإعداد لوحة تجريبية (1 صورة/جيدا ووضع واسعة) والجدول 24-ح تكرار مسح كل ح 1-2 ح 72 حتى تلتئم الجراح.
8. لتنظيف الأداة الصفر، وضعت كتلة دبوس أعلى في كل من الحلول التالية (45 مل في الغسيل قوارب) للمنظفات الصناعية 5 دقيقة: 0.5% 1 المنظفات 1% (انظر الجدول للمواد)، 2 (انظر الجدول للمواد)، عقيمة الإيثانول المقطر المياه و 70%. ضع أداة الصفر يعيدوه الصفيحة القاعدية ومخزن في بيئة خالية من الغبار.

7-بيانات التحليل

1. إيقاف المسح الضوئي لوحة المعينة بعد كل الجروح قد تلتئم باختيار لوحة تجريبية على درج الإعداد والنقر فوق إزالة السفينة.
2. جمع الصور التمثيلية 3-6 التي تغطي مجموعة من النسب السليمة، بما في ذلك الصور مباشرة بعد الجرح، الجرح بالإغلاق بنسبة 10% و 50%.
3. لتحديد تعريف معالجة مناسبة، استخدام التكيف تجزئةو تنظيف مرشحات لتطبيق المناسبة الصفر قناع الجرح و التقاء القناع. استخدام المعاينة الحالية/الكل لعرض دقة الأقنعة.
4. الشروع في تحليل الوظيفة.
5. يمكن تحليلها داخل البرنامج البيانات أو تصديرها لمزيد من التحليل. يمكن استخدام مقاييس الثلاثة المقدمة من البرنامج لتقييم الصور عالية الدقة-المرحلة: الجرح التقاء العرض (ميكرومتر)، الجرح (%)، وكثافة الجرح النسبي (%). وستناقش مقارنات في المقطع التالي.

Results

هذا التحليل الهجرة/غزو يستند على مقايسة شفاء الجرح، الذي يتولى تقييم معدل الخلايا تتحرك إلى منطقة خالية من الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة الأداة الصفر 96-دبوس. الفرق بين الاختبارات الهجرة والغزو أن الهجرة فحوصات قياس الخلايا تتحرك على زراعة الأنسجة تعامل البلاستيك السطحية وغزو التدابير الخلايا تتحرك عبر هلام إدارة المحتوى في المؤسسة.

أداة الصفر يهدف إلى جعل الجروح الصفر متسقة في لوحة المعينة وتصوير خلية يعيش يهدف إلى أخذ صور عالي...

Discussion

الهجرة والغزو من المعالم الهامة لتقييم انتقال الخلايا السرطانية. باستخدام أداة 96-دبوس الصفر، من الممكن إجراء الجرح الشفاء فحوصات في 2D و 3D في وقت واحد. وبصرف النظر عن تيسير المسح التلقائي، توفير بيئة ثقافة خلية مستقرة مع الحد الأدنى من التعطيل، يوفر المقايسة الصفر التي أجريت باستخدام أداة الصفر 96-دبوس الجروح الصفر متسقة، تمكن التجارب التي أكثر قوة و قابل لإعادة الإنتاج. تنسيق لوحة 96-جيدا يعطي خيارات إضافية أما زيادة عدد خطوط الخلايا أو العلاج بالعقاقير المختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تسجيل تغييرات مورفولوجية الخلية...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5٪ محلول تريبسين-EDTA (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	تمييع إلى 2x في DPBS
Countess II FL عداد الخلايا الآلي	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	منظف عداد الخلايا الآلي
1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	تركيز العمل 0.5٪
منظف 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1٪ يعمل تركيز
Dulbecco' s النسر المعدل المتوسط, لا الفينول	ThermoFisher Scientific	21063-045	مزود مع 10٪ FBS, 200 مللي مولار L-الجلوتامين, 2μ جم / مل الأنسولين
ECM Gel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	عامل النمو المخفض ، لوحة Essen ImageLock 96 بئر خالية من الفينول
، قاع مسطح	Essen	4379
شرائح عد EVE BioTools		EVS-50
مصل بقري الجنين (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well غزو خلايا الجرح الخدش الملحقات	Essen	4444	بما في ذلك CoolBox و 2x CoolSink
IncuCyte Cell Migration Kit	Essen	4493	بما في ذلك كتلة دبوس 96 بئر ، قوارب غسيل 2x وبرنامج
IncuCyte ZOOM	Essen		نظام تحليل الخلايا الحية
محلول الأنسولين البشري	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-glutamine (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
قارورة زراعة الأنسجة ، 75 سم < سوب > 2 < / سوب> منطقة النمو	Greiner Bio-One	658175