يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

انسداد السفينتين الماوس النموذجي لضخه الاسكيمية الدماغي

11.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59078

⸱

مارس 1, 2019

 ,  , 
1Research Center of Translational Imaging, College of Medicine, Taipei Medical University, 2Radiogenomic Research Center, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 3Department of Radiology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Department of Medical Imaging, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 5Department of Medical Research, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 6Department of Surgery, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Division of General Surgery, Department of Surgery, Taipei Medical University Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نموذج الفأر من ضخه الاسكيمية الدماغي أنشئت للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية. ونحن ديستالي سد الشريان الدماغي الأوسط الحق والشريان السباتي المشترك الحق واستعادة تدفق الدم بعد 10 أو 40 دقيقة من الاسكيمية.

الملخص

في هذه الدراسة، يستخدم نموذج ماوس انسداد شريان دماغي الأوسط (MCA) لدراسة ضخه الاسكيمية الدماغي. مفيد نموذجا ماوس استنساخه وموثوق بها للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية لضخه الاسكيمية الدماغي وتحديد الاستراتيجيات العلاجية المحتملة بالنسبة للمرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية. الاختلافات في التشريح لدائرة ويليس C57BL/6 الفئران يؤثر على حجم احتشاء بعد الإصابة الدماغية الاسكيمية--المستحثة. أشارت الدراسات إلى أن انسداد MCA القاصي (ماكاو) يمكن التغلب على هذه المشكلة ويؤدي إلى حجم احتشاء مستقرة. في هذه الدراسة، ونحن إنشاء نموذج ماوس انسداد السفينتين من ضخه الاسكيمية الدماغي عن طريق انقطاع تدفق الدم إلى MCA الحق. ونحن ديستالي اضطر MCA الأيمن والشريان السباتي المشترك الحق (CCA) واستعادة تدفق الدم بعد فترة معينة من الاسكيمية. هذه الإصابة ضخه الاسكيمية يستحث احتشاء حجم ثابت وعجز سلوكية. الخلايا المناعية المحيطية التسلل الدماغ الدماغية ضمن فترة تسلل ح 24. بالإضافة إلى ذلك، يتم فقدان الخلايا العصبية في منطقة القشرية أقل لمدة أطول من ضخه. ولذلك، هذا النموذج انسداد السفينتين مناسبة للتحقيق في الاستجابة المناعية والعصبية الانتعاش خلال فترة ضخه بعد الاسكيمية الدماغي.

المقدمة

الطراز الماوس ضخه الاسكيمية الدماغي أحد النهج التجريبي الأكثر استخداماً للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية ل الإصابات الناجمة عن الاسكيمية الدماغ1. لأنه ينشط ضخه الاسكيمية الدماغي المناعي المحيطية، الخلايا المناعية المحيطية التسلل إلى الدماغ الدماغية ويسبب تلف الخلايا العصبية2. وهكذا، نموذجا لماوس موثوقة واستنساخه يحاكي ضخه الاسكيمية الدماغي مطلوب لفهم الفسيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية.

الفئران (B6) C57BL/6J هي سلالة الأكثر استخداماً في التجارب السكتة الدماغية نظراً لأنها يمكن بسهولة أن يكون وراثيا معالجته. تتوفر نماذج مشتركة اثنين من ماكاو/الاكسجينيه التي تحاكي حالة ضخه الاسكيمية الدماغي. الأول هو نموذج الشعيرة intraluminal الدانية ماكاو، حيث يعمل خيوط المغلفة بالسيليكون إينترافاسكولارلي أوككلودي تدفق الدم في هيئة مكافحة الاحتكارات؛ بعد ذلك يتم إزالة خيوط أوككلودينج لاستعادة تدفق الدم3. مدة قصيرة انسداد يؤدي آفة من منطقة subcortical، بينما أطول مدة انسداد يسبب الاحتشاءات في المناطق القشرية وسوبكورتيكال. النموذج الثاني هو نموذج ربط مكاو القاصي، الذي ينطوي على ربط اكسترافاسكولار MCA والتقييم القطري المشترك للحد من تدفق الدم من خلال هيئة مكافحة الاحتكارات، بعدها يتم استعادة تدفق الدم عن طريق إزالة مقطع خياطة الجروح والأوعية الدموية4. في هذا النموذج، بسبب احتشاء في المناطق القشرية، ومعدل وفيات منخفض. لأنه يتطلب ربط نموذج ماكاو/ضخه كرانيكتومي لفضح موقع MCA القاصي، يمكن تأكيد الموقع بسهولة، ودراسة ما إذا كان تدفق الدم في MCA القاصي تتعطل أثناء الإجراء واضح ومباشر.

B6 الفئران تظهر اختلافات كبيرة في التشريح لدائرة ويليس؛ وهذا قد يؤثر على حجم احتشاء بعد ضخه الاسكيمية الدماغي5،،من67. حاليا، يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق ربط MCA القاصي8. في هذه الدراسة، علينا أن ننشئ أسلوب أوككلودينج تدفق الدم MCA وتمكين ضخه بعد فترة محددة سلفا من الاسكيمية. انسداد السفينتين من طراز ضخه الاسكيمية الدماغي يستحث الاسكيمية العابرة لإقليم اتحاد الماليزيين الصينيين من خلال ربط MCA القاصي الحق والحق التقييم القطري المشترك، مع تدفق الدم المستعادة بعد فترة معينة من الاسكيمية. يدفع هذا النموذج ماكاو/ضخه احتشاء حجم مستقر، والجزء الأكبر من التسلل إلى الدماغ الخلايا المناعية في الدماغ الدماغية، وعجز سلوكية بعد الاسكيمية الدماغي – ضخه4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

رعاية الحيوان المؤسسية واللجان استخدام سينيكا وجامعة الطب تايبيه أقرت هذا البروتوكول لاستخدام الحيوانات التجريبية.

1-نموذج مكاو/ضخه

  1. توفر الفئران مع حرية الوصول إلى المياه وتشو حتى الجراحة.
  2. اﻷوتوكﻻف الجراحية أدوات وتطهير الجدول جراحة ومعدات استخدام الإيثانول 70%. ارتداء قناع جراحي والقفازات المعقمة. استخدام معقم جاف حبة إلى ريستيريليزي الأدوات الجراحية إذا كان سيجري عملية جراحية الماوس متعددة في تجربة واحدة.
  3. تخدير ماوس 8-12 أسبوع (الشامل: ز 25 – 30) باستخدام نسبة 0.8% كلورال هيدرات، عن طريق حقنه داخل. تأكد من أن الماوس أنيسثيتيزيد ليس لديه منعكس دواسة (كاختبار باستخدام قرصه إصبع القدم ثابت) بعد أنيسثيتيزيشن.
  4. استخدم مرهم البيطرية لمنع جفاف العين للماوس في حين أنها تحت التخدير.
  5. استخدام نظام موسع من ضغط الدم لمراقبة ضغط الدم للماوس.
  6. استخدام نظام رصد فسيولوجية لرصد درجة حرارة المستقيم وغازات الدم الشرياني. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 36.5 ± 0.5 درجة مئوية.
  7. حقن تحت الجلد الماوس مع المضادات الحيوية الاتقائية (سيفازولين 25 مغ/كغ)8.
  8. ضع الماوس في موقف ضعيف على منصة التدفئة.
  9. استخدام مقص كهربائي لفضح الجلد قبل الحلاقة الفراء الماوس على منطقة الرقبة البطني، وكذلك في المنطقة بين العين اليمنى والإذن اليمنى.
  10. استخدم كريم نتف الشعر لمسح الفراء من الهيئة للماوس وتطهير الموقع الجراحي بالتناوب سكربوس مع بوفيديوني-اليود وايثانول 70%.
  11. استخدام قزحية مقص لقص شق 1 سم طوله خط الوسط في الرقبة.
  12. استخدام الملقط آيريس بعناية تشريح التقييمات القطرية المشتركة خالية من الأعصاب المبهم دون التسبب في إصابات جسدية.
  13. استخدام خيوط الحرير 5-0 لعزل التقييم القطري المشترك.
  14. جعل شق 0.3 سم في فروة الرأس في نقطة الوسط بين العين اليمنى والإذن اليمنى.
  15. استخدم ميكروسسيسورس لقطع العضلات temporalis لفضح عظم زيجوماتيك وسكواموسال.
  16. تحت مجهر تشريح ستيريو، استخدام ميكرودريل لإنشاء حفرة قطرها مم 2 مباشرة عبر MCA القاصي في الجانب الأيمن.
  17. اضطر جذع MCA القاصي الجانب الأيمن باستخدام خياطة 10-0.
  18. أوككلودي الجانب الأيمن التقييم القطري المشترك باستخدام مقطع الأوعية الدموية نونتروماتيك.
  19. بعد 10 أو 40 دقيقة من الاسكيمية، إزالة مقاطع تمدد الأوعية الدموية وخياطة لاستعادة تدفق الدم لاتحاد الماليزيين الصينيين، والتقييم القطري المشترك.
  20. استخدام قصاصة خياطة لختم شق الجلد على رأسه.
  21. ختم شقوق الجلد سرطان عنق الرحم باستخدام خياطة واحد متبوعاً بإغلاق الجلد العنق بخياطة أو دبوس9.
  22. تحت الجلد حقن البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ) ل تخفيف الألم9.
  23. الحفاظ على درجة حرارة الجسم للماوس عند 36.5 ± 0.5 درجة مئوية على لوحة تدفئة حتى أنه تعافي تماما من التخدير. لا يعود الحيوان الذي خضع لجراحة لشركة الحيوانات الأخرى حتى أنه تعافي تماما. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى أنه يستعيد وعيه كافية.
  24. ضع الماوس في قفص يعقم كيما يمكن بحرية الوصول إلى المياه وتشو بعد قد تعافي تماما.

2-تلوين مع كلوريد 2,3,5-تريفينيلتيترازوليوم

  1. تخدير الماوس مع 0.8% كلورال هيدرات عن طريق حقنه داخل.
  2. استخدام مقص التشغيل لقطع رأس الحيوان.
  3. كشف الجمجمة باستخدام مقص آيريس جعل شق في جلد الرأس.
  4. استخدام مقص التشغيل لقطع الأمامي لعظم جبهي.
  5. استخدام قزحية مقص لقص الجمجمة على طول خياطة السهمي.
  6. استخدام رونجيور العظام دفع جانبا أمامي والعظم الجداري وفضح الدماغ.
  7. استخدام الملقط آيريس لتشريح الدماغ.
  8. استخدام مصفوفة الدماغ ماوس وشفرات الحلاقة للحصول على شرائح الاكليلية 2 مم.
  9. وصمة عار المخ الشرائح من 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع كلوريد 2% 2,3,5-تريفينيلتيترازوليوم (TTC) في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة.
  10. شطف الدماغ 2 x مع الفورمالين 10%.
  11. إصلاح الدماغ في الفورمالين 10% في درجة حرارة الغرفة ح 24.

3-قياس حجم احتشاء

  1. ترتيب الأقسام على شريحة بلاستيكية نظيفة وتوجيه الفروع من روسترال إلى والذيلية.
  2. تفحص الشريحة باستخدام ماسح ضوئي. ضع مسطرة مترية وتأكد من أنها تظهر في الصورة الممسوحة ضوئياً. اقلب الشريحة وتفحص الجانب المعاكس.
  3. حساب مساحة احتشاء كل مقطع باستخدام البرمجيات إيماجيج.
    1. افتح ملف الصورة، وقم بإعداد جدول للصورة.
    2. استخدام التحديد اليدوي لتحديد منطقة احتشاء.
    3. استخدام مناطق مدير مصلحة (ROI) لقياس مجال الاهتمام.
  4. مجموع المناطق احتشاء لكل قسم وضرب الناتج في سمك الفرع لتقدير حجم احتشاء الكلية.

4. تحليل إحصائي

  1. استخدام 6 بريزم جرافباد لتحديد الدلالة الإحصائية مع الطالب t-اختبار.
    ملاحظة: تمثل مجالات الخطأ على الرسوم البيانية بار الأخطاء المعيارية للوسط (SEMs).
  2. استخدام ز * 3.1 السلطة لحساب حجم العينة المناسب وإجراء تحليل طاقة10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تنتج من احتشاء القشرية محيط MCA الحق هذا الإجراء ماكاو/ضخه وتسبب عجزا سلوكية. درجات مختلفة من حجم احتشاء المستحثة الاسكيمية (الشكل 1 أ، ب) وفقدان الخلايا العصبية (الشكل 1، د) تم إنشاؤها في قشرة الدماغ من منطقة MCA الحق عن طريق زيادة مدة عملية ربط. هذه الإصابة ماكاو/ضخه انخفض النشاط الحركي للحيوان في 48 ساعة بعد ماكاو/ضخه (الشكل 2). كما تسللت الجزء الأكبر خلايا المناع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نموذج الماوس ماكاو/ضخه نموذج حيوانية المستخدمة عادة لتقليد الاسكيمية العابرة في البشر. يمكن تطبيق هذا النموذج الحيواني لسلالات الفئران المحورة وراثيا والضربة القاضية للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية. عدة خطوات في البروتوكول أهمية خاصة. (1 ميكرودريل) يجب أن تستخدم بعناية عند إنشاء ثقب في الجمجمة، مع إجراءات غير ملائمة بسهولة مما تسبب في نزيف من هيئة مكافحة الاحتكارات. (2 ينبغي أن لا يكون معطوباً MCA)، ويجب تجنب نزيف قبل وبعد إجراء عملية ربط. الأضرار التي لحقت MCA يؤثر على مستوى ضخه في الدماغ الدماغية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وكان يدعمها هذا العمل بوزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (الأكثر 106-2320-ب-038-024، معظم 105-2221-E-038-007-MY3، ومعظم 104-2320-ب-424-001) ومستشفى الجامعة الطبية تايبيه (107TMUH-س-01). تم تحرير هذه المخطوطة عن طريق "تحرير والاس الأكاديمية".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
عظام rongeurDienerFriedman
BuprenorphineSigmaB-044
CefazolinSigma1097603
هيدرات الكلورSigmaC8383
مجهر تشريحنيكونSMZ-745
مقص كهربائيPetpro
10٪ فورمالينسيجماF5304
معقم حبة جافةبرينتري ملقط قزحية علمية
كارل كلابنيكر10 سم
مقص9 سم
مقص قزحية STRكارل كلابنيكر11 سم
MicrodrillStoeltingFOREEDOM K.1070
مقص صغير-VannasHEISSH-4240شفرة 7 مم ، 8 سم
مصفوفة دماغ الفأرالدقة
نظام ضغط الدم غير الجراحيMuromachiMK-2000ST
مقص التشغيل STRKarl Klappenecker14 سم
نظام المراقبة الفسيولوجيةحلاقة هارفارد
شفراتEver-Ready
Stoelting RodentWarmers Stoelting53810وسادة تسخين
خياطة كليبStoelting
TweezersIDEALTEKNo.3
Vetbond3M15672الغراء الجراحي
10-0 خياطةUNIKNT0410
2،3،5-Triphenyltetrazolium كلوريدسيجماT8877
قزحية أدوات العالمية ماكينة

المراجع

  1. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).
  2. Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology. 8 (7), 401-410 (2012).
  3. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - Middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423(2011).
  4. Lee, G. A., et al. Interleukin 15 blockade protects the brain from cerebral ischemia-reperfusion injury. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 562-570 (2018).
  5. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  6. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
  7. Wellons, J. C. 3rd, et al. A comparison of strain-related susceptibility in two murine recovery models of global cerebral ischemia. Brain Research. 868 (1), 14-21 (2000).
  8. Doyle, K. P., Fathali, N., Siddiqui, M. R., Buckwalter, M. S. Distal hypoxic stroke: a new mouse model of stroke with high throughput, low variability and a quantifiable functional deficit. Journal of Neuroscience Methods. 207 (1), 31-40 (2012).
  9. Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: Distal middle cerebral artery occlusion. Methods in Molecular Biology. , 103-110 (2014).
  10. Wayman, C., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. Journal Of Visualized Experiments. (108), e53106(2016).
  11. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neuroscience Letters. 349 (2), 130-132 (2003).
  12. Florian, B., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neuroscience Letters. 438 (2), 180-185 (2008).
  13. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
  14. Lin, T. N., Te, J., Huang, H. C., Chi, S. I., Hsu, C. Y. Prolongation and enhancement of postischemic c-fos expression after fasting. Stroke. 28 (2), 412-418 (1997).
  15. Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14 (4), 545-553 (1994).
  16. Tachibana, M., et al. Early Reperfusion After Brain Ischemia Has Beneficial Effects Beyond Rescuing Neurons. Stroke. 48 (8), 2222-2230 (2017).
  17. Gan, Y., et al. Ischemic neurons recruit natural killer cells that accelerate brain infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2704-2709 (2014).
  18. Li, M., et al. Astrocyte-derived interleukin-15 exacerbates ischemic brain injury via propagation of cellular immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), E396-E405 (2017).
  19. Wang, S., Zhang, H., Dai, X., Sealock, R., Faber, J. E. Genetic architecture underlying variation in extent and remodeling of the collateral circulation. Circulation Research. 107 (4), (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الشريان المخي الأوسطالإجراء الجراحيحجم الاحتشاءارتشاح الخلايا المناعيةالفقدان العصبيليزر دوبلرتلوين TTC
انسداد السفينتين الماوس النموذجي لضخه الاسكيمية الدماغي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.