الامتزاز بوغ كنظام عرض نونريكومبينانت للإنزيمات والمضادات

ملخص

ويركز هذا البروتوكول على استخدام الجراثيم البكتيرية كأداة نانوبيوتيتشنولوجيكال "حية" الجسميات جزيئات مغايرة مع مختلف الأنشطة البيولوجية. وترد أيضا أساليب لقياس كفاءة الامتزاز.

الملخص

بوغ البكتيرية خلية أيضي هادئة، يتكون من سلسلة من الطبقات الواقية المحيطة السيتوبلازم المجففة. يجعل في بوغ مستقرة للغاية ومقاومة هذا الهيكل غريبة وقد اقترح استخدام بوغ كمنصة لعرض جزيئات مغايرة. وحتى الآن، تم عرض مجموعة متنوعة من مولدات المضادات، والأنزيمات على أبواغ عصيات نجحت ، وعدد قليل من الأنواع الأخرى، في البداية بنهج المؤتلف، ومن ثم، باستخدام أسلوب نونريكومبينانت بسيطة وفعالة. ويستند نظام العرض نونريكومبينانت الامتزاز المباشر من جزيئات مغايرة على السطح بوغ، تجنب بناء سلالات المؤتلف والإفراج عن البكتيريا المعدلة وراثيا في البيئة. استقرت الجزيئات الممتزة والمحمية بالتفاعل مع الجراثيم، مما يحد من التدهور السريع لمولدات المضادات، والخسارة في نشاط إنزيم في ظروف غير مواتية. متى تستخدم، يمكن جمعها بسهولة مع تخفيض الحد أدنى من نشاط الإنزيمات تمتز بوغ واستخدامها لجولات إضافية للرد. يرد في هذه الورقة كيف أن الجسميات الجزيئات النموذجية لجراثيم المنقي من باء-نجحتوكيفية تقييم كفاءة الامتزاز وكيفية جمع الجراثيم المستخدمة إعادة تدويرها لردود فعل جديدة.

المقدمة

عرض النظم تهدف إلى تقديم النشيطة بيولوجيا الجزيئات على السطح للكائنات الحية الدقيقة وإيجاد التطبيقات في مجموعة متنوعة من المجالات، من الصناعي للتكنولوجيات الأحيائية الطبية والبيئية. وبالإضافة إلى فاجيس^1،2 وخلايا مختلفة الغرام-وإيجابية الأنواع^3،4،5،،من⁶⁷، كانت أيضا الجراثيم البكتيرية اقترحه كأنظمة العرض نهجين^8،9.

بسبب هيكلها غريبة، هي المجففة السيتوبلازم محاطة بسلس....

البروتوكول

1-الامتزاز رد فعل

1. احتضان 2 و 5 و 10 ميكروغرام من مرفب مع 2 x 10⁹ باء-نجحت البرية من نوع الجراثيم المنقاة في 200 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت، وسترات الصوديوم 50 مم، pH 4.0 (16.7 مم سترات الصوديوم ثنائي هيدرات؛ حمض الستريك 33.3 مم) ح 1 عند 25 درجة مئوية على شاكر هزاز (الشكل 1) .
2. الطرد المركزي الخلائط ملزمة (13,000 س ز لمدة 10 دقائق) يجزئ الكريات (P2, P5 و P10) وسوبيرناتانتس (S2 و S5 و S10). تخزين سوبيرناتانتس لتقييم كفاءة الامتزاز هو موضح في الخطوة 3، 2 غير المباشرة.
3. تغسل الكريات 2 x مع 200 ميليلتر المخزن المؤقت وريسوسبيند لهم في 100 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت واستخدامه لتحليل ال....

النتائج

ويمكن تقييم الامتزاز ناجحة من النشاف الغربية. بناء على رد فعل، هذا الخليط هو مجزأ بالطرد المركزي وغسلها، والكسر بيليه (الشكل 1) ويستخدم لاستخراج البروتينات السطحية. الاستخراج مجزأ من الحزب الديمقراطي الصربي polyacrylamide هلام التفريد (صفحة)، اليكتروترانسفيريد لغشاء الفينيليدن فلوريد (PVDF)، وكان رد فعل ضد الأجسام المضادة للابتدائي والثانوي. وجود بروتينات الحجم المتوقع، إلا في حارة محملة بمقتطف من جراثيم الممتزة، يدل على فعل الامتزاز الناجحة (

المناقشة

هذا البروتوكول الامتزاز بوغ جداً بسيط ومباشر. أن رد الفعل يعتمد كلياً على درجة الحموضة من رد فعل المخزن المؤقت وكفاءة الامتزاز الأمثل في قيم الأس الهيدروجيني الحمضية (pH 5.0 أو أقل). في ظروف الأس الهيدروجيني المحايدة، وكفاءة الامتزاز منخفض، وفي قيم الأس الهيدروجيني قلوية، وقد لا يحدث الامتزاز. والامتزاز الأمثل يتم الحصول عليها باستخدام وحدة تخزين من 200 ميليلتر في أنابيب 1.5 مل (أو الحفاظ على نسبة مماثلة) على شاكر هزاز.

الامتزاز ضيق جداً، ويغسل مع المخزن مؤقت على درجة الحموضة نفس المخزن المؤقت.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.1٪ محلول بولي إل ليسين	سيجما	P8920
0.45 & م غشاء نشاف النيتروسليلوز	Sartorius	M_Blotting_Membranes
100 مرة; الموضوعي UPlanF1	معدات		مجهر أوليمبوس
Bacillus subtilis  سلالة NCIB3610	مركز المخزون الجيني Bacillus	3A1
BD ACCURI C6 PLUS	BD	مقياس
الخلوي BX51	أوليمبوس	المجهر
Clarity	Biorad	1705060
DP70 كاميرا رقمية معدات	مجهر		أوليمبوس
الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، FITC	ثيرمو فيشر	F-2754
الماعز المضاد للأرانب IgG H& L (HRP)	أبكام	ab6721
أحادي النسيلة المضاد للبولي هيستيدين ناقص ؛ تستخدم الأجسام المضادة للبيروكسيداز	Sigma	A7058-1VL	للكشف عن البروتينات الممتصة التي تقدم علامة 6xhistidine في C- أو N- terminal   ؛
SecureSlip  غطاء زجاجي	Sigma	S1815-1PAK
Superwhite مجهر غير مشحون شرائح	VWR	75836-190
U-CA مغير التكبير   ؛		مجهر	أوليمبوس

التدفقالفلوريمعدات