يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل لامتصاص اندوسيتيك والنقل إلى الوراء إلى غولجي عبر الشبكة باستخدام نانوبوديس فونكتيوناليزيد في الخلايا المستزرعة

8.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59111

⸱

فبراير 21, 2019

 , 
1Biozentrum, University of Basel

في هذه المقالة

ملخص

النقل إلى الوراء من البروتينات من سطح الخلية إلى غولجي أمر ضروري للحفاظ على التوازن الغشاء. هنا، نحن تصف طريقة لتحليل الخلايا السطحية غولجي النقل المؤتلف البروتينات باستخدام نانوبوديس فونكتيوناليزيد في خلايا هيلا المتحلل.

الملخص

النقل من البروتينات والأغشية من سطح الخلية غولجي وما بعدها ضروري للتوازن والهوية عضية وعلم وظائف الأعضاء. لدراسة حركة تراجعية البروتين، وضعنا مؤخرا مجموعة من أدوات المستندة إلى نانوبودي تنوعاً لتحليل النقل من سطح الخلية إلى المجمع غولجي، أما عن طريق خلية ثابتة ويعيش التصوير، بالمجهر الإلكتروني، أو كيميائيا. نحن هندسيا nanobodies نيون فونكتيوناليزيد الأخضر المضادة البروتين (التجارة والنقل) – موثقات الصغيرة، أحادي، والنسب العالية من البروتين – التي يمكن تطبيقها على خطوط الخلايا معربا عن بروتينات الغشاء من الاهتمام مع مجموعة بروتينات فلورية خضراء خارج الخلية. ديريفاتيزيد nanobodies منضمة إلى الصحفيين بروتينات فلورية خضراء يتم استيعابه على وجه التحديد وتنقل تراكبيا على طول طرق الفرز الصحفيين. كانت فونكتيوناليزيد نانوبوديس مع fluorophores تتبع النقل إلى الوراء بالفحص المجهري الأسفار والعيش التصوير، مع اسكوربات البيروكسيديز 2 (APEX2) للتحقيق في توطين مجمعات مراسل-نانوبودي ultrastructural إلكترون الفحص المجهري، ومع زخارف تيروزين الكبرتة (TS) لتقييم حركية ترانس-غولجي وصول الشبكة (TGN). في هذه المقالة المنهجية، نحن مخطط الإجراء العام للتعبير عن البكتريا وتطهير نانوبوديس فونكتيوناليزيد. نحن لتوضيح استخدام أداة لدينا استخدام nanobodies تعديل مشري والملخص لتحليل TGN وصول البضائع البروتينات وامتصاص اندوسيتيك قوية.

المقدمة

حركة تراجعية من البروتينات والدهون من سطح الخلية إلى مختلف الأقسام داخل الخلايا أمر حاسم للحفاظ على التوازن غشاء على موازنة إفراز وإعادة تدوير مكونات الأجهزة النقل anterograde1 , 2. بعد الاستيعاب الداخلي عن طريق الالتقام تعتمد على كلاثرين أو-مستقلة، البروتين والدهن الشحن أولاً ملء المبكر اندوسوميس من أين هم كذلك توجيه أما على طول النظام إندو-الليزوزومية، وإعادة تدويرها لغشاء البلازما، أو الموجهة إلى شبكة ترانس-غولجي (TGN). إعادة التدوير من اندوسوميس و/أو سطح الخلية TGN جزء من دورة الوظيفي عدد من مستقبلات البضائع transmembrane anterograde، مثل مستقبلات يطلق – 6-فوسفات تعتمد على الأيونات الموجبة والايونات الموجبة المستقلة (كدمبر وسيمبر) تسليم حديثا توليفها hydrolases الليزوزومية من TGN أواخر اندوسوميس وليسوسوميس3،،من45، سورتيلين وسورلا6،7ونتليس (ولس) نقل يغاندس Wnt إلى سطح الخلية 8 , 9 , 10 , 11-هي البروتينات الأخرى تم استردادها مرة أخرى إلى TGN TGN46 وفي إيسوفورمس ذات الصلة12،13،14، الافخاخ (القابلة للذوبان N-اثيلماليميدي-تراعي الانصهار عامل مرفق مستقبلات) 15 , 16 , 17، قسط التدريجي (عنك) البروتين20الناقلين المعادن مثل ATP7A/B أو DMT121،22، و transmembrane، اميلويد السلائف البروتين (APP)18،19 تجهيز الإنزيمات بما في ذلك كاربوكسيبيبتيداسي د، فارين أو BACE123،،من2425. وبصرف النظر عن هذه البروتينات الذاتية، خطف السموم البكتيرية والنبات (مثل السمية شيغا، والكوليرا، ومادة الريسين وابرين) الآليات النقل إلى الوراء للوصول إلى لائحة ريتروترانسلوكيشن في سيتوسول26،27، ،من 2829.

من أجل مباشرة تحليل حركة المرور إلى الوراء، قد سبق أن وضعت مجموعة من أدوات المستندة إلى نانوبودي لوسم وتتبع الشحنات البروتينات من سطح الخلية إلى المقصورات داخل الخلايا30. نانوبوديس تمثل أسرة جديدة من موثقات البروتينات المشتقة من هوموديميريك الثقيلة-سلسلة--فقط الأجسام المضادة (هكابس) التي تحدث طبيعيا في31،الإبليات والأسماك الغضروفية32. أنها تشكل المجال الثقيلة-سلسلة متغير (فة) من هكابس ولها العديد من المزايا على الأجسام المضادة التقليدية (مثلاً، إيجس): أحادي، الصغيرة (كاتشين ~ 15)، القابلة للذوبان العالية، تخلو من ثنائي كبريتيد السندات، يمكن أعرب البكتريا، والمحدد ل ربط عالية تقارب33،34،،من3536. لجعل أداة نانوبودي لدينا تنوعاً وقابلة للتطبيق على نطاق واسع، استخدمنا نانوبوديس مكافحة فونكتيوناليزيد-التجارة والنقل للبروتينات السطحية-التسمية والمسار معلم مع التجارة والنقل في مجال اختصاصهم خارج الخلية/لومينال. الروغان نانوبوديس مع متشيري، اسكوربات البيروكسيديز 2 (APEX2) النقل إلى الوراء37، أو تسلسل تيروزين الكبرتة (TS)، أصيل البضائع transmembrane البروتينات يمكن تحليلها من قبل أما ثابتة ويعيش تصوير الخلية، التي المجهر الإلكتروني، أو كيميائيا. منذ الكبرتة تيروزين توسط سولفوترانسفيراسيس تيروسيلبروتين (TPST1 و TPST2) تعديل بوسترانسلاشونال مقيد إلى ترانس-غولجي/TGN, نحن يمكن مباشرة دراسة النقل وحركية من البروتينات للفائدة من سطح الخلية إلى هذا داخل الخلايا غولجي حجرة38،،من3940.

في هذه المقالة الأساليب، يصف لنا السهولة لإنتاج نانوبوديس فونكتيوناليزيد (فة-2xTS-APEX2،-مشري ومشتقاتها) مناسبة لعدد من التطبيقات لتحليل النقل إلى الوراء في خلايا الثدييات30. نحن تركز أساسا على استخدام الملخص تعديل موقع نانوبودي لتحليل حركة المرور داخل الخلايا من سطح الخلية حجرة الكبرتة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-البكتيرية التحول مع نانوبوديس فونكتيوناليزيد

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للتعبير، وتنقية، وتحليل لمكافحة فونكتيوناليزيد-التجارة والنقل نانوبوديس كما هو موضح سابقا30. Derivatization مع مويتيس البروتين الأخرى قد تحتاج إلى تعديل هذا البروتوكول القياسي.

  1. ذوبان الجليد تشيموكومبيتينت البكتيريا (~ 100 ميليلتر) مناسبة للتعبير البروتين (مثل الإشريكيّة القولونية رشيد BL21 الخلايا (DE3)) عن طريق وضعها على الجليد.
    ملاحظة: إعداد تشيموكومبيتينت الخلايا البكتيرية وفقا لإجراءات المختبر القياسية. وبدلاً من ذلك، يمكن شراء الخلايا البكتيرية كيميائيا المختصة تجارياً.
  2. إضافة 50 نانوغرام بلازميد ترميز نانوبوديس فونكتيوناليزيد. للسماح بيوتينيليشن الخاصة بالموقع كافية لمراسل نانوبودي خلال التعبير البكتيرية، إضافة أيضا زيادة ثلاثة إضعاف (150 نانوغرام) من بلازميد التعبير البكتيرية ترميز ليجاسى البيوتين البيرا (انظر أيضا الجدول 1 للحصول على معلومات بلازميد). بلطف بيبيت صعودا وهبوطاً.
    ملاحظة: إذا بيوتينيليشن نانوبودي ليس من الضروري أو الصحفيين نانوبودي تخلو ببتيد يقبلون بيوتين (BAP)، تحول المشارك مع بلازميد ترميز البيرا غير مطلوب.
  3. احتضان الخلايا البكتيرية لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  4. صدمة الحرارة الخلايا البكتيرية بوضعها لمدة 1 دقيقة على 42 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة تدفئة.
  5. أضف 1 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) متوسطة (رطل) مرق لوريا واحتضان البكتيريا المحولة في ثيرموشاكير على ح 1 في 37 درجة مئوية للسماح بالتعبير المظهرية من جينات مقاومة. إعداد L 1 رطل متوسطة، استخراج الرصيد 5 غ خميرة، 10 جرام من تريبتوني و 10 غم من كلوريد الصوديوم، تملأ بالمياه وتعقيمها قبل التعقيم. إذا كان قد تم سوبكلونيد نانوبودي فونكتيوناليزيد في متجه تعبير التي تحتوي على مقاومة الأمبيسلّين/كاربينيسيلين، يمكن أن يتم حذف الخطوة 1.5.
  6. بيليه البكتيريا في س 11,000 ز لمدة 1 دقيقة وريسوسبيند في 100 ميليلتر من جديد رطل متوسطة.
  7. لوحة البكتيريا المعلقة على لوحات رطل المحتوية على المضادات الحيوية الخاصة بكل منها (على سبيل المثال، مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين و 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين عند البكتيريا قد تحولت يشترك مع مراسل نانوبودي والبيرا كما ذكر أعلاه (الخطوة 1، 2)).
  8. وضع لوحات رطل في حاضنة في 37 درجة مئوية واسمحوا تنمو بين عشية وضحاها (O/N).
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا عن طريق تخزين لوحة رطل مع نمت المستعمرات في 4 درجات مئوية. استخدم بارافيلم لختم لوحات رطل.

2-البكتيرية ثقافة السائل والتعريفي للتعبير نانوبودي فونكتيوناليزيد

  1. اختيار مستعمرة البكتيريا التي تحتوي على ناقل الفائدة من اللوحة وتركها تنمو في قارورة تحتوي على 20 مل من رطل المتوسطة وتستكمل مع المضادات الحيوية س/ن في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية (انظر أيضا الخطوة 1.7 فيما يتعلق باختيار المضادات الحيوية).
  2. وفي اليوم التالي تمييع ثقافة البكتيرية نمت 20 مل إلى قارورة تحتوي على 1 لتر متوسطة رطل مع اختيار المضادات الحيوية.
  3. الاستمرار في احتضان ثقافة البكتيرية في 37 درجة مئوية حتى يصل OD600 من 0.6-0.7. تسمح الثقافة يبرد إلى RT قبل حمل التعبير البروتين.
  4. حمل التعبير البروتين نانوبوديس فونكتيوناليزيد والبيرا بإضافة 1 مل من م 1 الأيزوبروبيل-β-د-ثيوجالاكتوبيرانوسيد (إيبتج) بتركيز نهائي من 1 مم محفز (1:1، 000 تمييع). أيضا إضافة 10 مل من 20 ملم د-البيوتين الأسهم حل أسفر عن 200 ميكرومتر د-البيوتين في المتوسطة النمو للسماح بيوتينيليشن حانمه BAP موجودة في نانوبوديس فونكتيوناليزيد (انظر أيضا الجدول 1 للحصول على معلومات بلازميد)
    ملاحظة: الحل الأسهم د-البيوتين هو على استعداد في ddH2س وإحضارها إلى الحل بواسطة إضافة دروبويسي من 500 ملم نة2ص4. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضا حل د-البيوتين في [دمس]. لإنتاج nanobodies تنصهر فيها APEX2 (فة-APEX2)، يجب أن تستكمل المتوسطة رطل مع 1 مم 5-aminolevulinic حمض (دالا) هيدروكلوريد لتعزيز إدماج الهيم وبالإضافة إلى ذلك. دالا على استعداد كحل أسهم 100 ملم في ddH2o.
  5. احتضان ثقافة البكتيرية الناجمة عن إيبتج 1 لتر في 30 درجة مئوية ح 4 عن فة-2xTS، في 20 درجة مئوية أو RT O/N ل APEX2 فة، أو 16 ° ج س/N فة-مشري (انظر أيضا الجدول 1 للحصول على معلومات بلازميد).
    ملاحظة: يجب أن يكون الأمثل شروط التعبير لبناء نانوبودي جديدة بالمجرب.
  6. نقل ثقافة البكتيرية من قارورة في زجاجة الطرد المركزي 1 لتر وبيليه الخلايا في 5,000 س ز في 4 درجات مئوية عن 45 دقيقة صب المادة طافية والاستمرار التنقية.
    ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا عن طريق تخزين بيليه البكتيرية في-80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. بيليه فة--APEX2 أو متشيري فة عادة البنى (بسبب الهيم مدمجة) أو الوردي، على التوالي.

3-تنقية نانوبوديس فونكتيوناليزيد

  1. إذا لزم الأمر، ذوبان الجليد بيليه البكتيرية مجمدة في الجليد (انظر أيضا الخطوة 2، 6).
  2. إضافة 30 مل من المخزن المؤقت ملزم المثلج (ايميدازول 20 ملم في برنامج تلفزيوني 1 x) إلى بيليه الخلية البكتيرية وريسوسبيند بيبيتينج صعودا وهبوطاً. نقل البكتيريا حراكه في أنبوب 50 مل مسمى.
  3. الملحق ملزمة 30 مل المخزن المؤقت مع 200 ميكروغرام/مل lysozyme، 20 ميكروغرام/مل الدناز أنا و 1 مم مجكل2 1 مم فينيلميثيلسولفونيل الفلوريد (بمسف)، واحتضان أولاً لمدة 10 دقيقة في الرايت، ثم ح 1 في 4 درجات مئوية على شاكر النهاية أكثر.
  4. ميكانيكيا الخلايا البكتيرية في أنبوب 50 مل بوضع سونيكاتور تلميح إلى التعليق. تطبيق نبضات مستمرة 3 × 1 دقيقة مع الفترات الفاصلة بين فترات التبريد 1 دقيقة.
  5. الطرد المركزي البكتيريا في س 15,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة بيليه بالحطام وخلايا سليمة. نقل الخلية البكتيرية سونيكاتيد ليساتي أما إلى زجاجة الطرد المركزي مناسبة للطرد المركزي أو تقسيم عدة أنابيب 5 مل للطرد المركزي منضدية ليساتي.
  6. نقل المادة طافية في أنبوب 50 مل جديدة وتجاهل الحطام الأعلاف.
  7. تخزين تطهير ليساتي على الجليد أثناء إعداد تنقية بتقارب معدنية المعطل تداولها اللوني (ايماك). لعزل الحامض الأميني معلم نانوبوديس فونكتيوناليزيد، توظيف استخدام واحد أعمدة له (انظر الجدول للمواد) السماح لتنقية تدفق الجاذبية سريعة وبسيطة.
    ملاحظة: وبدلاً من ذلك، يمكن أيضا استخدام تنقية دفعة بدلاً من الأعمدة التجارية.
  8. تركيب الأعمدة له في موقف لمعادن.
    1. تفتق قبالة حل تخزين للأعمدة، وحجته له عمود مع 10 مل من ربط المخزن المؤقت (ايميدازول 20 ملم في برنامج تلفزيوني س 1).
    2. فارغة بتدفق الجاذبية (التدفق عبر يمكن تجاهلها).
  9. تحميل تدريجيا تطهير البكتيرية ليستي (~ 30 مل) على العمود. فارغة بتدفق الجاذبية (التدفق عبر يمكن تجاهلها).
  10. تغسل له عمود 2 x مع 10 مل من ربط المخزن المؤقت (ايميدازول 20 ملم في برنامج تلفزيوني س 1).
  11. الوت نانوبوديس مع 2 مل من شطف المخزن المؤقت (ايميدازول 500 ملم في برنامج تلفزيوني x 1) في أنبوب 2 مل وتطبيقها exchange المخزن مؤقت.
  12. Exchange المخزن المؤقت.
    1. حجته الملحي (انظر الجدول للمواد) وضع عمود في محول عمود أنبوب 50 مل 5 مرات مع 5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني.
    2. السماح للمخزن المؤقت لإدخال السرير معبأة. تجاهل في التدفق من خلال.
    3. وبعد الموازنة برنامج تلفزيوني الخامسة، تدور العمود في 1,000 س ز 2 دقيقة.
    4. تجاهل في التدفق من خلال.
    5. مكان العمود باستخدام المحول على أنبوب 50 مل جديدة. تحميل 2 مل نانوبودي فونكتيوناليزيد التيد (من الخطوة 3.11) على عمود الملحي اكويليبراتيد برنامج تلفزيوني وتدور في 1,000 س ز 2 دقيقة وجمع النذرة.
      ملاحظة: بدلاً من الأعمدة الملحي التجاري، يمكن تطبيق الغسيل الكلوي لتبادل تكوين المخزن المؤقت.
  13. تحديد تركيز البروتين (نانوبودي) من النذرة باستخدام بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) أو برادفورد المقايسة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: لفحوصات امتصاص نانوبودي بخطوط الخلايا مراسل بروتينات فلورية خضراء، بتركيز مخزون من 2-10 ملغ/مل الأمثل.

4-التحقق من صحة التعبير نانوبودي فونكتيوناليزيد (أخذ تلطيخ)

  1. إعداد المواد الهلامية 10-12.5% للصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وفقا للبروتوكولات القياسية.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام المواد الهلامية المتدرجة الخرسانة الجاهزة المتاحة تجارياً.
  2. بيبيت 20 ميكروغرام من نانوبودي فونكتيوناليزيد المنقي إلى أنبوب 1.5 مل ويغلي في المخزن المؤقت للعينة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: على سبيل مثال، إضافة 10 ميليلتر من حل الأسهم نانوبودي 2 مغ/مل إلى أنبوب 1.5 مل مع 10 ميليلتر من المخزن المؤقت للعينة x 2. إذا كانت وحدة التخزين صغير جداً، كذلك تضعف نانوبودي في برنامج تلفزيوني قبل إضافة المخزن المؤقت للعينة.
  3. تحميل نانوبودي المنقي المغلي في المخزن المؤقت للعينة على جل polyacrylamide الحزب الديمقراطي الصربي، وتشغيلها وفقا للبروتوكول صفحة قياسية حتى الصبغ مرجعية (مثلاً، بروموفينول الأزرق) وصلت إلى نهاية جل الفاصل، متبوعاً تلطيخ أخذ و ديستينينج.
  4. أخذ جل تلطيخ وديستينينج.
    1. أونكاست الهلام ووصمة عار أنه مع أخذ الحل المصبوغة (5% من الحل أخذ مخزون في 10% ميثانول حمض الخليك و 45% في ddH2س 10 جرام/لتر) لمدة 20-30 دقيقة في الرايت على منصة متحركة تهتز. وينبغي تغطية الجل تماما في الحل المصبوغة.
    2. ديستين الهلام 2-3 مرات مع ديستين الحل (7.5% ميثانول حمض الخليك و 15% في ddH2س) ح 1 كل في الرايت، قبل أن يغادر الجل س/N لزيادة ديستينينج.
      ملاحظة: أخذ الزائد يمكن أن تكون كفاءة غارقة حتى بوضع مناشف ورقية المطبخ حول الهلام.
  5. صورة الجل مع جهاز التصوير أو الكاميرا للاختيار.
    ملاحظة: يمكن التحقق من التعبير نانوبودي بتحليل إيمونوبلوت باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف بها [ابيتوبس] (انظر أيضا الشكل 1A).

5-الإقبال على نانوبوديس فونكتيوناليزيد بالخلايا المزروعة لتلطيخ الأسفار

  1. في غطاء ثقافة خلايا، خلايا هيلا البذور ~ 400,000 إلى 500,000 ستابلي معربا عن بروتين مراسل معلم بروتينات فلورية خضراء في كوفيرسليبس الزجاج 18 ملم (رقم 1.5 ح) في أطباق 35 ملم أو مجموعات 6-جيدا مع المتوسطة كاملة تحتوي على المضادات الحيوية (تعديل النسر المتوسطة دولبيكو، دميم ، تستكمل مع 10% مصل العجل الجنين (FCS)، 100 وحدة/مل ستربتوميسين، مم 2 لتر-الجلوتامين، وبوروميسين 1.5 ميكروغرام/مل).
    ملاحظة: هنا، نحن نستخدم خلايا هيلا ستابلي معربا عن اجفب-كالنيكسين، اجفب-كدمبر، ومعدل الخصوبة الإجمالي-اجفب لأغراض التوضيح. وبصرف النظر عن خطوط الخلايا مستقر، يمكن أن تستخدم أيضا عابر transfected خلايا هيلا. خطوط الخلايا مستقرة يمكن أن تزرع يشترك في هذه الخطوة مع الوالدين غير ترانسدوسيد هيلا الخلايا، للمقارنة المباشرة.
  2. احتضان خلايا O/N في 37 درجة مئوية في 7.5% CO2 حاضنة تتكاثر.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون الخلايا كونفلوينسي ~ 80% في اليوم التالي.
  3. بيبيت 2 ميليلتر حل الأسهم نانوبودي 2 مغ/مل إلى 15 أو 50 مل أنبوب يحتوي على 2 مل متوسطة كاملة (وحدة التخزين هذه غير كافية تغطية طبق 35 ملم أو بئر واحدة من كتلة 6-جيدا، وضبط حجم متوسط ونانوبودي التناسب لتشمل الخلية أكثر ثقافة د إيشيس أو مجموعات).
    ملاحظة: غرض التوضيح، نستخدم هنا فة-مشري، منذ لا تلطيخ جسم آخر مطلوب لرؤية نانوبودي استيعابه بالصحفيين اجفب (انظر الشكل 2).
  4. إزالة النمو المتوسطة من الخلايا، وإضافة 2 مل من بريوارميد المتوسطة كاملة تحتوي على 2 ميكروغرام/مل فونكتيوناليزيد نانوبودي كل طبق 35 ملم أو وحدة 6-جيدا.
  5. احتضان الخلايا ح 1 في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 7.5% للسماح بامتصاص نانوبودي المراسل بوساطة.
    ملاحظة: اعتماداً على التجربة المزمعة، وقت امتصاص نانوبودي يحتاج إلى تعديل. لهذه التجربة هو موضح هنا، ح 1 كافية للوصول إلى حالة مستقرة لامتصاص نانوبودي اجفب-كدمبر، ومعدل الخصوبة الإجمالي-اجفب.
  6. إزالة المتوسطة وتغسل الخلايا 2-3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني x 1 في الرايت
  7. إصلاح الخلايا مع 1 مل من 3% بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 10 دقائق في الرايت
  8. إزالة الحل منهاج عمل بيجين، واخماد مثبت المتبقية مع 1 مل من 50 مم NH4Cl في برنامج تلفزيوني x 1 لمدة 5 دقائق في الرايت
    ملاحظة: 3% منهاج العمل ينبغي أن يتم التخلص من النفايات بشكل منفصل مثبت.
  9. تغسل الخلايا 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني x 1 في الرايت
  10. بيرميبيليزي الخلايا مع 1 مل من 0.1% X-100 تريتون في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في الرايت
    ملاحظة: على الرغم من أن لا بيرميبيليزيشن غير مطلوب، ومضان اجفب ومتشيري أفضل عند بعد ذلك يتم تضمين الخلايا في وسط تصاعد.
  11. تغسل الخلايا 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني x 1 في الرايت
  12. وضع في كوفيرسليبس مع الملقط على قطره (~ 100 ميليلتر) لجيش صرب البوسنة 1% في PBS x 1 يحتوي على 5 ميكروغرام/مل DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي) لمدة 5 دقائق في الرايت
  13. ضع كوفيرسليبس العودة إلى الطبق/البئر ويغسل 3 مرات مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في الرايت
  14. قم بتسمية الشرائح الزجاجية وجبل الخلايا مع فلوروماونت-غ. واسمحوا المتوسطة تصاعد التشدد في الظلام ح 3-4 وتخزين الشرائح الزجاجية في 4 درجات مئوية تحت حماية الخفيفة.
  15. صورة تلوين أنماط استخدام مجهر الاختيار (مثلاً، مجهر تستقيم نقطة المسح [كنفوكل]).

6-الإقبال على نانوبوديس فونكتيوناليزيد بالخلايا المستزرعة (لتحليل الكبرتة)

  1. في غطاء ثقافة خلية، البذور خلايا هيلا ~ 400,000 إلى 500,000 ستابلي معربا عن بروتين مراسل معلم بروتينات فلورية خضراء في الأطباق 35 ملم أو على مجموعات 6-جيدا مع المضادات الحيوية التي تحتوي على المتوسط كاملة (المتوسطة "تعديل النسر" في دولبيكو، دميم، وتستكمل مع العجل الجنين 10% المصل (FCS) 100 وحدة/مل ستربتوميسين، مم 2 لتر-الجلوتامين وبوروميسين 1.5 ميكروغرام/مل).
    ملاحظة: وكما ذكر أعلاه، هنا نستخدم خلايا هيلا ستابلي معربا عن اجفب-كالنيكسين، اجفب-كدمبر، ومعدل الخصوبة الإجمالي-اجفب لأغراض التوضيح. وبصرف النظر عن خطوط الخلايا مستقرة، يمكن أن تستخدم أيضا عابر transfected هيلا.
  2. احتضان خلايا O/N في 37 درجة مئوية في 7.5% CO2 حاضنة تتكاثر.
    ملاحظة: وينبغي أن تحتوي الخلايا كونفلوينسي ~ 80% في اليوم التالي.
  3. إزالة المتوسطة كاملة ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني x 1 في الرايت وتجويع الخلايا مع خالية من كبريتات المتوسطة (SFM) على ح 1 في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 7.5 ٪.
    ملاحظة: بإضافة 10 مل من MEM الأحماض الأمينية (50 س) الحل، 5 مل من لام الجلوتامين (200 ملم)، 5 مل من محلول فيتامين (100 x)، و 900 ميليلتر من كاكل2·2H2س إلى 500 مل الأملاح متوازنة النسر بإعداد الإدارة المستدامة للغابات. تمرير من خلال تصفية ميكرومتر وقاسمه 0.22.
  4. في هود التهوية أو مقعد مخصص لعمل النشاط الإشعاعي، تحضير كبريتات وسم المتوسطة التي تحتوي على 0.5 mCi/مل [35S] كبريتات كملح الصوديوم في الإدارة المستدامة للغابات.
    تنبيه: التعامل مع جميع الحلول التي تحتوي على النشاط الإشعاعي بعناية. تعمل فقط في أغطية المعينة أو مقاعد. جميع المواد (نصائح، أنابيب، لوحات، إلخ) أو مخازن المياه والصرف الصحي على اتصال بالنشاط الإشعاعي وقد جمعها والتخلص منها بشكل منفصل. هذا لجميع الخطوات أدناه (الخطوة 6.5-6.20) كذلك.
  5. إضافة 2xTS فة في برنامج تلفزيوني x 1 إلى كبريتات وسم المتوسطة إلى تركيز نهائي 2 ميكروغرام/مل.
    ملاحظة: كعنصر تحكم، تشمل أيضا فة-الأمراض المنقولة جنسياً أو نانوبودي آخر يخلو من مواقع الملخص لإظهار العلامات المحددة.
  6. يستعاض عن الإدارة المستدامة للغابات من 0.7 مل كبريتات وسم المتوسطة المحتوية على سلفات 0.5 mCi/مل [35S] و 2 ميكروغرام/مل 2xTS فة واحتضان الخلايا ح 1 في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 7.5% المعينين للعمل مع النشاط الإشعاعي.
    ملاحظة: اعتماداً على التجربة المزمعة، وقت الكبرتة نانوبودي يحتاج إلى تعديل. وبالإضافة إلى ذلك، لتحديد حركية وصول TGN, العلامات يتم لأوقات مختلفة (على سبيل المثال، لدقيقة 10، 20 دقيقة، 30 دقيقة، إلخ.).
  7. إزالة المتوسطة التوسيم وغسل الخلايا 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني x 1 المثلج على لوحة التبريد أو الجليد.
  8. أضف 1 مل من تحلل المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% تريتون X-100 و 0.5% deoxycholate) تستكمل مع مم 2 بمسف و 1 × مثبطات البروتياز كوكتيل واحتضان الخلايا لمدة 10-15 دقيقة على منصة هزاز عند 4 درجة مئوية.
  9. كشط ونقل في أنبوب 1.5 مل، دوامة، ووضع لمدة 10-15 دقيقة على دوار أكثر من النهاية عند 4 درجة مئوية.
  10. إعداد بوستنوكلير بالطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  11. استخدام أنبوب 1.5 مل جديدة، إعداد 20-30 ميليلتر من ملاط حبات النيكل في أنبوب 1.5 مل ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x بلطف التكوير لهم في س 1,000 ز لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: ويمكن استخدام الخرز، الخرز ستريبتافيدين (إذا كان نانوبودي بيوتينيلاتيد) أو البروتين بالخرز مع مفتش ضد حانمه نانوبودي (T7-أو ها--الوسم) بدلاً من النيكل.
  12. نقل بوستنوكلير في أنبوب 1.5 مل تحتوي على النيكل الخرز واحتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية في دوار نهاية أكثر لعزل في نانوبوديس. إزالة قاسمة (50-100 ميليلتر) بوستنوكلير ليستي وتغلي في المخزن المؤقت لنموذج صحيفة بيانات السلامة لتحليل immunoblot اللاحقة من مجموع نانوبودي المرتبطة بالخلية ومراسل بروتينات فلورية خضراء وتحميل عنصر التحكم.
  13. أغسل حبات 3 مرات مع 1 × المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني أو تحلل بلطف التكوير في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: لغسيل أكثر صرامة من الخرز، يمكن تضمين ايميدازول 20 ملم في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني أو تحلل.
  14. بعناية إزالة جميع الغسيل العازلة من الخرز وإضافة 50 ميليلتر من 2 × عينة المخزن المؤقت، ويغلي لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
  15. تحميل كلا مغلي حبات على ميدي 12.5 في المائة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة جل والتشغيل وفقا للبروتوكول صفحة قياسية حتى صبغة مرجعية (مثلاً، بروموفينول الأزرق) قد وصلت إلى نهاية هلام فصل.
    ملاحظة: تحليل إيمونوبلوت من إجمالي نانوبودي المرتبطة بالخلية ومراسل بروتينات فلورية خضراء وتحميل عنصر التحكم يمكن أن يؤديها أيضا استخدام ميني 12.5% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أو هلام التدرج الخرسانة الجاهزة.
  16. إصلاح هلام فصل في ~ 30 مل من التثبيت المخزن المؤقت (10% ميثانول حمض الخليك و 45% في ddH2س) لح 1 في الرايت وغسل الجل ثلاث مرات مع ~ 50 مل مياه. والتحضير لجل التجفيف.
  17. تجفيف المواد الهلامية الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
    1. بعناية وضع هلام الثابتة على الفيلم تتشبث ممدد وتغطية ذلك مع بريكوت تصفية الورق.
    2. ضعه الهلام مع ورق الترشيح أسفل أعلى منصة التجفيف، ضع غطاء الفراغ، والتبديل على مضخة فراغ لتجفيف هلام. الجاف للجل ح 3-5.
    3. إزالة الفيلم تتشبث ووضع هلام المجففة في كاسيت autoradiography مزودة بشاشة الفوسفور.
  18. أوتوراديوجراف الصورة باستخدام "تصوير الشاشة" الفوسفور. اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: اعتماداً على قوة الإشارة، المجففة الحاجة إلى المواد الهلامية يتعرض أطول مع شاشات الفوسفور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتحقيق في نقل البروتين إلى الوراء إلى مختلف الوجهات داخل الخلايا، أنشأنا مؤخرا أداة تستند إلى نانوبودي المضادة-التجارة والنقل لوسم وتتبع البروتينات الانصهار المؤتلف من سطح الخلية30. وهنا نبدي إنتاج البكتيرية مثل ديريفاتيزيد نانوبوديس، وتبرهن على تطبيقها لدراسة امتصاص اندوسيتيك المجهري الأسفار وإيمونوبلوتينج، فضلا عن استخدامها للتحقيق وصول TGN بتحليل الكبرتة. أن تطبيق هذا الأخير هو التركيز المنهجي لهذا البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نانوبوديس تمثل طبقة ناشئة من البروتين السقالات الموثق بالعديد من المزايا على الأجسام المضادة التقليدية: فهي صغيرة، ومستقرة، وأحادي, ويمكن تحديدها لسندات عالية من ثنائي كبريتيد تقارب والافتقار إلى3533،، 44 , 45-وهي تستخدم في عدد من التطبيقات، مثل في نظم الثقافة الخلايا والكائنات الحية في علم الأحياء التنموي46،47،مشرفات

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل 31003A-162643 منحة من "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية". ونحن نشكر بورت نيكول وبيوزينتروم التصوير الأساسية مرفق (إيمكف) للدعم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

يتم توزيع منتج
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
118144600001 الأجسام المضادة للجسم المضاد ل GFPSigma-Aldrichبواسطة Sigma-Aldrich ، ولكن تم تصنيعه بواسطة Roche
Anti-His6 للأجسام المضادةBethyl LaboratoriesA190-114A
الأجسام المضادة للأكتينEMD MilliporeMAB1501
الماعز المضادة للأرانب HRPسيجما-ألدريتشA-0545
الماعز المضادة للفأر HRPسيجما ألدريتشA-0168
4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI)سيجما-ألدريتشD9542مذاب في 1x PBS / 1٪ BSA
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)ApplichemA3672
D-biotinSigma-AldrichB4501مذاب في معقم 500 ملي مولار NaH 2< / sub >PO 4 < / sub > أو DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) هيدروكلوريدسيجما-ألدريتشA3785مذاب في ماء معقم
DNase IApplichemA3778مذاب في ماء معقم
يتم توزيع المنتج LysozymeSigma-Aldrich18037059001بواسطة Sigma-Aldrich ، ولكن تم تصنيعه بواسطة Roche
Brefeldin A (BFA)Sigma-AldrichB5936
PuromycinInvivogenant-pr-1
البنسلين / الستربتومايسينBioconcept4-01F00-H
L-glutamineApplichemA3704
Dulbecco ' s النسر المعدل s متوسط (DMEM)سيجما ألدريتشD5796
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) BiowestS181B-500
Sulfur-35 كبريتات الصوديومHartmannAnalyticsARS0105 يحتوي المنتج على أملاح
إيرل المتوازنةمحلول الأحماض الأمينية Sigma-AldrichE6267
MEM (50x)Sigma-AldrichM5550
MEM محلول فيتامين (100x)Sigma-AldrichM6895
cOmplete ، كوكتيل مثبط البروتياز الصغيرSigma-Aldrich11836153001يتم توزيع المنتج بواسطة Sigma-Aldrich ، ولكن تم تصنيعه بواسطة Roche
Isopropyl-& beta ؛ -D-thiogalactopyranosid (IPTG)ApplichemA1008مذاب في ماء معقم ، المخزون 1 M
ملح كاربينيسيلين ثنائي الصوديومApplichemA1491مذاب في ماء معقم ، المخزون 100 مجم / مل
كبريتات كاناميسينApplichemA1493مذاب في ماء معقم ، المخزون 100 مجم / مل
Coomassie-R (أزرق لامع)Sigma-AldrichB-0149
Paraformaldehyde (PFA)ApplichemA3813
ألبومين مصل البقر (BSA)Sigma-AldrichA2153
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Ni Sepharose عالية الأداءGE Healthcare17-5268-01
أعمدة GraviTrap الخاصة بهGE HealthcareGE11-0033-99
مجموعة العازلة الخاصة بهGE HealthcareGE11-0034-00
أعمدة تحلية PD10 يمكن التخلص منها GEHealthcareGE17-0851-01
جل TGX البروتيني الصغير ، 4-20٪ ، 15 بئرBio-Rad456-1096
Dulbecco s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) بدون Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup>Sigma-AldrichD8537
أطباق 35 ممFalcon353001
6 آبارTPP92406
أغطية زجاجية (رقم 1.5H)VWR631-0153
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ApplichemA0999.0025مذاب في 40٪ DMSO 60٪ إيزوبروبانول ، مخزون في 500 ملي مولار
TryptoneApplichemA1553
مستخلص الخميرةApplichemA1552
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومMerck Millipore105833مذاب في ماء معقم ، المخزون 1 م
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتميرك ميليبور102382مذاب في ماء معقم ، المخزون 1 م
106404 مذاب كلوريد الصوديومMerck Milliporeفي ماء معقم ، المخزون 5 م

المراجع

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737(2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

GFP
تحليل لامتصاص اندوسيتيك والنقل إلى الوراء إلى غولجي عبر الشبكة باستخدام نانوبوديس فونكتيوناليزيد في الخلايا المستزرعة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.