ويتيح هذا البروتوكول التصور للتعبير الجيني في الجنينية أستياناكس كافيفيش. وقد وضعت هذا النهج مع الهدف المتمثل في تعظيم إشارة تعبير الجينات، مع التقليل من تلوين الخلفية غير محددة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في السنوات الأخيرة، صدرت مشروع جينوم ل cavefish المكسيكية المكفوفين (مكسيكي أستياناكس)، الكشف عن هويات تسلسل لآلاف جينات. رسملة البحوث السابقة في هذا النظام النموذجي الناشئة على إجراء تحقيقات شاملة على نطاق الجينوم التي حددت عديدة السمات الكمية المكاني (QTL) المرتبطة بشتى تعمل المرتبطة بالكهف. بيد أن القدرة على الاتصال الجينات التي تهم بالأساس الموروثة لتغيير المظهرية لا يزال يشكل تحديا كبيرا. هو أسلوب واحد يمكن أن تيسر فهم أعمق لدور التنمية في تطور تروجلومورفيك الجامعة-جبل التهجين في الموقع. يمكن تنفيذ هذا الأسلوب مباشرة مقارنة التعبير الجيني بين أشكال الكهف وسطح المسكن، وترشيح الجينات الكامنة أنشئت QTL، تحديد الجينات للفائدة من الدراسات تسلسل الجيل القادم، أو تطوير أخرى النهج القائم على الاكتشاف. وفي هذا التقرير، نقدم بروتوكول بسيط، تدعمها قائمة مرجعية مرنة، يمكن تكييفها على نطاق واسع للاستخدام خارج نظام الدراسة المقدمة. ونأمل أن هذا البروتوكول يمكن أن تخدم كمورد واسعة للمجتمع أستياناكس وما بعدها.
المقدمة
التهجين في الموقع أسلوب شائع لتلطيخ الأنسجة الثابتة لتصور أنماط التعبير الجيني1. وقد أجريت هذه التقنية للسنوات الأخرى التقليدية2 و غير التقليدية3 نظم نموذجية، لمجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية. ومع ذلك، العديد من الخطوات والكاشفات ضرورية لنجاح تنفيذ هذا الإجراء. للمحققين الذين أدوا ابدأ هذا الأسلوب، يمكن الشروع في العملية تخويف نظراً للخطوات العديدة التي ينطوي عليها. علاوة على ذلك، طبيعة هذه الإجراءات المطولة يفسح المجال للأخطاء التقنية، التي يمكن أن يكون تحديا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
والهدف العام لهذه المادة هو تقديم أسلوب بسيط ومباشر سوف تجعل هذه التقنية التهجي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة سينسيناتي (البروتوكول رقم 10-01-21-01).
1-التثبيت
- عزل العدد المطلوب من الأجنة أستياناكس مكسيكي من خزان لتربية وإصلاح الأجنة ~ 50 في وقت واحد. إذا الأجنة الكبيرة والقديمة، قد يكون من الضروري على إصلاح 25 في وقت واحد لضمان التثبيت حتى.
- تبعاً لعمر الجنين، استخدام أسلوب الموافقة على IACUC للتخدير. لكبار السن من الأجنة مع أداء الجهاز العصبي، التضحية بالأجنة عن طريق جرعة زائدة من مخدر. تبعاً لذلك، وضع الأجنة في حل تريكيني ~ 1% (مخزنة على درجة الحموضة 7.4) للتقليل من الألم والانزعاج للكائن الحي.
- عندما لا يستجيب للمس ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وفي هذا التقرير، نقدم نهجاً بسيطاً ومباشرا للقيام بوضع العلامات الجنينية أستياناكس عينات لتحليل التعبير الجيني عالية الجودة. هذا الأسلوب يمكن أن تنفذ في أربعة أو خمسة أيام، ويتم تمثيل كل خطوة رئيسية في الإجراء في مخطط انسيابي مرمزة (الشكل 1). عند الانتهاء، يجب أن المرفأ أجنة ملطخة تسمية لوني أرجواني داكن في الأنسجة التعبير عن الجينات خاصة لمصلحة. وقد نفذنا هذا البروتوكول بنجاح في كل من Pachón كافيفيش (الشكل 2A–
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نظراً لضعف الجيش الملكي النيبالي للتدهور، إحدى الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول يتعلق بتوليف العقيمة لمسبار الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، إذا كان تحقيق يتم إنشاؤها بعناية، ويقدم نتائج جيدة، فإنه يمكن إعادة استخدامها في ردود المصبوغة لاحقة. خطوة حاسمة ثانية هو إنتاج دقيق لجميع الكواشف المستخدمة في البروتوكول. حيث يتضمن هذا البروتوكول عدة أيام وخطوات صغيرة كثيرة، فمن الضروري أن الكواشف كل دقة تنتج، وتخزينها بطريقة عقيمة. علاوة على ذلك، من المهم أساسا أن المحقق يبقى المسار الدقيق لكل خطوة في البروتوكول. وقد وجدنا أن القائ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
الكتاب أود أن أشكر أعضاء المختبر الإجمالي لتعليقات مفيدة في هذه المخطوطة. ونود أن نعترف بأربعة من طلاب المدارس الثانوية الذين يستخدم هذا البروتوكول خلال التدريب الصيفي في عام 2017 و 2018، بما في ذلك كريستين تساو وناظر مايكل ولي Aki وديفيد نوانكوو. وأيد HL زمالة "الجذعية البيولوجيا جامعة كاليفورنيا" خلال صيف عام 2017. كان يؤيد هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم (ديب-1457630 إلى JBG)، والمعاهد الوطنية لطب الأسنان والجمجمة البحوث (المعاهد الوطنية للصحة؛ DE025033 إلى JBG).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10 مل ماصة مصلية | VWR | 89130-888 | |
| 1000 مل وحدة الترشيح | VWR | 89220-698 | |
| 15 مل مخروطية | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 مل ماصة مصلية | VWR | 89130-890 | |
| 250 مل وحدة الترشيح | VWR | 89220-694 | |
| 5 مل ماصة مصلية | VWR | 89130-886 | |
| 50 مل مخروطي | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 مل وحدة الترشيح | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP ، شظايا فاب | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 جم |
| محلول حجب | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 جم |
| حامض الستريك | فيشر Scientific | A104-500 | 500 جم |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6 / T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 مل |
| قوارير زجاجية | VWR | 66011-041 | 1 دكتور |
| زجاج ماصات | فيشر Scientific | 13-678-8A | |
| حمض الهيدروكلوريك | حراري-علميPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 مل |
| هيبارين | سيجما | H3393-25KU | |
| كلوريد المغنيسيوم بلوري | فيشر Scientific | M33-500 | 500 جم |
| حمض الماليك | سيجما | M0375-100 جم | 100 جم |
| ميثانول | فيشر Scientific | A452-4 | 4 لتر |
| مياه من الدرجة الجزيئية (خالية من RNase) | VWR | 7732-18-5 | 500 مل |
| كلوريد الصوديوم | فيشر Scientific | S271-3 | 3 كجم |
| كريات هيدروكسيد الصوديوم | فيشر Scientific | S318-500 | 500 جم |
| مسحوق الركيزة NBT | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 جم |
| مصل الماعز العادي | فيشر إنفيتروجين | 31873 | |
| خلاط الجوز | VWR | 82007-202 | |
| بارافورمالدهيد | سيجما | 158127-500 جم | 500 جم |
| PBS 10x | فيشر Scientific | BP399-20 | 20 لتر |
| بروتيناز K (200 مجم / 10 مل) | Qiagen | 19133 | 10 مل |
| ماصات بلاستيكية | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 مل |
| مائي اهتزاز 12 لتر | VWR | 10128-126 | 12 لتر |
| شاكر تناظري قياسي | VWR | 89032-092 | |
| تريس | سيجما ميليبور-أومني بير | 9210-500 جم | 500 جم |
| خميرة الحمض النووي الريبي | فيشر إنفيتروجين | 15401011 | 25 مجم |
| توين 20 | سيجما | P9416-50 مل | 50 مل |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries، Inc | 50-728-002 | |
| كلوريد الليثيوم (LiCl) | سيجما ألدريتش | 203637-10G | 10 جم |
المراجع
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as r....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
