مقالة منهجية

العزلة والتبني نقل الملح عالية يعامل عرض مستضد الخلايا الجذعية

DOI:

10.3791/59124

⸱

مارس 5, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية من الطحال مورين بفرز الخلايا المغناطيسية ونقل التبني اللاحقة في الفئران ساذجة. تم اختيار نموذج لتنشيط الخلايا الجذعية الملح عالية شرح إجراءات خطوة بخطوة لنقل التبني والتدفق الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسهم في التهاب الزائدة المدخول الغذائي الملح وتلعب دوراً حيويا في تطوير ارتفاع ضغط الدم. وجدنا سابقا أن عرض مستضد الخلايا الجذعية (DCs) بمعنى مرتفعة الصوديوم خارج الخلية، مما يؤدي إلى تفعيل أوكسيديز نادف وتشكيل إيسوليفوجلاندين (إيسولج)-أدوكتس البروتين. هذه إيسولج البروتين adducts تتفاعل مع البروتينات المتمتعة بالحكم الذاتي، وتعزيز المناعة الذاتية مثل الدولة وارتفاع ضغط الدم. لدينا تطوير وتحسين أساليب الدولة للفنون لدراسة وظيفة DC في ارتفاع ضغط الدم. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل للعزلة، في معاملة المختبر مع الصوديوم مرتفعة، والتبني نقل مورين CD11c الطحال+ الخلايا في الفئران المستفيدة لدراسة دورها في ارتفاع ضغط الدم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الملح الغذائية الزائدة عامل خطر رئيسي لارتفاع ضغط الدم. 1 , 2 "جمعية القلب الأمريكية" توصي كحد أقصى 2,300 مليغرام (ملغم) من تناول الصوديوم (Na+) في اليوم الواحد، ومع ذلك؛ أقل من 10% سكان الولايات المتحدة تلاحظ هذه التوصية. 3 , 4 تخفيضات متواضعة في المدخول نا+ انخفاض ضغط الدم، وتقليل حالات جديدة سنوياً من مرض القلب التاجي والسكتة الدماغية في الولايات المتحدة بنسبة 20%. 5 مشكلة رئيسية مع الزيادة في استهلاك الملح هو أن 50 في المائة من السكان ارتفاع ضغط الدم والمعارض الملح-حساسية، ويعرف بزيادة 10 مم زئبق في ضغط الدم بعد نانا+ تحميل أو حدوث انخفاض مماثل في ضغط الدم + القيد وإدرار البول. 6 الملح حساسية كما يحدث في 25% أفراد نورموتينسيفي، وهو توقع مستقلة من الموت وأحداث القلب والأوعية الدموية. 7 , 8 آليات الاستشعار عن الملح في ارتفاع ضغط الدم التي تنطوي على الكلي درست؛ بيد أن الدراسات الحديثة تشير إلى أن الخلايا المناعية يمكن الشعور نا+. 9 , 10

تشير الدلائل الأخيرة إلى أن التغييرات في خارج الكلوية نا+ التعامل مع يمكن أن تسبب تراكم نا+ في إينتيرستيتيوم وتشجيع التهاب. 11 , 12 مختبرنا وغيرها قد أظهرت أن خلايا نظام المناعة الفطرية والتكيف تسهم في تفاقم ارتفاع ضغط الدم. 9 , 13 , 14 , 15 المحفزات فرط ضغط الدم المختلفة، بما في ذلك وحيدات انجيوتنسين الثاني وإفراز والسبب الملح الضامة، والخلايا الليمفاوية T التسلل في الكلي والمفرج وتشجيع استبقاء نا+ ، تضيق الأوعية، وضغط الدم الارتفاع، وتلف الجهاز نهاية. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 وفي الدراسات السابقة، وجدنا أن وحدات تحكم المجال Dc تتراكم إيسوليفوجلاندين (إيسولج)-أدوكتس البروتين في الاستجابة للمحفزات فرط ضغط الدم المختلفة بما في ذلك انجيوتنسين الثاني والملح دوكا ارتفاع ضغط الدم. 14 إيسولجس منتجات وبيروكسيد شدة رد الفعل بسرعة وتساهمي أدوكت إلى ليسينيس على البروتينات وتراكمها ويرتبط مع التنشيط DC. 14 وقد أنشأنا مؤخرا أن نا مرتفعة+ حافز قوي للبروتين إيسولج أدوكت تشكيل في الفئران وساطة وحدات تحكم المجال Dc-9 غ+ الدخول إلى وحدات تحكم المجال Dc عن طريق ناقلي amiloride الحساسة. ثم يتم تبادل نا+ للكالسيوم (Ca2 +) عن طريق+Na/Ca2 + المبادل. Ca2 + تنشيط بروتين كيناز ج (PKC) الذي ينشط أوكسيديز نادف مما أدى إلى زيادة أكسيد فائق (س2·-) والبروتين إيسولج أدوكت تشكيل. 9 نقل التبني المعرضة للملح ضغط الدم يعبي وحدات تحكم المجال Dc استجابة لجرعة موترة الفرعي من انجيوتنسين الثاني. 9

تحديد CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc من الأنسجة قد اقتصر سابقا على إيمونوهيستوتشيميستري و RT-PCR، والعزلة من وحدات تحكم المجال Dc قد اقتصر على الخلية الفرز حسب التدفق الخلوي. على الرغم من أن التدفق الخلوي الخلية الفرز وسيلة قوية لعزل الخلايا المناعية، مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، ويؤدي إلى انخفاض عائد من خلايا قابلة للحياة. ولذلك، نحن الأمثل بروتوكول خطوة بخطوة لهضم الأنسجة والتحفيز في المختبر، والتبني نقل CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc لدراسة ارتفاع ضغط الدم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت جامعة فاندربيلت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام الإجراءات الموضحة هنا. يسكن الفئران ورعايتهم وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الصحافة الأكاديميات الوطنية. 2010 المنقحة).

1-عزل الطحال من الفئران

  1. إعداد 1640 RPMI: 10% FBS، 0.10 مم حبيس، بيروفات صوديوم 1 مم، 50 ميكرومتر β-mercaptoethanol والبنسلين/ستربتوميسين 1%.
  2. Euthanize 10 – 12 أسبوع-القديمة C57bl/6 ذكور الفئران باستنشاق أول أكسيد الكربون2 . رش الصدر والجانبين للماوس مع الإيثانول 70%. على الجانب الأيسر، بعناية فتح الجلد والتجويف الصفاقى لفضح الطحال.
  3. استخدام الملقط الصغيرة، حذر تحريك الأمعاء والكبد في الجانب الأيمن من الماوس، واستخدام مقص غرامة بلطف المكوس الطحال.
    ملاحظة: هذه الخطوة يجب أن يتم بعناية فائقة كما تلف الجهاز الهضمي يمكن حمل التلوث.
  4. ضع كل الطحال قصت في الأنبوبة المسماة 15 مل المخروطية التي تحتوي على 3 مل متوسط RPMI 1640.

2-جيل تعليق خلية مفردة من الطحال

ملاحظة: يمكن فصل الطحال في تعليق خلية واحدة فقط عن طريق الجمع بين الانفصال الميكانيكية بالإضافة إلى الهضم الأنزيمي.

  1. إعداد الحل الهضم الطحال عن طريق إضافة كولاجيناز د (1 ملغ/مل؛ 0.29 يو/mg المجففة بالتبريد) والدناز الأول (0.1 مغ/مل) لإعداد المتوسط RPMI 1640 (راجع الخطوة 1، 1)
  2. استخدام الملقط لنقل الطحال في أنبوب ج (أنبوب الانفصال) التي تحتوي على 3 مل من محلول الهضم الطحال.
  3. إجراء الانفصال الميكانيكية باستخدام الخالطون شبه إليه وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    1. ضع الأنبوب ج على الخالطون شبه الآلي، ضمان أن الأنبوب ج يوضع مشددة على الذراع الدورية. حالما يتم وضع أنبوب ج، اضغط على زر ابدأ في الخالطون شبه الآلي تشغيل بروتوكول 04.01 الطحال ل 60 ثانية.
      ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الانفصال الميكانيكية عن طريق وضع عامل تصفية 40 ميكرومتر على رأس أنبوب مخروطي 50 مل بلطف طحن الطحال من خلال عامل تصفية. بعد طحن الطحال، عن طريق شطف تصفية 40 ميكرومتر مع 10 مل الإعلام ربمي.
  4. بعد الانفصال الميكانيكية، فصل الأنبوب من الخالطون وأداء الهضم الأنزيمي. احتضان هذه العينات لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت التناوب المستمر (20 لفة في الدقيقة).
  5. نقل الحل عن طريق بيبيتينج في أنبوب 50 مل مخروطية بعد عملية التصفية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر. أغسل مصفاة ميكرومتر 40 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني في دولبيكو (دببس). الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  6. بعد الطرد المركزي، نضح المادة طافية تماما وتغسل بيليه ريسوسبيندينج في 10 مل دببس. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.

3-عزل CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc من تعليق خلية مفردة الطحال

  1. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل دببس، وحساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق الاستبعاد.
  2. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في 300 س ز، لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  3. نضح المادة طافية تماما وريسوسبيند بيليه في 400 ميليلتر (ماك) فرز الخلايا مغناطيسيا المخزن المؤقت.
  4. إضافة 100 ميليلتر من ميكروبيدس CD11c (انظر الجدول للمواد) كل 1 × 108 خلايا.
  5. دوامة تعليق خلية واحتضان لمدة 10 دقائق في الثلاجة على 4 درجة مئوية.
  6. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش لغسل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  7. نضح المادة طافية تماما وريسوسبيند في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش.

4-الفصل المغناطيسية بين CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc

ملاحظة: الفصل المغناطيسي يتم يدوياً مع فاصل مغناطيسي (انظر الجدول للمواد) تجهيزه مع "أعمدة ليرة سورية". يمكن أيضا أن يتم فصل المغناطيسية تلقائياً مع فاصل مغناطيسي الآلي. (انظر الجدول للمواد).

  1. مكان العمود LS في المجال المغناطيسي لفاصل أجهزة ماكينتوش وأنبوب مخروطي 15 مل تحت كل عمود جمع في التدفق من خلال.
  2. شطف العمود LS مع 3 مل من المخزن المؤقت.
  3. وضع تعليق خلية على كل عمود LS وجمع-التدفق عبر تحتوي على خلايا غير مسمى.
  4. أغسل العمود LS مع 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش جمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر. أغسل العمود LS 2 مرات أكثر.
  5. إزالة العمود LS من الفاصل المغناطيسي. إضافة 5 مل من أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت لكل عمود وفورا طرد الخلايا المسماة مغناطيسيا بشدة تغرق العمود LS أنبوب مخروطي نظيف 15 مل.
    ملاحظة: من المهم القيام عزل مزدوج من الخلايا CD11c للحصول على تعليق خلية درجة نقاء عالية. ولذلك، كرر الخطوات 3.1 خلال 4.5. ويشير الرقم 4 لمعايير النقاء. هذه الخطوة ويحسن نقاء CD11c+ الخلايا إلى 90 – 95%.
  6. تحديد CD11c+ DC الرقم على هيموسيتوميتير استخدام الاستبعاد تريبان الأزرق. تمييع عينة خلية في إضعاف 1:1 في حل تريبان الأزرق 0.4 في المائة.
    ملاحظة:     الخلايا عدم البقاء سوف الملون الأزرق، بينما تبقى خلايا قابلة للحياة أونستينيد.
    1. للقيام بذلك، بعناية ملء هيموسيتوميتير مع 10 ميليلتر لتمييع عينة الخلية واحتضان لمدة 1 دقيقة.
    2. حساب عدد الخلايا في المربعات 4 1 × 1 مم2 في الدائرة التي تم تحميل إلى تحديد عدد الخلايا قادرة على البقاء.

5-في معاملة المختبر عالية الملح CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc

  1. تعد العاصمة الثقافة المتوسطة بإضافة 10% FBS، 0.1 مم حبيس، بيروفات صوديوم 1 مم، 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول والبنسلين/ستربتوميسين 1% إلى 500 مل 1640 ربمي.
  2. إعداد 10 × DC خلية الملح عالية الثقافة الإعلامية (400 ملم) وزنها إلى 1.17 غرام من كلوريد الصوديوم ووضعه في أنبوب فالكون 50 مل عقيمة. إضافة 50 مل وسائط الثقافة العقيمة خلية DC (أعد في الخطوة 5، 1) للأنبوب فالكون 50 مل ودوامه حتى كلوريد الصوديوم في الحل.
  3. فورا تصفية عالية الملح DC ثقافة وسائل الإعلام استخدام الترشيح الفراغ من خلال عامل تصفية 0.2 ميكرومتر في غطاء ثقافة خلية.
  4. الطرد المركزي كل تعليق خلية من الطحال في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4ºC. ريسوسبيند بيليه كل خلية في العاصمة الثقافة الإعلام بتركيز 1 × 106 خلايا/مل.
  5. "الماصة؛" 900 ميكروليتر (حوالي 1 × 106 خلايا) تعليق DC في قاع لوحة الصقر شقة 24-جيدا. إضافة 100 ميليلتر من ارتفاع الملح DC ثقافة وسائل الإعلام لكل بئر لتركيز صوديوم نهائية من 190 ملم. تسمية اللوحة ومكان في 37 درجة مئوية هوميفيد CO2 حاضنة ح 48.

6-التبني نقل الملح عالية معاملة CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc

  1. بعد التحفيز في المختبر ح 48، إزالة اللوحة من 37 درجة مئوية هوميفيد CO2 حاضنة.
  2. "الماصة؛" خلية ثقافة وسائل الإعلام ووصولا إلى ريسوسبيند CD11c+ DCs. ماصة CD11c جميع+ DC تعليق في المقابل يسمى أنبوب 1.6 مل. كرر هذه الخطوة لكل فرد مطلي بشكل جيد.
  3. الطرد المركزي كل CD11c+ DC تعليق في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح المادة طافية. ريسوسبيند بيليه DC مع 100 ميليلتر من دببس العقيمة.
  4. تعليق رسم DC في محقن 1 مل مزودة بإبرة ز 27 نصف بوصة.
  5. ضع السذاجة 10 أسبوع C57bl/6 الفئران الذكور تحت 2% إيسوفلوراني لتحقيق طائرة جراحية مستقرة. التحقق من مستوى التخدير مع عدم وجود دواسة العاكسة. حالما يتحقق طائرة جراحية مستقرة، ببطء وبعناية إدخال الإبرة في الفضاء المداري الرجعية بزاوية حوالي 30 °.
    ملاحظة: ينبغي أن يشير المجسم مشطوف الحواف ز 27 الإبرة إلى أسفل، بعيداً عن العين، للحيلولة دون تلف العين.
  6. حقن ببطء وسلاسة CD11c+ DC تعليق (حوالي 1 × 106 خلايا). بمجرد اكتمال الحقن، بعناية إزالة الإبرة للفضاء المداري الرجعية يجري واعية عدم الأضرار العين.
    ملاحظة: بعد الحقن، ينبغي أن يكون النزيف قليلاً أو لا. نقل التبني من CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc يمكن أن يؤديها أيضا استخدام أسلوب رابعا الحقن (مثل الوريد الذيل). تلقي الفئران التحكم CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc التي تم مثقف في وسائل الإعلام الملح العادي.
  7. إزالة الفئران من مخروط الآنف ورصد لهم لمدة حوالي 30 دقيقة أثناء التعافي من التخدير.

7-إعداد يوم 14 جرعة منخفضة انجيوتنسين الثاني (140 نانوغرام/كغ/دقيقة)

  1. إعداد المخزن المؤقت الثاني انجيوتنسين بإضافة 500 ميكروليتر من 5 م كلوريد الصوديوم و 300 ميكروليتر من حمض الخليك. كمية كافية (QS) تصل إلى 30 مل من منزوع ح20.
  2. حل انجيوتنسين الثاني إلى 5 ملغ/مل الحل الأسهم مع المخزن المؤقت الثاني انجيوتنسين. تمييع انجيوتنسين الثاني حل الأسهم مع المخزن المؤقت الإضافي لتحقيق تركيز نهائي أن مينيبومب ناضح سيلقي انجيوتنسين الثاني في معدل 140 نانوغرام/كغ/دقيقة استناداً إلى وزن الجسم لكل الماوس.
    ملاحظة: الأساسية "انجيوتنسين الثاني" (ملغ) = (الماوس الوزن (ز) × 0.2 مغ/يوم x 14 يوما)/1,000
    أعد "انجيوتنسين الثاني" (ملغ) = (انجيوتنسين الأساسي الثاني x 260 ميليلتر)/المضخة معدل (0.25 ميكروليتر/ساعة)
    حجم المخزون الثاني انجيوتنسين (ميكروليتر) = استعداد انجيوتنسين الثاني/الأسهم التركيز (5 ملغ/مل) x 1,000
    تخفف من حجم (ميكروليتر) = 270-انجيوتنسين الثاني حجم المخزون
  3. إضافة تمييع انجيوتنسين الثاني حجم المخزون (انجيوتنسين الثاني العازلة) استناداً إلى الكميات المحسوبة في الخطوة 7، 2.
  4. تحت غطاء ثقافة خلية عقيمة، فتح مينيبومب ناضح.
  5. إضافة الحل الثاني انجيوتنسين المخفف وطرد أي هواء من المحاقن والإبر. أدخل الإبرة التي تم توفيرها في الجزء السفلي من مينيبومب ناضح وحقن ببطء الحل الثاني انجيوتنسين أثناء تراجعه ببطء وبعناية الإبرة من المثانة.
  6. إدراج رأس مينيبومب ناضح المثانة ناضح تماما، اهتماما لا للحصول على أي الهواء في المثانة.

8-غرس يوم 14 جرعة منخفضة انجيوتنسين الثاني ناضح مينيبومبس

  1. عشرة أيام بعد التبني نقل CD11c+ DCs، مكان الفئران في دائرة إيسوفلوراني لبدء التخدير وثم نقل الفئران لمخروط الآنف باستمرار تلقي isoflurane 2% تحقيق وصيانة طائرة جراحية مناسبة.
  2. إزالة الفراء على طول الجانب الظهرية من الرقبة مع لوس أنجليس كليبرز لإعداد موقع الجراحية. تنظيف منطقة حلق مع الإيثانول 70% تليها تدين 7.5 في المائة قبل بدء الجراحة.
  3. إنشاء شق صغير (حوالي 1.5 سم) في الجلد. إدراج هيموستاتس في شق لخلق جيب تحت الجلد لموضع مينيبومب ناضح.
  4. إدراج في مينيبومب في الجيب تحت الجلد. إغلاق الجرح بدبابيس جراحية 2-3 الجلد وتطبيق تطبيق آخر لتدين 7.5% على الجرح والمواد الغذائية الأساسية للوقاية من العدوى.
  5. مراقبة الفئران لمدة 30 – 60 دقيقة أثناء الاسترداد من التخدير قبل إعادتهم إلى اقفاصها.
    ملاحظة: الفئران بحاجة إلى أن يكون رصد بعد غرس مينيبومب ناضح تصل إلى 3 – 4 أيام.

9-عزل الطحال فئران المستفيدة لتحليل تدفق سيتوميتريك

  1. بعد 14 يوما تسريب الثاني انجيوتنسين جرعة منخفضة، عزل الطحال من الفئران تلقي الملح عالية في المختبر تعامل وحدات تحكم المجال Dc بنقل التبني. اتبع الخطوات المحددة المذكورة أعلاه (الخطوات 1 و 2).

10-السطحية تلطيخ

  1. نقل سبلينوسيتيس التي هي حراكه في برنامج تلفزيوني x 1 البوليستيرين أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح المادة طافية بعد الطرد المركزي. تغسل مرتين مع 1 مل من "المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش" والطرد المركزي (350 x ز, 8 دقيقة, 4 درجة مئوية).
    1. تقسيم سبلينوسيتيس نفس القدر إلى أنابيب مختلفة البوليستيرين نظام مراقبة الأصول الميدانية استناداً إلى العدد الألواح سيتوميتريك التدفق المطلوب.
  2. أداء "تلطيخ بقاء الخلية" حية/ميتة، غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني x 1 وأجهزة الطرد المركزي (350 x ز, 8 دقيقة, 4 درجة مئوية). ريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1 x وإضافة 1 ميليلتر الخلية-الصلاحية وصمة عار (انظر الجدول المواد). احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية (الثلاجة أو على الجليد) المشمولة في إحباط لحماية من الضوء.
  3. أثناء الحضانة من وصمة عار بقاء الخلية، إعداد كوكتيل أجسام مضادة لسطح الخلية تلطيخ في زيادة حجم المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش مناسبة.
  4. تغسل الخلايا مع 1 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش، أجهزة الطرد المركزي (350 x ز، 8 دقيقة، 4 درجة مئوية)، وريسوسبيند كل خلية بيليه مع 100 ميليلتر من جسم كوكتيل. احتضان محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: كل جسم التدفق الخلوي فريدة من نوعها، وأنها مفيدة للغاية والموصى بها لتحديد مقدار المثلى للأجسام المضادة اللازمة عن طريق إجراء منحنى معايرة جرعة لكل جسم معين.
  5. تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وريسوسبيند سبلينوسيتيس في مبلغ مناسب لأجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت لتحليل تدفق سيتوميتريك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمثل الشكل 1 تخطيطي الخطوات الموصوفة أعلاه. يتم فرز الطحال مورين معزولة عن CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc بالخلية المغناطيسية الفرز ومطلي في وسائل الإعلام الملح العادي (NS؛ 150 ميللي مول كلوريد الصوديوم) أو الوسائط الملح العالية (HS؛ ملمول 190 كلوريد الصوديوم) على 48 h. CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc ثم يتم نقل أدوبتيفيلي بالرجعية-المداري حقن الفئران المستفيدة من السذاجة. بعد عشرة أيام، يتم زرعها الفئران مع مينيبومبس ناضح لجرعة منخفضة انجيوتن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في البروتوكول الحالي، أننا قد تحسين إجراءات لعزل CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc من الطحال من الفئران وأدوبتيفيلي تحويلها إلى الحيوانات ساذجة لدراسة دور وحدات تحكم المجال Dc في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الملح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لعزل ونقل مجموعات فرعية الخلايا المناعية الأخرى بما في ذلك الضامة ووحيدات الخلايا المناعية التكيفية بما في ذلك الخلايا اللمفية تي وب أدوبتيفيلي. نحن الأمثل في عملية الهضم الطحال لتحقيق بقاء الخلية المناسبة والاستقرار من علامات التعبير السطحي DC. وعلاوة على ذلك، نحن الأمثل البروتوك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيد هذا العمل منح "جمعية القلب الأمريكية" POST290900 إلى N.R.B.، 17SDG33670829 L.X. و "المعاهد الوطنية للصحة" منح K01HL130497 لحزب العدالة والتنمية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
APC / Cy7 المضادة للفأر CD11cBiolegend117324
autoMACS تشغيل العازلة   ؛Miltenyi Biotec130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure  Miltenyi Biotec130-108-338
Collagenase DRoche11088866001
DNase IRoche10104159001
DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيومCorning21-031-CV
FcR كاشف حجبMiltenyi Biotec  130-092-575
FITC مضاد للفأر CD45Biolegend103108
GentleMACS C أنبوبMiltenyi Biotec130-096-334
جهاز فصل GentleMACSMiltenyi Biotec130-093-235بروتوكول الاستخدام: الطحال 04.01
طقم بقع الخلايا الميتة البنفسجي القابل للإصلاح LIVE / DEADInvitrogenL34964
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
QuadroMACs Seperator Miltenyi Biotec130-090-976
RPMI 1640 متوسط جيبكو11835-030

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
  2. Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).
  3. Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
  4. Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
  5. He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937(2013).
  6. Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
  7. Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
  8. Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
  9. Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
  10. Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
  11. Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
  12. Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
  13. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
  14. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
  15. McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
  16. Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
  17. Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
  18. Harrison, D. G., et al. Inflammation, immunity, and hypertension. Hypertension. 57, 132-140 (2011).
  19. Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
  20. Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD11c IsoLG

مقالات ذات صلة