نقدم هنا، بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية من الطحال مورين بفرز الخلايا المغناطيسية ونقل التبني اللاحقة في الفئران ساذجة. تم اختيار نموذج لتنشيط الخلايا الجذعية الملح عالية شرح إجراءات خطوة بخطوة لنقل التبني والتدفق الخلوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة والتبني نقل الملح عالية يعامل عرض مستضد الخلايا الجذعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يسهم في التهاب الزائدة المدخول الغذائي الملح وتلعب دوراً حيويا في تطوير ارتفاع ضغط الدم. وجدنا سابقا أن عرض مستضد الخلايا الجذعية (DCs) بمعنى مرتفعة الصوديوم خارج الخلية، مما يؤدي إلى تفعيل أوكسيديز نادف وتشكيل إيسوليفوجلاندين (إيسولج)-أدوكتس البروتين. هذه إيسولج البروتين adducts تتفاعل مع البروتينات المتمتعة بالحكم الذاتي، وتعزيز المناعة الذاتية مثل الدولة وارتفاع ضغط الدم. لدينا تطوير وتحسين أساليب الدولة للفنون لدراسة وظيفة DC في ارتفاع ضغط الدم. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل للعزلة، في معاملة المختبر مع الصوديوم مرتفعة، والتبني نقل مورين CD11c الطحال+ الخلايا في الفئران المستفيدة لدراسة دورها في ارتفاع ضغط الدم.
المقدمة
الملح الغذائية الزائدة عامل خطر رئيسي لارتفاع ضغط الدم. 1 , 2 "جمعية القلب الأمريكية" توصي كحد أقصى 2,300 مليغرام (ملغم) من تناول الصوديوم (Na+) في اليوم الواحد، ومع ذلك؛ أقل من 10% سكان الولايات المتحدة تلاحظ هذه التوصية. 3 , 4 تخفيضات متواضعة في المدخول نا+ انخفاض ضغط الدم، وتقليل حالات جديدة سنوياً من مرض القلب التاجي والسكتة الدماغية في الولايات المتحدة بنسبة 20%. 5 مشكلة رئيسية مع الزيادة في استهلاك الملح هو أن 50 في المائة من السكان ارتفاع ضغط الدم والمعارض الملح-حساسية، ويعرف بزيادة 10 مم زئبق في ضغط....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافقت جامعة فاندربيلت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام الإجراءات الموضحة هنا. يسكن الفئران ورعايتهم وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الصحافة الأكاديميات الوطنية. 2010 المنقحة).
1-عزل الطحال من الفئران
- إعداد 1640 RPMI: 10% FBS، 0.10 مم حبيس، بيروفات صوديوم 1 مم، 50 ميكرومتر β-mercaptoethanol والبنسلين/ستربتوميسين 1%.
- Euthanize 10 – 12 أسبوع-القديمة C57bl/6 ذكور الفئران باستنشاق أول أكسيد الكربون2 . رش الصدر والجانبين للماوس مع الإيثانول 70%. على الجانب الأيسر، بعناية فتح الجلد والتجويف الصفاقى لفضح الطحال.
- استخدام الملقط الصغيرة، حذر تحريك الأمعاء والكبد في الجانب الأيمن من الماو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويمثل الشكل 1 تخطيطي الخطوات الموصوفة أعلاه. يتم فرز الطحال مورين معزولة عن CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc بالخلية المغناطيسية الفرز ومطلي في وسائل الإعلام الملح العادي (NS؛ 150 ميللي مول كلوريد الصوديوم) أو الوسائط الملح العالية (HS؛ ملمول 190 كلوريد الصوديوم) على 48 h. CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc ثم يتم نقل أدوبتيفيلي بالرجعية-المداري حقن الفئران المستفيدة من السذاجة. بعد عشرة أيام، يتم زرعها الفئران مع مينيبومبس ناضح لجرعة منخفضة انجيوتن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في البروتوكول الحالي، أننا قد تحسين إجراءات لعزل CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc من الطحال من الفئران وأدوبتيفيلي تحويلها إلى الحيوانات ساذجة لدراسة دور وحدات تحكم المجال Dc في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الملح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لعزل ونقل مجموعات فرعية الخلايا المناعية الأخرى بما في ذلك الضامة ووحيدات الخلايا المناعية التكيفية بما في ذلك الخلايا اللمفية تي وب أدوبتيفيلي. نحن الأمثل في عملية الهضم الطحال لتحقيق بقاء الخلية المناسبة والاستقرار من علامات التعبير السطحي DC. وعلاوة على ذلك، نحن الأمثل البروتوك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
أيد هذا العمل منح "جمعية القلب الأمريكية" POST290900 إلى N.R.B.، 17SDG33670829 L.X. و "المعاهد الوطنية للصحة" منح K01HL130497 لحزب العدالة والتنمية
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| APC / Cy7 المضادة للفأر CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS تشغيل العازلة ؛ | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم | Corning | 21-031-CV | |
| FcR كاشف حجب | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC مضاد للفأر CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS C أنبوب | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| جهاز فصل GentleMACS | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | بروتوكول الاستخدام: الطحال 04.01 |
| طقم بقع الخلايا الميتة البنفسجي القابل للإصلاح LIVE / DEAD | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACs Seperator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 متوسط | جيبكو | 11835-030 |
المراجع
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).
- Lev-Ran, A., Porta, M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
