Method Article

إعداد نموذج للإعلام-قياس الطيف الكتلي المستندة البروتيوميات تحليل ميكروفيسيلس العين

DOI:

10.3791/59140

⸱

February 22nd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Medical Centre of the Johannes Gutenberg University Mainz

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيف البروتين من أسرة microvascular العين أمر حيوي لفهم متعمق للعديد من أمراض العين في البشر. وتوضح هذه الدراسة طريقة فعالة وسريعة وقوية لاستخراج البروتين وإعداد عينة من الأوعية الدموية الصغيرة التي توظف الشرايين الهدبية الخلفية قصيرة الخنزير كسفن النموذجي لتحليلات الجماهيري-قياس الطيف الكتلي المستندة البروتيوميات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام معزولة من الأوعية الدموية العين في المختبر فك الدولة الفيزيولوجية المرضية للعين باستخدام النهج التكنولوجية المتقدمة اتسع اتساعاً كبيرا فهمنا لبعض الأمراض. الطيف الكتلي (مللي ثانية)-برز البروتيوميات أساس كأداة قوية لكشف التغيرات في الآليات الجزيئية والبروتين مما يشير إلى مسارات في الأسرة بالأوعية الدموية في الصحة والمرض. نموذج إعداد الخطوات قبل تحاليل مرض التصلب العصبي المتعدد غير حاسمة للحصول على النتائج استنساخه وتوضيح متعمقة للبروتين المعقدة. هذا مهم خاصة لإعداد ميكروفيسيلس العين، حيث كمية العينة المتاحة لتحليلات محدودة في كثير من الأحيان وهكذا، يشكل تحديا لاستخراج البروتين المثلى. هذه المقالة تسعى لتوفير بروتوكولا فعالة وسريعة وقوية لإعداد عينة من مثالية خلف المقلة العين الأوعية الدموية سرير توظيف الشرايين الهدبية الخلفية قصيرة الخنزير. ويركز هذا الأسلوب على إجراءات استخراج البروتين من المادة طافية وبيليه من العينة بعد تجانس، عينة التنظيف باستخدام أجهزة الطرد المركزي عامل التصفية قبل تنقية التفريد والببتيد هلام أحادي البعد الخطوات للقياس الكمي خالية من التسمية في نظام MS تاين خطية فخ أيون-أوربيتراب اليكتروسبراي لوني سائل. على الرغم من أن هذا الأسلوب قد وضعت خصيصا لتحليلات البروتيوميات ميكروفيسيلس العين، كما قدمنا أدلة مقنعة على أن فإنه يمكن أيضا سهولة استخدام العينات الأخرى المستندة إلى الأنسجة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النهوض في الميدان البروتيوميات، أي تصاريح متكاملة وغير مسبوقة من السلطة جمع البيانات، وإلى حد كبير ثورة فهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء بعض ظروف المرض، وكذلك كما هو الحال في ما يعكس الدولة الفسيولوجية لخلية معينة السكان أو الأنسجة1،2،،من34. البروتيوميات أثبت أيضا أن تكون منبرا هاما في أبحاث العيون نظراً لحساسية وغير متحيزة تحليل العينات العين المختلفة التي تيسر تحديد علامات المرض المحتملة للتشخيص، والتشخيص في نهاية المطاف يدل على أناقة بالعديد من الدراسات في السنوات الأخيرة، بما في ذلك بعض من خاصتي1،5،6،،من78،،من910. ومع ذلك، غالباً ما يصعب الحصول على العينات البشرية لتحليل البروتين نظراً لأسباب أخلاقية، خاصة بالنظر إلى الحاجة إلى مواد مراقبة من الأشخاص الأصحاء للتحليلات المقارنة يمكن الاعتماد عليها. من ناحية أخرى، كما أنها تمثل تحديا للحصول على كمية كافية من عينات لتحليلات جماعية والمطيافيه الأمثل وموثوق بها. هذا أمر بالغ الأهمية لا سيما للمواد البيولوجية المحدودة الجماهيري مثل الأوعية الدموية الدقيقة للعين. واحد هذه الرئيسية خلف المقلة الأوعية الدموية التي تضطلع بدور محوري في تنظيم تدفق الدم العين هو شريان الهدبية الخلفية قصيرة (sPCA). قد يؤدي أي اضطراب أو الحالات الشاذة في هذا السرير الأوعية الدموية في الانعكاسات السريرية الشديدة، التي يمكن أن تؤدي إلى الآلية المرضية للعديد من الأمراض التي تهدد البصر مثل الزرق ونونارتيريتيك الأعصاب البصرية الدماغية الأمامية (NAION)11 , 12-ومع ذلك، هناك نقص الدراسات توضيح التغييرات البروتين في هذا السرير الشرياني بسبب العيوب المذكورة أعلاه. ولذلك، في السنوات الأخيرة، الخنازير البيت (مستأنسةالبري Sus لينيوس، 1758) برز كنموذج حيوان جيدة في أبحاث العيون نظراً لأوجه التشابه مورفولوجك والنشوء والتطور عالية بين البشر والخنازير13، ،من 1415. عينات العين الخنزير متاحة بسهولة، والأهم من ذلك، يتم تمثيل أكثر دقة للأنسجة البشرية.

ونظرا للدور الهام لهذه الأوعية الدموية في العين، فضلا عن ندرة منهجية تهتم لاستخراج البروتين الفعال والتحليلات من هذه ميكروفيسيلس، نحن تميزت سابقا البروتين sPCA الخنزيري الداخل باستخدام بروتوكول التي أسفرت عن تحديد هوية عدد كبير من البروتينات16. وبناء على هذه الدراسة، لدينا كذلك الأمثل ووصف متعمق منهجيتنا في هذا المقال، الذي يسمح تحليل البروتين من المبالغ الدقيقة للعينات باستخدام sPCA الخنزير كنموذج الأنسجة. أن كان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة وضع منهجية متوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد للأوعية الدموية العين وسائل محدودة، قدمنا أدلة تجريبية كبيرة أن وصف سير العمل يمكن أيضا تطبيقها على نطاق واسع لعينات مختلفة تستند إلى الأنسجة.

ومن المتوقع أن يقوم سير العمل هذا سوف تكون مفيدة لإعداد عالي الجودة المتوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد عينات من كميات صغيرة من المواد لإجراء تحاليل شاملة من البروتين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت جميع إجراءات تجريبية باستخدام العينات الحيوانية في الالتزام الصارم برابطة البحوث في الرؤية وبيان "طب العيون" (آرفو) "استخدام الحيوانات" في أوفثالميك وأبحاث الرؤية والمبادئ التوجيهية للمؤسسات. أجريت هذه الدراسة والموافقة على قسم لطب العيون، "جامعة ماينز المركز الطبي".

ملاحظة: وتم الحصول على عيون الخنزير جنبا إلى جنب مع العصب البصري والأنسجة اكستراوكولار طازجة من المسالخ المحلية فورا بعد الوفاة. عيون انوكليتيد ونقل إلى المختبر في الفوسفات المثلج مخزنة المالحة (PBS) واستخدامها على الفور. نظرة عامة التخطيطي لسير العمل المستخدمة كما هو مبين في الشكل 1.

1-الحلول

  1. إعداد كريبس-هينسيليت (كح) المخزن المؤقت، ووزن المواد الكيميائية التالية (27.68 غرام من كلوريد الصوديوم وز 8.4 ناكو3، 1.4 غرام من بوكل، ز 1.18 مجسو4و 0.64 ز خ2ص4) في أنبوب الطرد المركزي المخروطية نظيفة وجافة 50 مل واحد و ، ز 1.47 كاكل2 و g 8.0 الجلوكوز في أنبوب آخر.
    ملاحظة: يجب تخزين مسحوق خليط من هذه المواد الكيميائية في مكان بارد وجاف. أفضل مستعدة كاكل2 والجلوكوز المخلوط مسحوق طازجة لمنع امتصاص الرطوبة والتثاقل.
  2. لإعداد مجموعة 200 ميليلتر لاستخراج 2A المخزن المؤقت كل عينة بيليه، مزيج 100 ميليلتر من استخراج المخزن المؤقت 2 و 100 ميليلتر من كاشف أ من استخراج البروتين ترانسميمبراني (انظر B6 في الجدول للمواد).
    ملاحظة: الكوة لمكونات الطقم استخراج البروتين transmembrane تتألف من المخزن المؤقت لاستخراج 2، كاشف أ ومثبط البروتياز كوكتيل في أجزاء العمل ومخزن في-20 درجة مئوية لفترات طويلة الاستخدام. تجنب تكرار التجميد وذوبان الجليد. ذوبان الجليد الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل بدء هذا الإجراء استخراج بيليه.
  3. لإعداد حل بيكربونات الأمونيوم (أي بي سي، 100 ملم)، حل ز 0.39 من ABC في 50 مل مياه.
  4. لإعداد 10 ملم 1، 4-ديثيوثريتول (DTT) الحل، حل 30 ملغ DTT في 20 مل من 100 مم أي بي سي.
  5. إعداد 55 مم إيودواسيتاميدي (IAA) الحل، حل 200 مغ الأكاديمية في 20 مل من 100 مم أي بي سي.
    ملاحظة: الأكاديمية الدولية يجب أن تبقى في الظلام. استخدام رقائق ألومنيوم التفاف الأنابيب مع حلول حساسة للضوء.
  6. إعداد المخزن المؤقت التربسين التي تحتوي على ABC 10 ملم و 10% (المجلد/المجلد) الاسيتو الانيتريل (ACN). إضافة 1.5 مل من المخزن المؤقت التربسين في قنينة واحدة من 20 ميكروغرام من التربسين حل محتواه لإعداد حل عامل التربسين 13 نانوغرام/ميليلتر.
    ملاحظة: تسلسل الرتب تعديل التربسين تم توفيره المجففة بالتبريد ويجب أن تكون مخزنة في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  7. إعداد المخزن المؤقت لاستخراج الببتيد، مزيج من 1:2 (v/v) من حمض الفورميك 5% مع تزاول.
    ملاحظة: إعداد كافة الحلول في خطوات 1.3-1.7 الطازجة فقط قبل الاستخدام وتجاهل أي وحدة التخزين غير المستخدمة.
  8. لتحضير حامض trifluoroacetic 0.1% (تفا)، مزيج 10 ميليلتر من تفا مع 10 مل مياه.

2-عزل شرايين الهدبية الخلفية قصيرة

ملاحظة: العين الخنزير ينقسم أساسا إلى الأمامي (الشكل 2أ) والأبواب الخلفية (الشكل 2ب).

  1. مكان العالم العين في غرفة تشريح الذي يحتوي على المخزن المؤقت ك ح المثلج. بعناية قطع بعيداً الأنسجة والعضلات المحيطة بها مع زوج من مقص حاد في مايو كلينيك.
  2. شق مع مشرط وقطع الكرة الأرضية على طول الطائرة الاستوائية مع زوج من مقص حاد في مايو كلينيك حتى يتم فصل العين في النصفين الأمامي والخلفي. إزالة الجسم الزجاجي كثير ممكن من النصف الخلفي للعين باستخدام زوج من الملقط نمط موحد.
    ملاحظة: ويسهل فصل العين الكرة الأرضية إلى نصفين عزلة sPCA بسهولة دون أن عين تتحرك في طبق التشريح. بيد أن هذه الخطوة ليست إلزامية. يمكن أيضا أن السفن منعزلة دون فتح العالم العين.
  3. استخدام دبابيس التشريح بعناية من طرف أسفل الجزء الخلفي من العين مع الجانب شبكية العين إلى أسفل والعصب البصري مواجهة نحو المجرب.
  4. قطع بلطف بعيداً الأنسجة الضامة المحيطة بالعصب البصري لفضح المفرج خلف المقلة الأساسية مع زوج من مقص الربيع "فانس الطالب".
  5. ويمكن اعتبار sPCA فروع قصيرة من السفن (بين 5-8 فروع) التي تخترق الصلبة العينية وتحيط circumferentially رأس العصب البصري (الشكل 2-ج). عزل باراوبتيك و sPCA القاصي جنبا إلى جنب مع الأنسجة الضامة المحيطة مع زوج من ملاقط الدقة 5 نوع ومقص كابسولوتومي فاناس (الشكل 2د).
    ملاحظة: ضمان بقاء المخزن المؤقت ك ح المثلج طوال إجراءات العزل. ينصح بتغيير المخزن المؤقت كل 20-30 دقيقة، اعتماداً على درجة الحرارة المحيطة.

3-نموذج إعداد

  1. بلطف إزالة الأنسجة الضامة من شرائح الشرياني باستخدام الملقط الدقة نوع إضافية ذات الرؤوس غرامة 5 ومقص كابسولوتومي فانس تحت ستيريوميكروسكوبي وشطف الشرايين معزولة في برنامج تلفزيوني المثلج إزالة الملوثات والمخلفات في الدم.
    ملاحظة: إذا لا تخضع العينات إلى الخطوات التالية فورا، الأداة الإضافية-تجميد لهم في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  2. تجمع الشرايين من عيون اثنين الحصول على واحد من تكرار البيولوجية وتحويلها إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب ووزن العينات باستخدام رصيد التحليلي.
  3. لكل أنبوبة، إضافة خليط حبات أكسيد الزركونيوم 0.5 و 1.0 مم، تليها كاشف استخراج البروتين الأنسجة (T-الواحدة؛ انظر B7 في الجدول للمواد).
    ملاحظة: حجم تي-الواحدة وهي تعتمد على وزن العينات في كل أنبوب، مع نسبة 1 مل من كاشف 50 ملغ من العينة. قاعدة عامة من الإبهام لاتباعها عند تحميل أنابيب للتجانس نسبة حجم 1:1:2 = عينة: الخرز: تي-كل (الشكل 3أ). لا تستخدم كبير جداً بحجم المخزن المؤقت الاستخراج ومبلغ ضئيل جداً من الخرز لمنع تجانس غير فعالة.
  4. تحميل أنابيب عينة في الخالطون خلاط (انظر دال/6 في الجدول للمواد). تعيين جهاز ضبط الوقت إلى مستوى 2 دقيقة وسرعة 6، والبدء في تحقيق التجانس. بعد تشغيل، تجانس العينات للتجانس الكامل وتكرار دورة حتى العينات بشكل كامل الاختيار (الشكل 3ب).
    ملاحظة: يمكن تجانس ما مجموعة 24 عينة أنابيب في تشغيل واحد. من المهم أن تبقى العينات الباردة أثناء إجراء التجانس للتقليل من تمسخ البروتين. الخالطون خلاط الرصاصة المستخدمة في هذه الدراسة على ميزة تبريد متأصلة التي تحافظ العينات الباردة. في الحالات التي يكون فيها لا ميزة التبريد الداخلية المتوفرة في الخالطون، يمكن الاحتفاظ بعينات على الجليد بين كل تشغيل.
  5. بدقة "الماصة؛" هوموجيناتي في أنابيب ميكروسينتريفوجي الطازجة. الطرد المركزي عينات 10,000 ز x لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه البروتينات غير قابلة للذوبان والمادة طافية منفصلة تحتوي على بروتينات قابلة للذوبان. بدقة "الماصة؛" من المادة طافية في أنابيب ميكروسينتريفوجي جديدة دون لمس الطبقة بيليه (الشكل 3ج).
    ملاحظة: ويمكن تخزين المادة طافية وبيليه في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

4-بيليه الهضم

  1. إضافة 200 ميليلتر لاستخراج المخزن المؤقت 2 ألف و 5 ميليلتر من مثبطات البروتياز كوكتيل لكل عينة بيليه. تعليق بيليه عدة مرات مع ماصة.
    ملاحظة: مزيج من الكواشف استخراج جيدا قبل إضافة إلى بيليه. تبقى 2A المخزن المؤقت الاستخراج على الجليد ومثبط البروتياز في الرايت طوال فترة الإجراءات استخراج.
  2. استخدام الخالطون الموجات فوق الصوتية لمجانسة بيليه تماما.
    1. تعيين السعة إلى 60 ودورة إلى 1. استخدام مجس مصنوعة من التيتانيوم (Ø 0.5 مم، طويل 80 مم)، الذي مناسبة لتجانس العينات بكميات صغيرة (10-500 ميليلتر).
    2. تزج المسبار في خليط المخزن المؤقت بيليه، واستخراج واضغط على زر ابدأ لتعريض العينة للموجات فوق الصوتية.
    3. Sonicate العينة حتى يتم تجانس كتل بيليه تماما. إيقاف مؤقت لبضع ثوان بين كل سونيكاتيون.
    4. إكمال التحقق من تجانس بصريا. مزيج من هوموجيناتي عدة مرات مع ماصة لضمان عدم وجود لا كتل.
      ملاحظة: ينبغي أن تنفذ إجراءات استخراج بيليه على الجليد لمنع تمسخ البروتين بسبب الحرارة المتولدة أثناء التجانس (الشكل 4).

5-أخذ عينة من التنظيف والمخزن المؤقت Exchange

  1. استخدام أجهزة الطرد المركزي تصفية مع كاتشين 3 قطع (انظر D3 في الجدول للمواد) لهذا الإجراء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مع بعض التعديلات حسب الاقتضاء. أولاً، إدراج وحدة التصفية في أنبوب ميكروسينتريفوجي (المتوفرة في حزمة التصفية).
  2. "الماصة؛" 200 ميكروليتر من عينة هوموجيناتي إلى جهاز عامل تصفية واحد وإضافة 200 ميليلتر من المياه إلى عامل التصفية نفسه. بشكل أمن في آب (الشكل 5ألف).
  3. ضع وحدة التصفية إلى أجهزة الطرد المركزي وتدور على 14,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. إزالة الجهاز من أجهزة الطرد المركزي وفصل وحدة التصفية التي تحتوي على تركيز العينة من أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على فيلتراتي. تجاهل فيلتراتي (الشكل 5ب).
  5. إعادة تشكيل الركاز بإضافة 400 ميليلتر من المياه إلى وحدة التصفية. كرر الخطوات من 5.3 و 5.4 ثلاث مرات. بدقة "الماصة؛" تركيز العينة 'تنظيف' إلى microtube نظيفة.
    ملاحظة: عادة، سوف تسفر عن عينة النفط خام 200 ميليلتر ~ 50-70 ميليلتر تركيز بعد الترشيح.
  6. كرر الخطوات 5، 1-5، 5 هوموجيناتيس العينة المتبقية.

6-البروتين القياس

  1. استخدام مقايسة البروتين (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك كيت (انظر B5 في الجدول للمواد) لتحديد تركيزات البروتين من كسور نماذج sPCA المادة طافية وبيليه على قارئ لوحة.
  2. إعداد تخفيف الزلال (BSA) القياسية (جيش صرب البوسنة النهائي تركيزات تتراوح بين 25 إلى 2,000 ميكروغرام/ملليلتر) من امبول 1 مل واحد يتألف من 2 مغ/مل جيش صرب البوسنة، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  3. "الماصة؛" 10 ميليلتر لتمييع القياسية كل جيش صرب البوسنة وعينه يتطابق (المادة طافية وبيليه) إلى كل من الميكروسكوبية 96-جيدا مسطحة القاع جيدا.
  4. إعداد اتفاق التعاون الأساسي يعمل كاشف عن طريق إضافة أجزاء 50 من "اتفاق التعاون الأساسي الكاشف" A إلى الجزء 1 من "اتفاق التعاون الأساسي كاشف باء"
    ملاحظة: حساب الحجم الإجمالي للكاشف العامل المطلوب لكل قياس قبل الإعداد وإعداد حجم كاف على أساس عدد العينات وتخفيف الموحدة يكون جزيئي طازجة.
  5. بدقة "الماصة؛" 200 ميليلتر من اتفاق التعاون الأساسي يعمل الكاشف في كل بئر. تغطية ميكروسكوبية واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد تبريد اللوحة إلى RT، قياس امتصاص في 562 نانومتر على قارئ لوحة (انظر D13 في الجدول للمواد).
  6. استناداً إلى منحنى القياسية التي تم إنشاؤها لكل تركيز جيش صرب البوسنة الموحدة (ميكروغرام/مل)، تحديد تركيزات بروتين العينات.

7-أحادي البعد هلام استشراد (1DE)

  1. إعداد العينات ل 1DE كما هو مبين في الجدول 1 (لنموذج واحد). مزيج الخليط العينة جيدا مع ماصة. الحرارة العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وباردة إلى الرايت
  2. إعداد 1 × تشغيل المخزن المؤقت عن طريق إضافة 50 مل من "مس الحزب الديمقراطي الصربي تشغيل المخزن المؤقت" إلى منزوع 950 مل من الماء. مزيج جيد.
  3. إعداد الخرسانة الجاهزة 4-12% مكررا-تريس البروتين الجل (انظر B4 في الجدول للمواد).
    1. قص فتح الحقيبة البلاستيكية إزالة كاسيت جل وشطف الكاسيت مع المياه.
    2. إزالة المشط من كاسيت جل في حركة السوائل واحدة، مع الحرص على عدم الأضرار الآبار.
    3. شطف الآبار تحميل 2-3 مرات مع 1 × تشغيل المخزن المؤقت باستخدام ماصة لطف. عكس وهزه بلطف في الكاسيت جل لإزالة المخزن المؤقت، والتأكد من أن هناك لا فقاعات الهواء في الآبار.
    4. قم بإزالة الشريط الأبيض في الجزء السفلي من أشرطة الكاسيت هلام.
  4. إدراج المواد الهلامية (أشرطة الكاسيت اثنين كحد أقصى) في جل تشغيل الدبابات ومجرد تجميع تماما، قفل هلام الاسفين التوتر.
  5. تعبئة المخزن المؤقت العلوي (الكاثود) الدائرة مع 200 مل من "المخزن المؤقت قيد التشغيل" حتى يتم تغطية الآبار تماما. التحقق من وجود أي تسرب.
  6. إضافة 500 ميليلتر من مضادات الأكسدة (انظر A14 في الجدول للمواد) إلى "المخزن المؤقت قيد التشغيل".
    ملاحظة: مضادات الأكسدة هي كاشف ملاءمة التي يجب أن تستخدم مع عينات خفضت مع الفلزي (انظر الجدول 1) للحفاظ على شروط الحد أثناء التفريد ومنع إعادة-أكسدة الأحماض الأمينية الحساسة مثل التربتوفان و الميثيونين.
  7. تحميل 50 ميكروغرام للعينة الواحدة وحارة باستخدام ماصة عناية. ثم تحميل القياسية البروتين ملطخة مسبقاً كعلامة كتلة جزيئية (انظر A18 في الجدول للمواد).
  8. ملء المخزن المؤقت (اﻷنود) مجلس النواب مع 600 مل من "تشغيل المخزن المؤقت".
  9. تشغيل المواد الهلامية ل ~ 60 دقيقة في جهد مستمر من 175 الخامس. في نهاية الشوط، بعناية إزالة الجل من لوحة كاسيت باستخدام سكين هلام.
  10. نقل المواد الهلامية بعناية في جل تلطيخ مربع.
    1. إعداد الحل تحديد جديدة استناداً إلى العدد الإجمالي للمواد الهلامية التي تحتاج إلى أن تكون الملون، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة كما هو موضح في الجدول 2.
    2. هزة في gel(s) في الحل تحديد لمدة 10 دقائق في الرايت على منصة هزاز.
  11. تجاهل تحديد الحل ووصمة عار الجل مع "الأزرق الغروية" تلطيخ كيت.
    1. إعداد المصبوغة الطازجة الحلول استناداً إلى العدد الإجمالي للمواد الهلامية التي تحتاج إلى أن تكون الملون، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة كما هو موضح في الجدول 3.
    2. أولاً، قياس حجم مناسب وخلط المكونات علامة نجمية (*) في جل تلطيخ مربع مباشرة. هزة في gel(s) في الحل المصبوغة دون "الملطخ ب" لمدة 10 دقائق في الرايت على منصة هزاز.
    3. إضافة "ب الملطخ" مباشرة في مربع المصبوغة التي تتضمن * تلطيخ الحل. تأكد من أن يهز الملطخ ب جيدا قبل استخدامها.
      تنبيه: القيام بخطوات إعداد 7.10.1 و 7.11.1 تحت غطاء دخان.
  12. هزة في gel(s) في الحل المصبوغة بين عشية وضحاها للحصول على أفضل النتائج الإجمالية.
    ملاحظة: سوف تصبح العصابات ملطخة مرئية داخل 10 دقيقة بعد إضافة "الملطخ ب تلطيخ" يتطلب حدا أدنى ح 3 ولا تختلف الشدة إذا ما تركت لساعات أطول في الحل المصبوغة.
  13. صب الحل المصبوغة واستبدال مع 200 مل مياه بعناية. هزة gel(s) لمالا يقل عن 7-8 ح في الماء لمسح الخلفية.
    ملاحظة: يجب تغيير المياه عدة مرات أثناء إجراء ديستينينج لأفضل إزالة وصمة عار المفرط. كما يمكن ترك في gel(s) في المياه لمدة 3 أيام دون المساس بكثافة الفرقة البروتين. إذا كان gel(s) لا تخضع إلى الخطوات التالية فورا، يمكن تخزينه في محلول كبريتات الأمونيوم 20% عند 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

8-في جل تريبتيك الهضم

ملاحظة: هذا البروتوكول وفقا للأسلوب شيفتشينكو et al.17، مع تعديلات طفيفة. ينبغي أن يتم هذا الإجراء في تدفق الصفحي هود واستخدام مجموعة مخصصة من الماصات، ونصائح، وأنابيب، والأواني الزجاجية خصيصا لهذا الغرض. ارتداء قفازات وملابس مناسبة مختبر في جميع الأوقات لمنع الكيراتين والتلوث الأخرى. إعداد جميع الحلول والكواشف المستخدمة في هذا الإجراء قبل وقت قصير من استخدام.

  1. المكوس نطاقات البروتين من الجل مع شفرات مبضع نظيفة وجديدة. قطع الفرقة إلى قطع صغيرة (حوالي 1 مم × 1 مم إلى 2 مم × 2 مم). نقل القطع جل بعناية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب.
    ملاحظة: قطعة صغيرة جداً يمكن أن تسد نصائح ماصة والقطع الكبيرة سوف يقلل الانتعاش الببتيد. توخي الحذر عند استخدام شفرات مبضع، وحادة جداً.
  2. ديستينينج
    1. إضافة 500 ميكروليتر من محلول ديستينينج يحتوي على 100 مم أي بي سي حل/تزاول (1:1، v/v)، واحتضان عينات RT لمدة 30 دقيقة مع الهز عرضية أو فورتيكسينج.
    2. ماصة بعناية حل ديستينينج. تحقق من وجود بصريا أي أنابيب مع وصمة عار المتبقية. كرر الخطوة 8.2.1 إذا قطع جل ما زالت ملطخة الأزرق.
  3. الحد والالكله
    1. إضافة ~ 400 ميليلتر من الطازجة DTT الحل واحتضان في 56 درجة مئوية للتأكد من أن الحل الذي يغطي تماما قطع جل 30 دقيقة. "الماصة؛" حل الحد وتجاهل بعناية.
    2. إضافة ~ 400 ميليلتر الطازجة إلى حل الأكاديمية واحتضان في الظلام على RT للحد الأدنى 30 إزالة الكيلاتينج المخزن المؤقت مع ماصة وتجاهل.
  4. الهضم
    1. إضافة 500 ميليلتر من تزاول أنيق في RT لمدة 10-15 دقيقة حتى القطع جل تتقلص وتصبح معتمة. "الماصة؛" بها تزاول وأيردري هلام القطع لمدة 5-10 دقيقة تحت غطاء محرك السيارة.
    2. "الماصة؛" 50 ميليلتر من حل التربسين في كل أنبوب تغطي كامل القطع هلام. احتضان هذه الأنابيب في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. بعد 30 دقيقة، تحقق كل أنبوبة إذا كان قد تم استيعاب جميع التربسين الحل بالقطع هلام. إضافة حجم المخزن المؤقت التربسين (50-100 ميليلتر، تبعاً للحجم في الأنبوب) كافية تغطي كامل القطع هلام، إذا لزم الأمر. احتضان هذه العينات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  5. استخراج الببتيد
    1. بدقة "الماصة؛" الحل الببتيد المستخرجة من أنابيب ونقل لتنظيف microtubes. تجف المادة طافية في مبخر فراغ الطرد مركزي.
      ملاحظة: عدم تجاهل جل القطع المتبقية.
    2. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستخراج (راجع الخطوة 1، 7) لكل أنبوب واحتضان مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
    3. "الماصة؛" المادة طافية في microtubes نفسه الذي يحتوي على الببتيدات المستخرجة وفقا للشرائط الخاصة بكل منها والجافة إلى أسفل في فراغ للطرد مركزي.
      ملاحظة: إذا لم تستخدم مباشرة، يمكن تخزين مقتطفات الببتيد المجففة في-20 درجة مئوية تصل إلى عدة أشهر حتى استخدامها مرة أخرى.

9-الببتيد تنقية

ملاحظة: هذا الببتيد عينة الملحي وتنقية الإجراءات تتم باستخدام تلميحات ماصة18 ج (انظر C15 في الجدول للمواد). استخدام تلميح جديد لكل عينة.

  1. إعداد الطازجة الحلول التالية في أنابيب الطرد المركزي المخروطية وقاسمه في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل للإجراء تنقية الببتيد، كما هو مبين في الجدول 4. موجز للأنابيب لتنقية الببتيد كما يلي: أنبوب (حل نموذج)، الأنبوب ب (المحلول المرطب)، أنبوب ج (الحل الموازنة)، مد أنبوب (محلول الغسيل)، أنبوب ه (محلول شطف)، و أنبوب (فارغة 2 مل أو 5 مل ميكروسينتريفوجي أنبوب، اعتماداً على عدد العينات تنظيفها، للتخلص من النفايات)، و "أنبوب ز" (microtube نظيفة وفارغة، قدرة 0.2 مل).
  2. إعادة تشكيل ببتيد المجففة مقتطفات من الخطوة 8.6.3 مع 10 ميليلتر من 0.1% تفا. يتم تعيين هذا الأنبوب أنبوب ألف
  3. Sonicate الأنابيب A في حمام الموجات فوق الصوتية مع الجليد لمدة 5 دقائق.
  4. تدور أسفل الحل عينة في benchtop أجهزة الطرد مركزي في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
  5. مجموعة من ميكروبيبيتي P10 لتحديد الحد الأقصى لحجم 10 ميليلتر وإرفاق تلميح ماصة18 ج بشكل أمن.
  6. تزج طرف الماصة في المحلول المرطب (الأنبوب ب) ونضح بعناية في مواد التعبئة. ببطء الاستغناء عن النفايات في "أنبوب ف. كرر" هذه الخطوة 7-8 مرات على الأقل.
    ملاحظة: خفض المكبس ماصة لحد ميت والإفراج ببطء أو الاستغناء عن الغطاس طوال فترة الإجراءات. اتخاذ الاحتياطات اللازمة لعدم إدخال فقاعات الهواء إلى النصائح أثناء بيبيتينج لضمان ربط الحد الأقصى الببتيد إلى عمود C18.
  7. حجته في التلميح لربط الببتيد يسفط 10 ميليلتر الموازنة الحل في أنبوب جيم تجاهل الحل وكرر هذا الإجراء من 3 إلى 4 مرات.
  8. المقبل، ونضح والاستغناء عن الحل العينة في أنبوب A عدة مرات (حسب سمك الفرقة جل المقابلة) لربط الببتيدات نصيحة العمود.
    تنبيه: وتنفذ بالطموح والاستغناء عن الخطوات أثناء إجراء ملزم (الخطوة 9.8) داخل أنبوب ألف عدم الاستغناء عن الحل عينة للنفايات.
  9. يغسل طرف ماصة18 ج يسفط الحل الغسيل في "مد الأنبوب" والتخلص من النفايات (و أنبوب) 4 إلى 5 مرات.
  10. وأخيراً، الوت الببتيدات منضم بيبيتينج الحل شطف (أنبوب ه) والاستغناء عن الوانت في أنبوب غ.
  11. كرر الخطوات كاملة 2 إلى 3 دورات لكل عينة لزيادة استعادة عينة.
  12. تجاهل هذه المعلومة بعد تنقية عينة واحدة واستخدام تلميح جديد للعينة التالي.
  13. جاف الواتيس الببتيد المنقاة في مركز فراغ.
    ملاحظة: العينات النقية جاهزة الآن لتحليلات LC-MS/MS في نظام MS LC-ESI-لتق-أوربيتراب. تخزين العينات المجففة في-20 درجة مئوية إلى استخدامها مرة أخرى.

10. السائل اللوني-اليكتروسبراي "تحليلات" التأين-MS/MS

ملاحظة: يتم إجراء التحليل البروتيوميات خالية من تسمية الكمية على نظام MS تاين خطية فخ أيون-أوربيتراب (LC-ESI-لتق-أوربيتراب) اليكتروسبراي لوني سائل. قانون العمل تتكون من مضخة اليجرو روس رباعي مجهزة ديجاسير على شبكة إنترنت (بالإضافة إلى أوتوسامبلير بال HTS، ويشمل النظام 30 مم × 0.5 مم ج18 قبل عمود متصل بعمود18 150 مم × 0.5 مم ج. استخدام عكس المرحلة ألف المذيبات المائية تتكون من LC-MS الصف المياه مع حمض الفورميك 0.1% (v/v) وب المذيبات العضوية تتألف من LC-MS الصف الاسيتو الانيتريل مع حمض الفورميك 0.1% (v/v). استخدام التدرج مع وقت تشغيل من 60 دقيقة لكل الفرقة هلام، كما هو موضح بالتفصيل في موقعنا6،الدراسات السابقة16.

  1. حل العينات النقية الببتيد في 10 ميليلتر من 0.1% تفا. Sonicate العينات على الجليد لمدة 5 دقائق.
  2. "الماصة؛" 10 ميليلتر عينات في لوحة 96 الخامس-أسفل بئر وختم مع فيلم تغطية واضحة وذاتية اللصق.
  3. نقل اللوحة إلى أوتوسامبلير.
  4. استخدام التدرج التالي لكل وقت تشغيل 60 دقيقة: 0-35 دقيقة (15-40 ٪ مذيب ب) 35-40 دقيقة (المذيب ب من 40-60 في المائة)، 40-45 دقيقة (60-90 ٪ مذيب ب)، 45-50 دقيقة (المذيبات 90% ب)، 50-53 دقيقة (90-10 ٪ مذيب ب) و 53-60 دقيقة (10 ٪ مذيب ب).
  5. استخدام الشروط التالية كتلة والمطيافيه الصك: أيون إيجابية اليكتروسبراي التأين الوضع، الجهد رذاذ (2.15 كيلو فولت)، الشعرية درجة الحرارة (220 درجة مئوية)، اقتناء البيانات تعتمد على الوضع، واقتناء التلقائي التبديل بين أوربيتراب--مرض التصلب العصبي المتعدد و لتق MS/MS، القرار أوربيتراب (30,000)، ومجموعة m/z (300 إلى 1,600)، تلقائي الهدف السيطرة (AGC، 1.0 × 106 أيونات)، تقويم داخلية (بوليديميثليسيكلوسيلوكساني [PCM] في الأيونات m/z 445.120025 في الوقت الحقيقي)، وتأمين أسلحة الخيار تمكين في وضع مرض التصلب العصبي المتعدد، جنبا إلى جنب البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق تحديد الخمسة الأوائل الأكثر كثافة الأيونات السلائف وكذلك تجزئة بالتفكك الناجمة عن تصادم (CID)، طبعت الاصطدام الطاقة (الامتحانات التنافسية الوطنية، 35% مع وقت التنشيط من 30 مللي ثانية مع عدد مرات التكرار من 3)، ومدة الإقصاء الحيوي (600 s).
    ملاحظة: الأيونات المجزأة الناتجة مسجلة في لتق.
  6. يعيد التشغيل البيولوجية ثلاثة على الأقل لكل عينة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توافر عينة محدودة واحدة من العقبات الرئيسية في أبحاث العيون. وفي المقابل، تعطي أساليب الاستخراج للبروتين المثلى من كميات صغيرة من عينات مثل الأوعية الدموية العين غالباً ما تكون قابلة للنقاش. وحتى الآن، هناك ندرة في أساليب خاصة لاستخراج البروتين من الأوعية الدموية خلف المقلة. ولذلك، كخطوة أولى في الأسلوب الأمثل وإثبات مبدأ لمقارنة فعالية ومتانة من عدة عادة تستخدم المنظفات استخراج البروتين إلى كاشف جديد نسبيا، تي-الواحد، قمنا بتنفيذ دراسة تجريبية باستخدام أنسجة القلب من الفئران (بسبب توافر ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنميط البروتين شاملة لمجموعة متنوعة من عينات العين خطوة أولى هامة ولا غنى عنها لتوضيح الآليات الجزيئية ومسارات مما يشير إلى تورط في الصحة والمرض. من أجل الحصول على بيانات عالية الجودة، وضمان إمكانية تكرار نتائج للنتائج التي تم الحصول عليها من هذه التحليلات، خطوات إعداد العينة السابقة بالغة الأهمية، كما هو مبين في استعراض قبل Mandal et al. أن مناقشة متعمقة إجراءات تجهيز العينة لأجزاء مختلفة من العين توظيف جل ثنائي الأبعاد التفريد ووسائل قياس الطيف الكتلي الاستراتيجية1. في خط هذه التحقيقات، يوفر د...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم الدكتور مانيكام "الداخلية جامعة أبحاث التمويل" (1 ستوف) من "المركز الطبي الجامعي" في "يوهانس جوتنبرج جامعة ماينز" ومنحة من الأوقيانوغرافية ألماني (MA 8006/1-1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>أ. كيماويات
1, 4-ديثيوثريتول (DTT)سيجما-ألدريتش1.11474
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl2)   كارل روث 5239.12.5 mM 
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (PBS)   ؛حمض الفورميك 14190169
(CH2< / sub>O2< / sub>)AppliChemA0748
أسيتونيتريل من الدرجة HPLC (ACN ، C2< / sub>H3< / sub>N)AppliChemA1605
الميثانول من الدرجة HPLC (CH3< / sub>OH) فيشرالعلميM / 4056/17
HPLC-grade المياه AppliChemA1589
يودوأسيتاميد (IAA)سيجما ألدريتشI6125
كلوريد الكاليوم (KCl)   ؛  كارل روث 6781.14.7 mM 
فوسفات ثنائي هيدروجين الكاليوم (KH2PO4)  كارل روث 3904.21.2 mM 
LC-MS-الصف حمض الخليك  كارل روث AE69.1
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)     كارل روث 261.21.2 mM 
NuPAGE مضاد للأكسدةثيرمو فيشر العلمي (Invitrogen)NP0005
NuPAGE LDS عينة عازلة   ؛ثيرمو فيشر العلمي (Invitrogen)NP00074x
NuPAGE MES SDS تشغيل العازلة  ثيرمو فيشر العلمي (Invitrogen)NP000220x
عامل اختزال عينة NuPAGE ثيرمو فيشر Scientific (Invitrogen)NP000410x
SeeBlue Plus2 معيار البروتين الملون مسبقا  ثيرمو فيشر Scientific (Invitrogen)LC5925
تسلسل درجة التربسين المعدلةPromegaV5111
كلوريد الصوديوم (NaCl)  كارل روث 9265.2118.3 mM 
كربونات هيدروجين الصوديوم (NaHCO3)  كارل روث 965.325 ملي متر 
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA,  C2HF3O2)Merck Millipore108178
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate  كارل روث 6780.111 mM 
<قوي>B. الكواشف والأطقم < / قوية >
0.5 مم حبات أكسيد الزركونيوم   ؛Next AdvanceZROB05
1.0 مم حبات أكسيد الزركونيوم  Next AdvanceZROB10
تلطيخ أزرق غروي  كيتثيرمو فيشر Scientific (Invitrogen)LC6025لتلطيخ 25 مادة هلامية صغيرة لكل مجموعة
NuPAGE 4-12٪ Bis-Tri gelsThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0321BOX1.0 مم ، 10 آبار
بيرس حمض البيسينشونينيك (BCA) مجموعة فحص البروتين  من Thermo FisherScientific 23227
ProteoExtract ، TM-PEKMerck Millipore71772-320 تفاعلا لكل مجموعة
كاشف استخراج بروتين الأنسجة (T-PER)Thermo Scientific78510
C. أدوات< / قوية>
96-well ألواح قاع على شكل حرف VGreiner Bio-One651180
لوحات Corning 96-well المسطحةالقاع Sigma-AldrichCLS3595-50EA
شفرات ميكروتوم يمكن التخلصمنها pfmمشارط 207500014
الطبية القابل للتصرف # 21pfm
 Carl RothPK47.1
مقص بون فائق الصغر  أدوات العلوم الدقيقة14084-08
أنابيب الطرد المركزي المخروطية Falcon (50 مل)مقص فيشر Scientific14-432-22
Mayo ، Tough Cut  ؛ أدوات العلومالدقيقة 14130-17
ملاقط دقيقة  أدوات العلوم الدقيقة11251-10ملاقط دقيقة من النوع 5
، مستقيمة مع أطراف دقيقة إضافيةCarl RothLH53.1Type 5
أفلام مانعة للتسرب ذاتية اللصق للألواح الدقيقةRatiolab (vWR)RATI6018412
ملقط نمط قياسي  ؛ أدوات العلوم الدقيقة11000-12
مقص زنبركي طالب Vannas  أدوات العلوم الدقيقة91501-09
مقص Vannas capsulotomage   Geuder19760  مستقيم ، 77 مم
ZipTip C18 < / sub > أطراف ماصةMerck MilliporeZTC18S096 <
قوي > D. المعدات والأجهزة< / قوي >
150 & مرات ؛ 0.5 مم BioBasic C18 عمودThermo Scientific ، روكفورد ، الولايات المتحدة الأمريكية72105-150565
30 & مرات ؛ 0.5 مم BioBasic C18 قبل العمود   ؛Thermo Scientific ، روكفورد ، الولايات المتحدة الأمريكية72105-030515
أجهزة تصفية الطرد المركزي Amicon Ultra-0.5 3K  ميرك ميليبورعبوة UFC500396من 96.
الميزان التحليليSartoriusH51
Autosampler CTC Analytics AG, Zwingen, SwitzerlandHTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm التالى مكثف AdvanceNA-BB-25
Eppendorf ، موديل 5301Sigma-AldrichZ368172
جهاز طرد مركزي دقيق Eppendorf ، موديل 5424فيشر Scientific05-403-93مركزي غير مبرد
Heraeus Primo RThermo Scientific75005440
المبرد Labsonic M الخالط بالموجات فوق الصوتية   ؛SartoriusBBI-8535027
LC-MS ، نموذج Rheos AllegroThermo Scientific ، روكفورد ، الولايات المتحدة الأمريكية22080
LTQ Orbitrap XL مطياف الكتلة   ؛Thermo Scientific ، بريمن ، ألمانيا
قارئ لوحة الصعود Multiskan   ؛Thermo Labsystemsv2.6
الدوار مع دوامة  neoLab7-0045
مسبار التيتانيوم (Ø ؛ 0.5 مم ، طول 80 مم)حمام SartoriusBBI-8535612
بالموجات فوق الصوتية ، من النوع RK 31Bandelin329
Xcell Surelock MiniCell Life TechnologiesEl0001
Thermo Fisher Scientificطقم استخراج البروتين عبر الغشاء دبابيس تشريح 200130021 الطبية جهاز طرد مضخة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
  2. Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
  5. Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
  6. Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526(2018).
  7. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
  8. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629(2016).
  9. Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
  10. Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481(2017).
  11. Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
  12. Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
  13. Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
  14. Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
  15. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
  16. Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298(2016).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
  18. Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
  19. Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
  20. Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
  21. Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111(2011).
  22. de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ocular MicrovesselsProtein ExtractionMass Spectrometry ProteomicsSample PreparationCentrifugal Filter DevicesOne Dimensional Gel ElectrophoresisPeptide PurificationLiquid Chromatography MSTissue Protein ExtractionPorcine Short Posterior Ciliary Arteries

Related Articles