مقالة منهجية

اختبار أوراق منفصلة لتبسيط دراسات التعبير الجيني في البطاطا أثناء الإصابة عن طريق مضغ الحشرات مندوكا sexta

DOI:

10.3791/59153

⸱

مايو 15, 2019

 ,  ,  , 
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Lab, United States Department of Agriculture (USDA), Agricultural Research Service (ARS), 2Genetic Improvement for Fruits and Vegetables Lab, USDA-ARS

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقة المعروضة يخلق الأنسجة النباتية التالفة الأعشاب الطبيعية من خلال تطبيق يرقات Manduca sexta على أوراق منفصلة من البطاطا. يتم فحص الأنسجة النباتية للتعبير عن ستة متجانسات عامل النسخ المشاركة في الاستجابات المبكرة لعشب الحشرات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطبيعة المتعددة التغذية لدراسات التعبير الجيني للحشرات الأعشاب العاجية تتطلب أعدادا كبيرة من النسخ البيولوجي، وخلق الحاجة إلى بروتوكولات أكثر بساطة، وأكثر تبسيطا الأعشاب. عادة ما تدرس اضطرابات مضغ الحشرات في النظم النباتية كلها. في حين أن هذه الاستراتيجية الكائن الحي كله تحظى بشعبية، فإنه ليس من الضروري إذا كان يمكن تكرار ملاحظات مماثلة في ورقة منفصلة واحدة. والافتراض هو أن العناصر الأساسية اللازمة لنقل الإشارات موجودة داخل الورقة نفسها. في حالة الأحداث المبكرة في نقل الإشارة، تحتاج الخلايا فقط لتلقي الإشارة من الاضطراب ونقل تلك الإشارة إلى الخلايا المجاورة التي يتم اختبارها للتعبير الجيني.

والطريقة المقترحة تغير ببساطة توقيت المفرزة. في التجارب النباتية الكاملة، تقتصر اليرقات على ورقة واحدة يتم فصلها في نهاية المطاف عن النبات وإسيد هاهية للتعبير الجيني. إذا تم عكس ترتيب الختان، من الماضي في الدراسات النباتية كلها، إلى الأولى في الدراسة المنفصلة، يتم تبسيط تجربة التغذية.

يتم نشر Solanum tuberosum var. Kennebec عن طريق نقل العقدية في وسط زراعة الأنسجة بسيطة ونقلها إلى التربة لمزيد من النمو إذا رغبت في ذلك. يتم استئصال الأوراق من النبات الأم ونقلها إلى أطباق بيتري حيث يتم إجراء فحص التغذية مع مراحل اليرقات من M. sexta. يتم التحقق من تلف الأنسجة الورقية للتعبير عن الأحداث المبكرة نسبيا في نقل إشارة. حدد تحليل التعبير الجيني عوامل النسخ Cys2-His2 (C2H2) الخاصة بالإصابة، مما يؤكد نجاح استخدام الأوراق المنفصلة في دراسات الاستجابة المبكرة. الطريقة هي أسهل لأداء من غزوات النبات كله ويستخدم مساحة أقل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأعشاب العاج يضع في الحركة سلسلة من الأحداث الجزيئية التي يمكن للنبات على حد سواء تحديد الهجوم وجبل استجابة مناسبة لبقائها. يتلقى النبات اثنين من العظة الأساسية من مضغ الحشرات. واحد من الضرر المادي للأنسجة والآخر من المواد الخاصة بالحشرات. يتم إطلاق الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (DAMPs) استجابة للضرر الناجم عن أجزاء الفم اليرقات وإثارة استجابة جرح محددة جيدا ً تؤدي إلى زيادة في حمض الجاسمونيك الهرموني ونسخ جينات الدفاع1. واحدة من DAMPs الأكثر شهرة هو systemin، وهو ببتيد التي يتم تشكيلها من قبل انشقاق أكبر بروتين بروsystemin بعد جرح ورقة2،3. يتم تعديل استجابة الجرح حمض jasmonic كذلك من قبل الأنماط الجزيئية المرتبطة بالأعشاب (HAMPs)، والتي يمكن أن تستمد من اللعاب كاتربيلر، محتويات الأمعاء (regurgitant) والبراز (frass)4. الحشرات استخدام هذه المواد إما لتعزيزأو التهرب من استجابة الدفاع 5. عوامل النسخ ثم نقل الرسالة من إشارات هرمون في استجابة الدفاع عن طريق تنظيم الجينات الدفاع المصب6و7و8.

بعض دراسات التفاعل بين النبات والحشرات المستخدمة في البيئات المختبرية هي من النوع المحاكي ، بهدف تقريب الطريقة الطبيعية للتغذية من قبل الحشرة. عادة ما يتم إنجاز محاكاة الأعشاب العاجعن طريق خلق ضرر اصطناعي للأنسجة النباتية مع الأدوات المختلفة التي تحاكي آلية محددة من الفم الحشرات كافية للتسبب في إطلاق DAMPs وتحريك إنتاج الجينات الدفاعية. وغالبا ما تضاف المكونات الأخرى الخاصة بالحشرات مثل إفرازات الفم أو قلس لتكرار مساهمة HAMPs9،10،11. إنشاء حجم معين ونوع من الجرح وتطبيق كميات دقيقة من HAMPs هي ميزة واحدة لهذه الأنواع من الدراسات ويمكن أن تقدم المزيد من النتائج القابلة للاستنساخ. الدراسات العشبية الطبيعية، حيث يتم إنجاز الضرر الذي يلحق بالأنسجة النباتية من خلال تطبيق الحشرات المكتسبة في الميدان أو التي تربى مختبرًا، غالبًا ما تكون أكثر صعوبة لأن حجم الجرح وكميات HAMP يحكمها سلوك الحشرات وإضافة تباين إلى البيانات. الأساليب الطبيعية مقابل المحاكاة ومزاياها وعيوبها تناقش بشكل جيد في الأدب12،13،14.

لدراسة أحداث الإشارات المبكرة مثل عوامل النسخ، يجب استهلاك نسبة مئوية معينة من الورقة في فترة زمنية قصيرة نسبيا، لذلك يجب أن تبدأ اليرقات في المضغ على الفور والحفاظ على الاستهلاك حتى يتم تجميد الورقة لتحليلها. M. sexta هو مغذي شره على النباتات السولاناسيوس متعددة خلال العديد من مراحل اليرقات، مما يجعلها مثالية لنقل أقصى قدر من الضرر في فترة قصيرة نسبيا من الزمن15. هذا هو مريح عند دراسة الأحداث إشارة في وقت مبكر، كما يحدث استجابة النبات على الفور تقريبا بعد الحشرات يتصل سطح ورقة16،17. ويثبت أسلوب الاحتواء الشائع استخداماً في قفص المشبك أنه خرقاء، لأن الأقفاص المتعددة تتطلب تعديلات مستمرة طوال التجربة للسماح بإزالة اليرقات أو إضافتها. يجب أن تكون الأوراق أيضا كبيرة بما فيه الكفاية وقوية بما فيه الكفاية لدعم الحشرات متعددة التغذية في نفس الوقت. هذه الأنواع من نباتات البطاطا تتطلب مساحة كبيرة لمراقبة التغذية. وغالبا ما تنتقل اليرقات إلى الجانب السفلي من سطح الأوراق مما يجعل أيضا ملاحظات التغذية صعبة للغاية. ومن الواضح أن استخدام نباتات كاملة لإجراء هذه التجارب أمر مرهق.

الدراسة الحالية يستخدم أوراق منفصلة معزولة في أطباق بيتري بدلا من النباتات كلها لتبسيط وتبسيط نهج النبات كله لدراسة الأعشاب العاج. يقتصر تطبيق البروتوكول في هذه الدراسة على مراقبة مجموعة من عوامل النسخ C2H2 الناجمة في وقت مبكر في أوراق البطاطس بعد الضرر العشبي من قبل يرقات M. sexta.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لشخص واحد لإعداد وإجراء ملاحظات وجمع العينات. قد يتم دمج تشغيل متعددة من نفس الإعداد لزيادة النسخ المتماثل البيولوجي. وينبغي إعداد أي تكرار إضافي للتجربة في نفس الوقت من اليوم للقضاء على التأثيرات اليومية المحتملة على التعبير الجيني. تم تصميم البروتوكول لإنشاء 3 أوراق "موبوءة" لمدة 5 نقاط زمنية منفصلة للحصاد. أوراق التحكم المتطابقة لكل نقطة زمنية إنشاء ما مجموعه 30 عينة. يمكن إجراء التجربة مع مجموعة متنوعة من أحجام الأوراق ومراحل اليرقات، ولكن من المستحسن أن يكون حجم الورقة، ومرحلة اليرقات ووقت الإصابة متسقة في جميع مراحل الإجراء.

1. إعداد نباتات البطاطا

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتطلب تقنية معقمة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة18،19.

  1. إعداد النباتات Kennebec من مصدر explant.
    1. إعداد وسيط الانتشار.
      1. أضف 4.43 غرام من Murashige وSkoog (MS) مع مسحوق الفيتامينات، 20 غرام من السكروز و 2 غرام من الأونصة البديلة إلى 1 لتر من التناضح العكسي (RO) المياه النقية في قارورة 2 لتر مع شريط تدور. نقل قارورة إلى طبق تحريك وتخلط. ضبط الحموضة إلى 5.8 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم مع الاستمرار في تحريك.
        ملاحظة: أجار لن تذوب حتى الأوتوكلاف.
      2. إضافة 1 مل من المواد الحافظة / biocide والأوتوكلاف على دورة السائل لمدة 20 دقيقة (121 درجة مئوية، 101.3 كيلوباسكال). إزالة المتوسطة من الأوتوكلاف مباشرة بعد الانتهاء من دورة وتبريده إلى 50 درجة مئوية. نقل 100 مل من الانتشار المعقمة والمبردة المتوسطة إلى أوعية الثقافة المعقمة (على سبيل المثال، أرجواني أو Plantcon) باستخدام تقنية معقمة في غطاء زراعة الأنسجة.
    2. إعداد المواد explant.
      1. الحصول على مصدر explant كما بذور بذور كينيبيك وإزالة جميع آثار التربة عن طريق الغسيل مع الحنفية H2O. إزالة براعم وقطع إلى قطع 2 سم مع مشرط معقمة.
      2. تعقيم قطع براعم عن طريق نقع لمدة 15 ق في الإيثانول 70٪، تليها 13 دقيقة في 1:1 التبييض (1 جزء RO-المياه: 1 جزء مركزة الجرثومية / التجارية الصف التبييض). شطف 5 مرات في معقمة H2O.
      3. نقل المواد explant إلى الأوعية زراعة الأنسجة المعقمة مع وسيلة الانتشار في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة باستخدام تقنية معقمة. نقل السفن إلى غرفة زراعة الأنسجة النباتية وتنمو لمدة 2\u20123 أسابيع أو حتى تشكل النباتات في 24 درجة مئوية، 16 ساعة ضوء (140 μmol·m-2·s -1)/8 ساعة فترة ضوئية داكنة.
  2. إعداد النباتات البطاطس زراعة الأنسجة النضوية المنتشرة.
    1. إعداد وسيط نقل العقدية.
      ملاحظة: هذا سيجعل 10 أوعية زراعة الأنسجة التي يمكن استخدامها في نفس اليوم أو يمكن أن تكون مصنوعة في وقت مبكر وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى نقل العقدية.
      1. أضف 36.43 غرام من مزيج أجار المغذي إلى 1 لتر من المياه النقية RO في قارورة 2 لتر مع شريط تدور. نقل قارورة إلى طبق تحريك وتخلط. ضبط الحموضة إلى 5.8 باستخدام KOH مع الاستمرار في تحريك.
        ملاحظة: أجار لن تذوب حتى الأوتوكلاف.
      2. الأوتوكلاف على دورة السائل لمدة 20 دقيقة (121 درجة مئوية، 101.3 كيلوباسكال). إزالة المتوسطة من الأوتوكلاف مباشرة بعد الانتهاء من دورة وتبريده إلى 50 درجة مئوية. نقل 100 مل من المبردة المعقمة نقل العقدية المتوسطة إلى الأوعية ثقافة معقمة (انظر جدولالمواد) باستخدام تقنية معقمة في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
    2. إعداد القطع العقدية.
      1. الحصول على النباتات Kennebec نمت من المواد explant (المنتجة في الخطوة 1.1.2). يجب أن يكون النباتات ما لا يقل عن 3 إلى 4 العقد (نقاط الفرع). إزالة الأوراق باستخدام مقص معقمة أو مشرط. قطع فروع قريبة من الجذعية الرئيسية، وترك حوالي 2 ملم من الأنسجة فرع.
      2. إزالة المقاطع العقدية من الجذعية عن طريق قطع ما يقرب من 2 ملم فوق وتحت كل نقطة فرع أو عقدة. ترتيب القطع العقدية في وعاء زراعة الأنسجة المعقمة التي تحتوي على وسيط نقل العقدية (المنتجة في الخطوة 1.2.1.2) في نفس الاتجاه كما هو الحال في السفينة السابقة (فرع مشيرا إلى أعلى).
      3. نقل السفن مع القطع العقدية إلى غرفة زراعة الأنسجة النباتية وتنمو لمدة 2\u20123 أسابيع في 24 درجة مئوية، 16 ساعة ضوء (140 μmol·m-2·s -1)/8 ساعة فترة ضوئية داكنة.
        ملاحظة: كل قطع العقدية سوف تنمو إلى مصنع جديد. عدد القطع في كل وعاء يحدد حجم ورقة. وسيؤدي انخفاض عدد القطع المنقولة لكل سفينة إلى وجود أوراق أكبر. ثلاثة مصانع لكل سفينة سيكون لها 15 مم × 20 مم يترك في 2\u20123 أسابيع.
  3. (اختياري) إعداد التربة المزروعة نباتات البطاطا Kennebec.
    ملاحظة: لإنتاج أوراق أكبر، يمكن نقل نباتات البطاطا المنتشرة العقدية إلى التربة.
    1. نقل النباتات البطاطا المزروعة في نقل العقدية المتوسطة إلى التربة عن طريق سحب بلطف النبات من المتوسط حتى يتم تحرير جميع الأنسجة الجذرية من أجار.
    2. نقل إلى التربة فقط فوق العقدة 1 من الجذور وحزمة طفيفة التربة حول زرع. الماء بلطف لضمان اتصال التربة مع نظام الجذر.
    3. مكان في غرفة النمو مع 16 ساعة ضوء (140 μmol·m-2·s -1)/8 ساعة فترة ضوئية داكنة و 25/20 درجة مئوية يوم / ليلة درجات الحرارة.
      ملاحظة: النباتات جاهزة عندما وصلت أعلى اثنين من الأوراق الموسعة بالكامل إلى الحجم المناسب للتبيّن.
  4. (اختياري) إعداد نباتات البطاطا المزروعة بالدرنات.
    ملاحظة: نباتات البطاطا المزروعة من الدرنات أكبر وأكثر قوة ويمكن أن تكون مفيدة إذا تربية اليرقات على النباتات أو إذا كان من المرغوب فيه تغذية اليرقات بين عشية وضحاها.
    1. وضع درنة البطاطا 6 في عمق 10 في وعاء يحتوي على مزيج التربة تستكمل مع 10 مل بيليه الأسمدة الإفراج البطيء.
    2. مكان في غرفة النمو مع 16 ساعة ضوء (140 μmol·m-2·s -1)/8 ساعة فترة ضوئية داكنة و 25/20 درجة حرارة يوم/ليلة. النباتات جاهزة حوالي 30-u201240 يوما من زراعة درنة.
      ملاحظة: لا تستخدم النباتات التي بدأت في زهرة.

2. إعداد الحشرات للتغذية

  1. الحصول على مرحلة اليرقات المطلوبة من M. sexta.
    ملاحظة: تم تربية اليرقات لهذه الدراسة على النظام الغذائي الاصطناعي من خلال 5 instar20 ونظمت من قبل فرد من ذوي الخبرة من الحشرات في المنزل. كما يمكن تربية اليرقات جزئياً أو كلياً على الأنسجة النباتية. اليرقات لا تأكل مباشرة قبل التحرش وعلى الأرجح أن تأكل مباشرة بعد التحرش، لذلك التدريج المناسب مهم21.
  2. نقل اليرقات إلى وعاء احتواء مناسب (على سبيل المثال، 6-، 12-، 24-جيدا ً طبق زراعة الأنسجة) اعتماداً على حجم اليرقات. يجب أن يكون هناك يرقة واحدة لكل بئر في الطبق.
    ملاحظة: قد تظهر اليرقات سلوكًا إقليميًا أو آكلًا للأكل دون مصدر غذائي وقد تصاب بالإصابة إذا تم إيواؤها معًا.
  3. (اختياري) اليرقات التجويع لمدة تصل إلى 2 ساعة لأن هذا قد يحسن تغذية اليرقات.
    ملاحظة: يجب أن تكون اليرقات في وعاء احتواء مخزن ة في غرفة النمو خلال هذا الوقت.

3. إعداد مكونات لتجربة الإصابة

ملاحظة: راجع الملخص التخطيطي في الشكل 1.

  1. قم بإجراء قوالب موضع لكل نقطة زمنية للحصاد.
    ملاحظة: من المفيد إعداد 5 صواني مختلفة لكل نقطة وقت الحصاد. هذا يحافظ على عينات منظمة ويسمح للأطباق أن تتحرك في جميع أنحاء أكثر كفاءة كمجموعة دون تغيير ترتيبها. وإذا أجريت حسابات النسبة المئوية للضرر، فإن ذلك ضروري لأن الصور السابقة واللاحقة للإصابة يجب التقاطها بنفس البعد البؤري.
    1. الحصول على 5 صواني قوي قادرة على عقد مجموعة من ستة أطباق بيتري الحجم المناسب وخط مع ورقة بيضاء.
      ملاحظة: يعتمد حجم طبق بيتري على حجم الورقة المختارة لإجراء التبيء. يجب أن تناسب ورقة بسهولة في الطبق دون لمس الجانبين. على سبيل المثال، طبق 60 مم × 15 مم مناسب للأوراق التي يصل طولها إلى 50 مم أو عرضها.
    2. تتبع مجموعة من ست دوائر باستخدام طبق بيتري الحجم المناسب على الورق في كل صينية. تسمية مجموعة واحدة من الدوائر 'التحكم' A، B و C والآخر 'الموبوءة' A، B، و C. أيضا تسمية كل قالب التنسيب مع وقت الحصاد المناسب.
  2. (اختياري) إعداد كاميرا لالتقاط الصور "قبل الإصابة" و"بعد الإصابة".
    1. تأمين كاميرا على موقف في البعد البؤري المناسب لالتقاط الصور من جميع أطباق بيتري في قالب التنسيب.
  3. تسمية أنابيب نقطة وقت الحصاد.
    1. تسمية مجموعة من 30، 1.7 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المقابلة لكل دائرة في قالب التنسيب. تسمية الأنابيب لتحديد الاضطراب (التحكم/الموبوءة) وحرف النسخ المتماثل للنبات (A أو B أو C) ونقطة وقت الحصاد (عدد الدقائق بعد فترة الإصابة).
  4. إعداد أطباق بيتري التي تم اختيارها في الخطوة 3.1.1.
    1. ضع قرص ورق فلتر معقم في كل طبق من أطباق Petri الـ 30 من الخطوة 3.1.1. إضافة الماء المعقم لترطيب الأقراص. لا تسمح المياه الزائدة لتجمع في الطبق. ضع كل طبق في كل دائرة من الدوائر الست في كل قالب موضع.
    2. وضع ثلاثة نباتات البطاطا بجانب كل قالب التنسيب. تأكد من أن النباتات هي كل نفس العمر والحجم النسبي.

4- الإصابة

ملاحظة: يتم إعداد قالب نقطة وقت/موضع حصاد واحد في كل مرة.

  1. إزالة أعلى اثنين من الأوراق المتطابقة حجم من كل مصنع مع مقص معقمة ووضع ورقة واحدة في طبق بيتري السيطرة وواحدة في طبق بيتري الموبوءة لكل مصنع (A، B و C). تنفيذ هذه العملية في أسرع وقت ممكن.
  2. (اختياري) نقل قالب الموضع إلى حامل الكاميرا لالتقاط صورة "قبل الإصابة".
  3. نقل اليرقات إلى كل طبق موبوء باستخدام ملقط لمسة ناعمة في أسرع وقت ممكن. تعيين جهاز ضبط الوقت لوقت 'غزو' المطلوب.
    ملاحظة: الفترة الزمنية التي تستهلك فيها اليرقات الأنسجة الورقية هي "وقت الإصابة". هذا هو الشيء الذي يمكن تحديده تجريبيا باستخدام عدد قليل من أوراق الاختبار / اليرقات قبل بداية الإصابة الفعلية. يجب أن يكون "وقت الإصابة" المختار متناسقًا لجميع الأوراق الموبوءة.
    ملاحظة: يجب التعامل مع اليرقات بعناية من قبل ملقط لمسة ناعمة. يمكن استيعاب النجم الثاني إلى الرابع بلطف من القرن أو القسم الأوسط.
  4. مراقبة التغذية للتأكد من أن جميع اليرقات تأكل. يجب إضافة/إزالة اليرقات بناءً على سلوك التغذية. احتفظ بالأغطية على أطباق بيتري قدر الإمكان.
    ملاحظة: يمكن استخدام يرقات متعددة لكل ورقة.
  5. إزالة اليرقات من الأوراق في نهاية وقت الإصابة. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت لوقت الحصاد.
  6. (اختياري) نقل قالب الموضع إلى حامل الكاميرا لالتقاط صورة "بعد الإصابة".
    ملاحظة: يتم حصاد جميع الأوراق الستة في قالب الموضع في وقت الحصاد المحدد.

5. أوراق الحصاد

  1. نقل كل ورقة إلى أنبوب المسمى المقابلة في نهاية كل نقطة وقتالحصاد وتجميد على الفور عن طريق إسقاط الأنبوب في السائل N 2. تخزين الأنسجة النباتية حصادها في -80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي الريبي.
  2. كرر الخطوات 4\u20125.1 لكل نقطة وقت الحصاد.

6. معالجة الأنسجة الورقية لتحليل التعبير الجيني

  1. طحن الأنسجة ورقة المجمدة إلى مسحوق مع micropestle.
  2. عزل مجموع الحمض النووي الريبي وعملية التعبير الجيني كما سبق وصفه22.

7. (اختياري) تقدير تلف ورقة

  1. تقدير بصريا نسبة الضرر ورقة أو حساب منطقة ورقة في الصور قبل وبعد الإصابة.
  2. قياس مساحة الورقة باستخدام أدوات البرمجيات (على سبيل المثال، Phenophyte)23.
  3. من قياسات منطقة الورق، حساب النسبة المئوية للضرر كما
    النسبة المئوية للضرر = [(مساحة الورقة قبل – منطقة الورقة بعد) / ورقة المنطقة قبل] × 100.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد استهلاك الورق نجاح البروتوكول. يجب أن تبدأ اليرقات الصحية والمرحلية بدقة في التغذية فور وضعها على سطح الأوراق، وينبغي أن تستمر التغذية بطريقة متسقة إلى حد ما طوال فترة الإصابة. في الفيديو 1، تبدأ اليرقة في الأعلى في المضغ مباشرة بعد التنسيب وتحافظ على معدل ثابت أثناء التغذية. وهذا مهم بشكل خاص إذا كان اختبار أحداث التعبير الجيني المبكر بعد الإصابة. اليرقات في الجزء السفلي لم تستهلك أي مادة ورقة وهو مثال على الإصابة غير ناجحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام المنهجيات النباتية الكاملة الأعشاب غير ضرورية لتحقيق هدف هذه الدراسة بالذات (أي فحص مجموعة من الجينات المرشحة لاستجابتها للإصابة). الفائدة الواضحة من صقل ورقة منفصلة هو تقصير الوقت الذي يستغرقه لأداء الاختبارات herbivory. يتم القضاء على الطبيعة غير العملية للنباتات كلها مع أقفاص كليب ويتم تنفيذ الاختبارات في وقت أقرب، منذ النباتات في سن 2 أسابيع يمكن استخدامها لحصاد الأوراق. كما أنه يتطلب بصمة أصغر بكثير أثناء التغذية ومساحة غرفة نمو أقل؛ على حد سواء هامة عندما تكون هذه الموارد محدودة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا بوب فارار وأليكسيس بارك على تزويدهما بالحشرات المستخدمة في هذه الدراسة وعلى خبرتهما في تنظيم اليرقات. شكر إضافي لمايكل بلاكبيرن وسايكات غوش للمراجعة النقدية للمخطوطة.

إن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض تقديم معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من وزارة الزراعة الأميركية.

وزارة الزراعة الأمريكية هي مزود تكافؤ الفرص وصاحب العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
منتج بديل أجارPhytoTechnology LaboratoriesG3251هو
وعاء احتواء Gelzan (6،12 أو 24 طبق بئر)Fisher Scientific 08-772-49 ، 08-772-50 ، 08-72-51تبيع العديد من الشركات الأخرى هذه المنتجات
بيض ماندوكا   ؛شركة كارولينا للتوريد البيولوجي14388030-50 بيضة
بيض ماندوكا البحيرات العظمى دودة القرنNA50 أو 100 أو 250 أو 500 بيضة
يرقات ماندوكاشركة كارولينا للإمداد البيولوجيإلى طلبات يرقات محددةلأي
يرقات ماندوكابحيرات العظمى دودة القرنتدعو إلى طلبات ططور يرقات محددةأي
أنابيب طرد مركزي دقيقة ، 1.7 مل & nbsp ؛توماس ساینتفيك1158R22تم اختبارها في سائل N2 ولن تنفجر
Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w / VitaminsPhytoTechnology LaboratoriesM519المستخدمة لصنع
مزيج أجار متوسط المغذياتالتكاثر منتج مختبرات PhytoTechnologyM5825هو Murashige & Skoog Basal Medium مع الفيتامينات والسكروز
وأقراص تصفية ورقGelzan Fisher Scientific  09-805Aدوائر Whatman - شراء لتناسب طبق بتري
طبق بتري ، 60X15 مم أو 100X15 ممفيشر Scientific   ؛FB0875713A أو FB0875712حجم الشراء المناسب لدرنات البطاطس بحجم الأوراق
  ؛أيحجم B (غير عضوي)يقترح Maine Farmer s
أواني التبادل, 10" شركة جريفين للاحتباس الحراري41PT1000CN2
مادة حافظة / مبيداتحيوية تكنولوجيا الخلايا النباتيةNAهو PPM (خليط حافظة نباتية)
بذور البطاطس لمصدرالمصنع أيحجم B (غير عضوي)يقترح Maine Farmer s Exchange
سماد بطيء الإطلاق (14-14-14)أيNAOsmocote هو اسم علامة تجارية شهيرة
ملقط ناعم الملمسBioQuip4750
مزيج التربةGriffin Greenhouse Supplies، Inc.65-51121المنتج هو Sunshine LC1 مزيج
وعاء ثقافة معقم   ؛مختبرات PhytoTechnologyC2100وعاء من النوع الأرجواني ، وعاء استزراع معقم PTL-100
  ؛فيشر العلمية المنتج ICN2672206هو MP Biomedicals Plantcon
تدعو العصر منتج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
  2. Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
  3. Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
  4. Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
  5. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
  6. Chen, M. -S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
  7. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
  8. War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
  9. McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
  10. Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
  11. Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
  12. Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
  13. Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
  14. Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
  15. Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
  16. Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
  17. Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
  18. Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
  19. Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
  20. Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
  21. Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
  22. Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
  23. Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
  24. Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
  25. Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
  26. Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
  27. Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
  28. Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
  29. Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
  30. Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
  31. Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
  32. Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328(2014).
  33. Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
  34. Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
  35. Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
  36. Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
  37. Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
  38. Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018).
  39. Great Lakes Hornworm. Products. , Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018).
  40. The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from: http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/ (2018).
  41. Raising Manduca sexta. , Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018).
  42. Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018).
  43. Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA C2H2

مقالات ذات صلة