مقالة منهجية

الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال يسلط الضوء على عدة مسارات الحركية في الحبل الشوكي الفئران

DOI:

10.3791/59160

⸱

مارس 15, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Shriner's Pediatric Research Center, Temple University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يوضح حقن ناقل فيروسي ريتروجراديلي قابلة للنقل في أنسجة النخاع الشوكي الفئران. تناولها في المشبك الناقل ونقلها إلى الجسم خلية من الخلايا العصبية المستهدفة. هذا النموذج مناسبة لاقتفاء أثر رجعي مسارات العمود الفقري هامة أو استهداف الخلايا لتطبيقات العلاج الجيني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إدخال البروتينات ذات الاهتمام في الخلايا في الجهاز العصبي يشكل تحديا بسبب الحواجز البيولوجية الفطرية التي تحد من الوصول إلى معظم الجزيئات. تتجاوز هذه الحواجز، وتوفير إمكانية الوصول إلى الأجهزة المحمولة الحقن مباشرة في أنسجة النخاع الشوكي أو synapses حيث يمكن إدراج الجزيئات. الجمع بين التكنولوجيا النواقل الفيروسية مع هذا الأسلوب يسمح لإدخال الجينات المستهدفة في النسيج العصبي غرض العلاج الجيني أو تتبع المسالك. هنا هو عرض فيروس هندسيا للنقل إلى الوراء ذات كفاءة عالية (حرية) عند نهايات من بروبريوسبينال إينتيرنيورونس (السندات الإذنية) لتشجيع النقل المحددة للخلايا العصبية في الحبل الشوكي ونوى جذع الدماغ. استهداف السندات الإذنية يستفيد من الاتصالات العديدة التي يتلقونها من مسارات السيارات مثل مساحات روبروسبينال وريتيكولوسبينال، فضلا عن بالترابط مع بعضها البعض في جميع أنحاء أجزاء الحبل الشوكي. الممثل التتبع باستخدام ناقلات هيريت مع تفاصيل عالية الدقة يظهر البروتين active مؤثرا الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) الهيئات الخلية ومحاور عصبية والعرش الجذعية في السندات الإذنية والصدر وفي الخلايا العصبية ريتيكولوسبينال في تشكيل شبكي البوتانية. حرية جيدا ودمج مسارات جذع الدماغ والجهاز العصبي المحيطي ولكن يظهر الاندماج يتوقف العمر في المسالك كورتيكوسبينال الخلايا العصبية. وخلاصة القول، حقن الحبل الشوكي باستخدام النواقل الفيروسية طريقة مناسبة لإدخال البروتينات ذات الاهتمام في الخلايا العصبية لمساحات محددة الأهداف.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النواقل الفيروسية هي أدوات البيولوجية الهامة التي يمكن إدخال المواد الجينية في الخلايا من أجل التعويض عن الجينات المعيبة، بروتينات النمو الهام upregulate أو صنع البروتينات العلامة التي تسلط الضوء على هيكل واتصالات متشابك من أهدافها. تركز هذه المقالة على الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال ريتروجراديلي القابلة للنقل ذات كفاءة عالية في الحبل الشوكي الفئران بغية تسليط الضوء على مسارات السيارات الرئيسية مع تتبع الفلورسنت.  هذا الأسلوب هو أيضا مناسب جداً لدراسات التجديد وإعادة نمو محواري ﻹدخال البروتينات لمصلحة السكان متنوعة من الخلايا العصبية، وقد استخدمت لإسكات الخلايا العصبية لرسم الخرائط الوظيفية الدراسات1،2.

كثير من التفاصيل التشريحية للعمود الفقري مسارات السيارات تم توضيحها من خلال دراسات الحقن المباشر مع تتبع الكلاسيكية مثل BDA ومخفضات والذهب3،،من45،،من67 , 8-تتبع هذه تعتبر معيار الذهب ولكن قد يكون بعض العيوب مثل الإقبال بمحاور عصبية تالفة، أو محاور عصبية في ممر في هذا الشأن البيضاء المحيطة بحقن الموقع9،10،11 . وهذا يمكن أن يؤدي إلى تفسيرات خاطئة لمسار الاتصال وقد يكون هناك عيب في دراسات التجديد حيث يمكن أن يكون مخطئا امتصاص الصبغة بواسطة محاور عصبية معطوبة أو مقطوعة لتجديد الألياف أثناء تحليل لاحق12.

لينتيفيرال الناقلة شعبية في دراسات العلاج الجيني، كما أنها توفر التعبير مستقرة وطويلة الأمد في السكان العصبية13،،من1415،،من1617،18 ،19. بيد ناقلات لينتيفيرال تقليديا المعلبة يمكن حدت من النقل إلى الوراء وقد تؤدي إلى استجابة الجهاز المناعي عند استخدامها في فيفو4،،من2021. وتنتج ناقل نقل إلى الوراء ذات كفاءة عالية ووصف حرية كاتو et al. بتعديل المغلف الفيروسي مع داء فيروس بروتين سكري لإنشاء ناقل هجينة التي تعمل على تحسين النقل إلى الوراء22،23.

اقتفاء أثر رجعي يدخل متجه إلى مساحة متشابك لخلية الهدف، مما يسمح لها أن تتناولها إكسون تلك الخلية ونقلها إلى جسم الخلية. قد ثبت النقل الناجح حرية من نهايات الخلايا العصبية في أدمغة الفئران والقرود23،24 ومن العضلات في الخلايا العصبية الحركية22. هذا البروتوكول يوضح حقن في الحبل الشوكي القطني، تستهدف على وجه التحديد محطات متشابك إينتيرنيورونس بروبريوسبينال والخلايا العصبية في الدماغ. السندات الإذنية تلقي اتصالات من العديد من مسارات مختلفة العمود الفقري وهكذا يمكن أن تستخدم لاستهداف سكان متنوعة من الخلايا العصبية في الحبل الشوكي والدماغ. تسمية الخلايا العصبية في هذه الدراسة تمثل الدوائر إينيرفاتينج تجمعات الخلايا العصبية الحركية المتصلة بوظيفة الحركة اللكتات. ويعتبر وسم قوية في الحبل الشوكي وجذع الدماغ، بما في ذلك تفاصيل عالية الدقة للعرش الجذعية ومحطات إكسون. كما أننا استخدمنا هذا الأسلوب في الدراسات السابقة داخل الحبل الشوكي عنق الرحم لتسمية بروبريوسبينال والدماغ ريتيكولوسبينال مسارات25.

هذا البروتوكول يوضح ضخ النواقل الفيروسية في الحبل الشوكي القطني من الفئران. كما يظهر في الفيلم 1، يستهدف الشق طريق تحديد فقرة L1 يقع في الضلع الأخير. وهذا كعلامة بارزة والذيلية لشق سم 3-4 الذي يعرض الجهاز العضلي عبر الحبل الشوكي L1-L4. تتم لامينيكتوميس جوانب الظهرية لفقرات T11 T13 ويوجه إبرة زجاج مشطوف الوحشي 0.8 ملم من خط الوسط وخفض 1.5 مم عمق الرمادية لحقن الفيروس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الإجراءات الجراحية والحيوان الرعاية التالية عليها برعاية الحيوانات واستخدام اللجنة لجامعة تمبل.

1-مرحلة ما قبل الجراحية التحضير

  1. إعداد الزجاج سحبت الإبر لحقن الفيروسية بضعة أيام قبل الجراحة باستخدام 3.5 نانولتر الزجاج الشعرية الماصات مصممة للحقن نانولتر. اسحب كل ماصة خطوتين إبرة ساحبة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لإنشاء قوالب إبرة اثنين.
  2. صقل غيض القوالب إبرة بقطع حوالي 1-2 مم زجاج الزائد مع ميكروسسيسورس. قياس حجم الفتحة التقريبية تحت مجهر مع شريحة معايرة مجهر لعزل الإبر مع فتحات ميكرون 30-40.
  3. مع الإبرة المتمركزة على 30°، استخدم بيفيلير ميكروبيبيتي لإنشاء تلميح مع فتحه ميكرومتر 30-40 وزاوية مشطوفة 45°. تحقق من عرض الفتحة مع رنية على الشريحة المعايرة. تمرير المياه والايثانول من خلال إبرة الزجاج باستخدام المحاقن مع مرفق إبرة مرنة يجرف الحطام ومارك الإبرة على فترات منتظمة مع علامة سوداء.
  4. مكان الإبر في طبق بتري مغطاة تنظيفها مسبقاً مع الإيثانول 70% وتعقيم لمدة 30 دقيقة في غطاء السلامة الأحيائية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  5. إعداد لينتيفيروس حرية عن طريق إزالة وحدة تخزين مناسبة من الثلاجة مباشرة قبل الإجراء.
    ملاحظة: وحدة تخزين مناسب يتضمن المبلغ اللازم لحقن (1 ميليلتر للحقنة الواحدة × عدد الحقن) بالإضافة إلى كمية صغيرة من حجم إضافي على حساب بيبيتينج وتحميل الخسائر. نقل وتخزين الفيروس على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
  6. إعداد محقن بتوصيله إلى ميكروبومب ووضعه في ميكرومانيبولاتور مع ورنيه.
  7. لإعداد الإبرة الزجاجية، وتحميل صبغة ملونة مثل زيت الأحمر بعناية مع حقنه تجهيزه بإبرة مرنة. ضمان بقاء لا فقاعات في الإبرة. استخدام تقنية معقمة عند التعامل مع الإبرة، والامتناع عن لمس الحافة.
  8. إدراج إبرة زجاجية في محقن، ضمان أن الإبرة يجلس بشكل صحيح في الغسالات وكاب حاقن هو مشدود على ضيق، ومدد الإبرة حاقن الصلب تقريبا ¾ طول الإبرة الزجاج. الفيروسات يمكن تحميله إلى الإبرة في خطوة لاحقة.

2-التخدير وتحضير الموقع الجراحي

  1. وزن الحيوان على مقياس رقمي. تسجيل الوزن قبل العملية لتحديد حجم التخدير اللازمة والسماح للرصد من الوزن ما بعد الجراحة. إناث الفئران سبراغ داولي حوالي 200-250 غم استخدمت في هذا البروتوكول.
  2. تخدير الفئران باستخدام أما من استنشاق إيسوفلوراني أو حلاً الكيتامين/xylazine حقن (k/x). وهنا، يتم حقن الكيتامين إينترابيريتونيلي في 67 مغ/كغ وإكسيلازيني في جرعة 6.7 مغ/كغ.
  3. تأكيد طائرة مخدر مناسبة معسر في القدم بشدة. في حال حدوث انسحاب انعكاسية، انتظر عدة دقائق إضافية قبل المتابعة.
    ملاحظة: الانتباه أيضا شعيرات، والعيون ومعدل التنفس لعلامات الوعي. إذا كان يتم الوخز شعيرات، يومض العين عند لمسها بلطف، أو التنفس السريع والضحلة، انتظر حتى الطائرة مخدر أعمق المضي قدما في البروتوكول. كما ترصد هذه الإشارات في جميع أنحاء جراحة الاستئصال وحقن. إذا كان الحيوان يعرض طائرة مخدر ضحلة، إدارة رصاصة الداعم لتكافؤ الكيتامين فقط إلى ½ ك الأصلي/x الجرعة.
  4. يحلق الفئران على طول خط الوسط الظهرية من الوركين إلى زاوية أقل شأنا من سكابولاي. سحب جلد الحيوان مشدود لحلاقة أسهل وأكثر دقة.
  5. تطبيق مرهم العيون لكلتا العينين.
  6. تطبيق مطهر إلى منطقة حلق لتعقيم الموقع. لفرك الأولى، نقع شاش معقم مع الحل اليود 5% ومسح بعيداً كل الشعر والحطام. اتبع هذا مع انتقاد أحادي الاتجاه مع شاش معقم غارقة في الإيثانول 70%، حيث أنه لا توجد منطقة يتم الاتصال مرتين. استخدام هذه التقنية مع التناوب اليود والشاش غارقة في الإيثانول أكثر من مرتين.

3-العمليات الجراحية إعداد الحقل والصك

  1. إعداد مجموعة من الأدوات الجراحية يعقم التي تشمل مشرط، رونجيورس، الملقط الأسنان الفئران، مقص الربيع، هيموستاتس، ونقطة متوسطة منحنى ملقط والكامشات أو خطاطيف مرجح بإزالة التغليف التفاف العقيمة لإنشاء حقل عقيمة.
  2. فتح مجموعة قفازات الجراحية المعقمة ومكان التفاف القفازات المعقمة في الجدول. استخدام هذا كحقل إضافي معقم للأدوات المستخدمة لمنع تلوث التفاف العقيمة.
  3. إسقاط شفرة المبضع #10 على ميدان العقيمة. تأمين النصل إلى مقبض مع هيموستاتس. موقف عقيمة المالحة، 4.0 خياطة الوتر الكروميك، ومواد لمراقبة النزيف مثل كوتيريزير وشاش معقم والعقيمة القطن ذات الرؤوس (قضيب لتطبيق تجاوز الهوامش العضلات)، أو جيلفوام أو بونو (لتجاوز الهوامش العظام) في مكان الوصول.
  4. استرداد هذا الحيوان ووضعه على قطعة من قماش معقم. ضع شاش تحت المثانة لتجميع البول. دعم المنطقة المستهدفة بمنشفة تدحرجت تحت البطن. إذا كان متوفراً، ضع وسادة تدفئة جراحية تحت القماش العقيمة، خاصة بالنسبة لإجراءات أطول.
    ملاحظة: العقم مهم أثناء الجراحة البقاء على قيد الحياة. الاحتفاظ بزجاجة رذاذ من الإيثانول 70% من جهة الحفاظ على العقم الأيدي القفاز، واستخدام حبة معقم إذا تم اختراق العقم الصك، أو بين العمليات الجراحية الفردية.

4-تعريض العمود الفقري وتحديد موقع الصفيحة

  1. تحديد منطقة حيث ستبذل شق جلد بضغط الأصابع برفق في الضلع الأخير لتحديد فقرة L1. استخدام هذا كعلامة بارزة، جعل شق جلد 3-4 سم مع #10 مشرط جراحية المنتهية فقط أدنى من L1 لفضح العضلات. اضغط الجلد مشدود بنشر لطيف واضغط بشدة مع شفرة المبضع لضمان شق نظيفة.
  2. قطع وتنتشر الدهون سطحية مع ملقط ومقص إذا لزم الأمر. (اعتماداً على فقرة الهدف، قد يوجد أو لا يكون وسادة الدهون كبيرة سطحية للعضلات).
  3. يشعر للعمليات الشائكة مع الشقة شفرة المبضع أو إصبع. غالباً ما سوف أوجزها منطقة خط الوسط "الخامس" من اللفافة البيضاء على جانبي. قم بقطع صغيرة روسترال للسماح للغرفة للاستيلاء بشكل أمن على عملية العلوي مع الملقط الأسنان الفئران، ثم إجراء تخفيضات طويلة وعميقة 2 قريبة من العمليات قدر الإمكان. في أعمق نقطة من القطع، يمكن أن يرى سطح الفقرات الظهرية مع شفرة المبضع.
  4. عقد العضلات الجانبية جانبا مع الكامشات أو خطاطيف المرجحة تحسين الرؤية. العضلات واضحة حول العمليات بدون مشرط أو مقص الربيع أو رونجيورس لتحديد شكل رؤوسهم.
    ملاحظة: تذكر أن الحبل الشوكي لا يشمل كامل طول العمود الفقري، كما توقف أنسجة النخاع الشوكي تنمو في وقت سابق في التنمية أكثر من العظام. وهذا يعني أنه قد يكون المستوى المستهدف العمود الفقري تحت فقرة مسمى بشكل مختلف.
  5. تحديد موقع T11 وعمليات T12 و T13 المجاورة.
    ملاحظة: يمكن الاطلاع على المساعدة في استهداف مستويات العمود الفقري الصحيح في أطلس حبل الشوكي الفئران والدراسات السابقة التي تحدد معالم في الماوس، والذي قد مشابهة جداً بنية العمود الفقري6،33. اترك عملية الشائكة روسترال مثل T9 دون عائق لإعطاء علامة فارقة في خط الوسط.

5-القيام الاستئصال

  1. حالما تم التعرف بشكل صحيح على المنطقة المستهدفة، تنفيذ لامينيكتوميس جوانب الظهرية T11 T13. بلطف نشر فقرات لتكشف عن الأربطة الفقرية، التي مواقع جيدة لإدراج رونجيورس للدغة الأولية للعظام. عقد في رونجيورس في وضع نصف مغلقة لزيادة المراقبة الدقيقة.
  2. إزالة العمليات الشائكة وجانب الفقرات الظهرية بأخذ لدغات صغيرة مع رونجيورس. احرص على عدم تلف النخاع الشوكي أو تخل بلده دوراً. رفع قليلاً مع الملقط الأسنان الفئران للمساعدة في سحب الحبل الشوكي بعيداً عن الفقرات وانخفاض الميل إلى ضرب أنسجة النخاع الشوكي.
  3. مسح العظام بعيداً من خط الوسط حيث يمكن ملاحظة الأوعية الدموية في خط الوسط. اترك إطار الذي يظهر أنسجة النخاع الشوكي بوضوح وهو خال من الحطام.
  4. بلطف لمس الحبل الشوكي بالملقط. بعض الحيوانات قد الانتقال للغريزة حتى إذا طائرتهم تخدير عميق. تطبيق بضع قطرات من عامل الذهول مثل الليدوكايين مباشرة إلى الحبل الشوكي لمنع القفز أثناء إجراء الحقن.
  5. تأمين الحيوان في حامل العمود الفقري بابزيم الملقط استقرار العمليات الشائكة روسترال ووالذيليه إلى إطار الاستئصال. رفع البطن للحيوان باستخدام حامل العمود الفقري لإبطال مفعول الحركات في التنفس. وهذا زيادة الاستقرار إبرة وضمان العمق المناسب للحقن.

6-تحميل الفيروس وتحديد المواقع محقن

  1. تحميل الفيروس في محقن بيبيتينج حوالي 5 ميليلتر على قطعة من بارافيلم والإبرة لتحديد المواقع حيث يكون التلميح داخل القطرة.
  2. استخدام ميكروبومب سحب تصل إلى 4 ميليلتر للفيروس بمعدل 20 – 100 nL/s.
  3. تعيين وحدة تحكم لحقن والإفراج عن كمية صغيرة من الفيروس من الإبرة لضمان لا يتم حظر غيض الإبرة. تمحو الفيروس الزائدة مع مسح مختبر.
    ملاحظة: يمكن استخدام المحاقن هاملتون بإبرة الصلب كبديل للزجاج سحبت الماصات.
  4. ضع ميكرومانيبولاتور حيث تكون مرئية رنية ووضع الإبرة في خط الوسط النخاع الشوكي.
    ملاحظة: في بعض الأحيان يمكن أن يكون موجوداً في خط الوسط بالأوعية الدموية كبيرة تعمل على السطح الأمامي للنخاع الشوكي. ومع ذلك، هذا يمكن أن تختلف في الفئران الفردية، واستهداف خط الوسط ينبغي تأكيد مقارنة بعملية الشائكة سليمة.
  5. المباشر الإبرة أفقياً من 0.8 ملم استخدام في رنية على ميكرومانيبولاتور.
  6. أقل الإبرة للحبل الشوكي حتى مسافة بادئة، ولكن لا ثقب، في بلده دوراً. استخدام اقتراحا اللف سريع، ثقب في بلده دوراً بالإبرة حتى أنها غرقت على عمق 1.5 مم.

7-حقن الفيروس في الحبل الشوكي

  1. مجرد الإبرة في المكان، البرنامج محقن لحقن بمعدل 400 nL/دقيقة تأكيد أن الفيروس يدخل الحبل الشوكي بمراقبة التقدم المحرز في الجبهة صبغ. ينبغي أن يكون هناك لا تسرب واضحة أو انتفاخ أنسجة النخاع الشوكي. إذا لوحظ تسرب، وهذا يمكن تخفيفها في بعض الأحيان بتقليل سرعة الحقن إلى 200 nL/دقيقة.
  2. بمجرد الانتهاء من الحقن الإبرة للراحة في النخاع الشوكي لمدة 2-5 دقيقة (اعتماداً على حجم حقن) تسمح لتسهيل انتشار الفيروس.
  3. ببطء سحب الإبرة والانتقال إلى موقع الحقن القادم. حقن 1 ميليلتر من الفيروس في كل موقع من مواقع متباعدة بشكل متساو 6 تقريبا 1 ملم بعيداً على طول الأنسجة الشوكي L1-L4. يمكن استخدام نفس الإبرة لكل الحقن طالما أنها لا تزال تعمل بشكل صحيح.

8-الجرح الرعاية الإغلاق وما بعد المنطوق

  1. إزالة الحيوان من صاحب العمود الفقري وإخراج الكامشات أو خطاطيف تستخدم لنشر العضلات الجانبية. ضمان أن الجرح واضح من جميع الأنقاض قبل الإغلاق.
  2. خياطة العضلات خياطة الوتر الكروميك 4.0 باستخدام. قطع خيوط خياطة قريب من العقدة تقليل احتمال تهيج الجلد الداخلية.
  3. ترصيص الجلد إغلاق باستخدام مقاطع عيار 9 ملم الجرح. للسماح للشفاء الأمثل، محاذاة حواف الجلد قبل التدبيس.
  4. وضع الحيوان على الماء الحراري الاحترار وسادة ومراقبة حتى أرق.
  5. حقن 5-10 مل من عقيمة المالحة تحت الجلد لتجديد السوائل والمضادات الحيوية مثل سيفازولين للوقاية من العدوى. عندما يكون الحيوان المتنقلة، وضعه مرة أخرى في قفصة المنزلية وتوفير المسكنات الأولية.  رصد على الفئران لأي علامة على الألم والكرب وتعامل وفقا للإجراء الخاص بك IACUC المعتمدة للتخفيف من حدة الألم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينبغي أن يؤدي الحقن ناجحة والنقل من النواقل الفيروسية في توصيل السكان قوية أحادية الخلايا العصبية في الحبل الشوكي وبعض نوى جذع الدماغ. يوضح الشكل 1 وسم النمطية من الخلايا العصبية ومحاور عصبية في الحبل الشوكي الصدري وفي تشكيل شبكي البوتانية الدماغ في حقن بعد أربعة أسابيع. ويعتبر التعبير بروتينات فلورية خضراء كبيرة في الخلايا العصبية في الرمادية النخاع الشوكي الصدري على الجانب عن حقن (الشكل 1A، منطقة مربعة). ولوحظت أيضا عدد قليل من الخلايا العصبية على الجان...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعالجة الجينية للخلايا العصبية في المخ والحبل الشوكي عملت على تسليط الضوء، الحسية والحركية ومسارات الاستقلال الذاتي عن طريق تتبع الفلورسنت، واستكشاف إمكانات نمو مساحات الخلايا العصبية بعد إصابة27،28، 29 , 30 , 31 , 32 , 33-توجيه حقن ناقل فيروسي ريتروجراديلي قابلة للنقل في الحبل الشوكي يمكن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل بمنحه مقدمة من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية R01 R01NS103481 ومستشفى شرينيرس "بحوث طب الأطفال" منح برنامج العسر الشديد 84051 وحالات العسر الشديد 86000 ووزارة الدفاع (SC140089).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 10 شفرات مشرطRobozRS-9801-10للاستخدام مع المشرط.
1 مل محاقنبيكتون وديكنسون وشركاه309659لحقن IP المخدر ، والجرعات المعززة للتخدير ، وحقن المضادات الحيوية.
10 مل محاقنبيكتون وديكنسون وشركاه309604لحقن المحلول الملحي في ، بعد الجراحة.
4.0 خياطة الكروم CatgutDemeTECHNN374-16لإعادة ربط العضلات أثناء الإغلاق.
48000 Micropipette BevelerWorld Precision Instruments32416تستخدم لشطبة أطراف الأنابيب الزجاجية الشعرية المسحوبة لتشكيل إبر زجاجية وظيفية.
5٪ محلول اليودمنتجات بوردو LPL01020-08للاستخدام في تعقيم موقع الجراحة.
70٪ إيثانولN / AN / Aلتعقيم الإبر الزجاجية المعدة حديثا ، والنماذج الحيوانية أثناء التحضير الجراحي ، وأيدي الجراح أثناء الجراحة ، بالإضافة إلى جميع عمليات الصيانة الطفيفة الأخرى للعقم.
مخدر (محلول الكيتامين / الزيلازين)Zoetis240048لإبقاء في مستوى الوعي الصحيح أثناء الجراحة.
مضاد حيوي (سيفازولين)ويست وارد للمستحضرات الصيدلانيةNPC 0143-9924-90يتم حقنه تحت الجلد لمنع العدوى بعد الجراحة.
معقم حبةCellPoint5-1450لتعقيم الأدوات الجراحية بالحرارة.
أدوات العلومالدقيقة لشمع العظام19009-00لإغلاق العظام في حالة نزيف العظام.
العلوم الدقيقةللكي18010-00لإغلاق أي شرايين أو أوردة مقطوعة أثناء الجراحة لمنع فقدان الدم المفرط.
ميزان رقميOkausREV.005لوزن أثناء التحضير الجراحي.
إبرة مرنةأدوات الدقة العالميةMF34G-5لتنظيف الإبر الزجاجية وتحميل الزيت الأحمر في الإبر الزجاجية.
GelfoamPfizerH68079لإغلاق العظام في حالة نزيف العظام.
أنابيب الشعرية الزجاجيةأدوات الدقة العالمية4878للإبر الزجاجية المسحوبة - يجب أن تكون مصممة لحاقن النانولتر.
ماكينة قص الشعرOster111038-060-000لتطهير موقع الجراحة من الشعر.
HemostatsRobozRS-7231للاستخدام العام في الجراحة.
KimwipesKimtech34155للاستخدام العام في الجراحة.
ملقط منحني متوسط النقطةRobozRS-5136للاستخدام العام في الجراحة.
معالج دقيق بمقياس ورنيةKanetecN / Aللاستهداف الدقيق أثناء الجراحة.
مقص دقيقRobozRS-5621لقطع الهمسات الزجاجية من الأنابيب الشعرية الزجاجية المسحوبة حديثا.
مجهر بمقياس الضوء والورنية العينLeitz WetzlarN / Aيستخدم لتصور وقياس شطف الأنابيب الزجاجية الشعرية المسحوبة في إبر زجاجية وظيفية.
تحكم مضخة الحقنالدقيقة العالمية للأدواتالدقيقة 62403للتحكم في معدل الحقن.
Nanoliter 2000 حاقن رأس المضخةالعالمية للأدوات الدقيقة500150لتحميل وحقن الفيروس بطريقة خاضعة للرقابة.
مجتذب إبرةNarishigePC-100لتسخين وتفكيك الأنابيب الشعرية الزجاجية لتشكيل إبر زجاجية.
مرهم العيونDechra المنتجات البيطريةRAC 0119لحماية عيون أثناء الجراحة.
ParafilmBemisPM-996للمساعدة في تحميل الفيروس في حاقن النانو.
إبر PrecisionGlide (25 جم × 5/8)305122 Becton و Dickinson and Companyللاستخدام مع المحاقن سعة 1 مل و 10 مل للسماح بحقن النموذج الحيواني.
ملقط أسنان الفئرانRobozRS-5152لإمساك العمليات الشائكة.
زيت أحمرN / AN / Aلتوفير واجهة لتصور الفيروس الذي يدخل الأنسجة أثناء الحقن.
مباعداتRobozRS-6510لفتح الجرح الجراحي.
أقراص ريماديلبيو سيرفMP275-050لإدارة الألم بعد الجراحة.
RongeursRobozRS-8300لإزالة العضلات من العمود الفقري أثناء الجراحة.
مقبض شفرة مشرطRobozRS-9843لتقطيع الجلد المفتوح ووسادة الدهون لنموذج أثناء الجراحة.
مقصRobozRS-5980للاستخدام العام في الجراحة.
مشابك الجرح السرقة غير القابل للصدأCellPoint201-1000لربط جلد الجرح الجراحي أثناء الإغلاق.
ملقط إزالة الدبابيسكينت ScientificINS750347لإزالة الدبابيس ، يجب تطبيقها بشكل غير صحيح.
قماش معقمPhenix Research ProductsBP-989لتوفير سطح معقم للعملية.
أدوات تطبيق معقمة من القطنPuritan806-WCلامتصاص الدم في الجرح الجراحي مع الحفاظ على العقم.
شاش معقمCovidien2146لتنظيف المنطقة الجراحية والأدوات الجراحية مع الحفاظ على العقم.
Sterile SalineBaxter HealthcareCorporation 281324للاستخدام في تنقية الدم واستبدال السوائل بعد الجراحة.
قفازات جراحيةN / AN / Aللاستخدام من قبل الجراح للحفاظ على المجال المعقم أثناء الجراحة.
وسادة التسخين الجراحيةN / AN / Aللحفاظ على درجة حرارة جسم النموذج الحيواني أثناء الجراحة.
المجهر الجراحيN / AN / Aلتحسين الرؤية للجرح الجراحي.
دباسة جراحيةكينت INS750546 العلميةلتطبيق الدبابيس.
T / مضخة مضخة مياه العلاج الحراريGaymarTP500Cلضخ الماء الدافئ في وسادة تسخين الحمل الحراري.
وسادة تسخين الحمل الحراري للمياهشركة باكستر للرعاية الصحيةL1K018للاستخدام في منطقة التعافي بعد العملية للحفاظ على درجة حرارة جسم الفاقد للوعي.
خطافات مرجحةN / AN / Aلفتح الجرح الجراحي.
أدوات مرفق وحدة شركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  2. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
  3. Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
  4. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  5. Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
  6. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
  7. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  8. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
  9. Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
  10. Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
  11. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
  12. Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
  13. Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  14. Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
  15. Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
  16. Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
  17. Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
  18. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
  19. Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
  20. DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
  21. Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
  22. Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896(2013).
  23. Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
  24. Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
  25. Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60(2018).
  26. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
  27. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
  28. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
  29. Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447(2014).
  30. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  31. Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
  32. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
  33. Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
  34. Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
  35. Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
  36. Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
  37. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313(2013).
  38. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834(2011).
  39. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  40. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
  41. Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
  42. Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
  43. Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
  44. Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  45. Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
  46. Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
  47. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Spinal Cord InjectionRetrograde TransportPropriospinal InterneuronsGFP ExpressionBrainstem NucleiVertebral TargetingMicro pump InjectionDura PunctureNeural Circuit Tracing

مقالات ذات صلة