مقالة منهجية

جيل، والتضخيم، ومعايرة المؤتلف من فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي

DOI:

10.3791/59218

⸱

أبريل 4, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف لنا طريقة لتوليد وتضخيم وراثيا تعديل فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي (رسفس) ومقايسة البلاك أمثل رسفس. يمكننا توضيح هذا البروتوكول عن طريق إنشاء اثنين من الفيروسات المؤتلف على التوالي تسمح بالتحديد الكمي للنسخ المتماثل RSV ويعيش تحليل RSV إدراج الهيئات وديناميات حبيبات إدراج الهيئات المرتبطة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام فيروسات المؤتلف أصبح عاملاً حاسما في علم الفيروسات الأساسية أو التطبيقية. وقد ثبت علم الوراثة العكسي لتكون عبارة عن تقنية قوية للغاية، سواء لفك آليات النسخ المتماثل الفيروسية أو لدراسة الأدوية المضادة للفيروسات أو توفير منصة تطوير اللقاحات. البناء والتلاعب بنظام الجينية العكسية لسلبية-حبلا فيروسات الرنا مثل فيروس المخلوي تنفسي (RSV)، ومع ذلك، تظل حساسة ويتطلب دراية خاصة. هو الجينوم RSV رنا طاق واحد، والشعور السلبي من حوالي 15 كيلوبايت، يعمل كقالب للنسخ المتماثل للجيش الملكي النيبالي الفيروسية والنسخ. لدينا نظام الوراثة عكس يستخدم نسخة كدنا RSV سلالة طويلة المجين البشري (هرسف). يتم وضع هذا كدنا، فضلا عن كدناس ترميز البروتينات الفيروسية من بوليميريز المعقدة (ل، ف، ن، و M2-1)، في ناقلات التعبير الفردي تحت T7 بوليميريز تسلسلات تحكم. تعداء هذه العناصر في زنزانات فرقة البحث-T7/5، التي تعبر عن ستابلي T7 بوليميريز، يسمح بالنسخ المتماثل هيولى والنسخ من RSV المؤتلف، مما أدى إلى فيريونس المعدلة وراثيا. وتجمع RSV جديدة، التي موجودة على سطح الخلية وفي المادة طافية الثقافة BSRT7/5، لتصيب الإنسان HEp-2 الخلايا للتضخيم الفيروسية. اثنين أو ثلاث جولات من التضخيم مطلوبة للحصول على الأرصدة الفيروسي الذي يحتوي على 1 × 106 و 1 × 107 اللوحة تشكيل وحدات (بفو)/مل. أساليب للأمثل الحصاد، وتجميد، ومعايرة الأرصدة الفيروسية موضحة هنا بالتفصيل. نحن توضيح البروتوكول المعروضة هنا بإنشاء اثنين من الفيروسات المؤتلف على التوالي التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء الحرة (بروتينات فلورية خضراء) (RSV-التجارة والنقل) أو الفيروسي M2-1 حشو للتجارة والنقل (RSV-M2-1-التجارة والنقل). ونحن تبين كيفية استخدام RSV-التجارة والنقل للتحديد الكمي للنسخ المتماثل RSV و RSV-M2-1-التجارة والنقل لتصور الهياكل الفيروسية، فضلا عن ديناميات الفيروسية البروتين في الخلايا الحية، باستخدام تقنيات الفحص المجهري الفيديو.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RSV البشرية هو السبب الرئيسي لدخول المستشفى لعدوى الجهاز التنفسي الحادة في الأطفال الرضع في جميع أنحاء العالم1. وبالإضافة إلى ذلك، يرتبط RSV عبء مرض كبيرة في البالغين مماثلة للأنفلونزا، مع معظم المستشفيات وعبء وفيات المسنين2. لا تتوفر أي اللقاحات أو الأدوية المضادة للفيروسات محددة حتى الآن ضد RSV، لكن الواعدة عقاقير جديدة في التنمية3،4. التعقيد والخفة لتقنيات القياس الكمي للضرب RSV تعرقل البحث عن الأدوية المضادة للفيروسات أو اللقاحات على الرغم من الجهود الكبيرة الحالية. ويستند التقدير الكمي للضرب RSV في المختبر عموما على طرق شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة، التي تتكون غالباً في تحليل تأثير سيتوباثيك بالفحص المجهري، إيمونوستينينج، والحد من البلاك فحوصات، الكمية عكس المنتسخة (قرة)-تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والمرتبط بالانزيم الممتز الاعتداء الاختبارات. الفيروسات مع مورثات معدلة والتعبير عن الجينات مراسل، مثل تلك الترميز للتجارة والنقل، وهي أكثر ملاءمة لمثل هذه العروض. بالإضافة إلى استخدام لوحة الآلي القراء، مراسل الجينات تحمل فيروسات المؤتلف يمكن جعل هذه فحوصات أكثر ملاءمة لأغراض التوحيد والفائق.

هو RSV المغلفة، نونسيجمينتيد فيروس الحمض النووي الريبي الشعور السلبي الذي ينتمي إلى جنس أورثوبنيوموفيروس بنيوموفيريداي العائلية، ترتيب مونونيجافيراليس5. هو الجينوم RSV رنا طاق واحد، والشعور السلبي لحوالي 15 كيلو بايت, التي تحتوي على منطقة فضله في الأطراف 3 'و 5' ودعا الزعيم ومقطورة و 10 وحدات النسخي ترميز البروتينات 11. يتم ترتيب الجينات على النحو التالي: 3 '-NS1, NS2، ن، ف، م، ش، ز، و، M2 (ترميز للبروتينات M2-1 و M2-2) و L-5'. الجيش الملكي النيبالي الجينوم محكم وتعبئتها بالبروتين النووي أ. استخدام الجيش الملكي النيبالي المجينية انكابسيداتيد كقالب، وتعتمد على الجيش الملكي النيبالي الفيروسية بوليميريز الحمض النووي الريبي (RdRp) سيضمن النسخ والنسخ المتماثل من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية. RdRp الفيروسية وتتألف من البروتين الكبيرة ل الذي يحمل النشاط بوليميراز النوكليوتيدات في حد ذاتها، عامل مساعد إلزامية فوسفوبروتين ف والبروتين M2-1 الذي يعمل كنسخ فيروسية6. في الخلايا المصابة، يستحث RSV تشكيل تضمينات هيولى دعا الهيئات إدراج (IBs). وقد لوحظت تضمينات هيولى شكلياً مشابهة ل عدة مونونيجافيراليس7،،،من89،10. الدراسات التي أجريت مؤخرا على فيروس داء الكلب، فيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة) وفيروس إيبولا و RSV أظهرت أن توليف الحمض النووي الريبي الفيروسية تحدث في الرابطة، التي يمكن اعتبارها المصانع الفيروسية8،،من911، وهكذا 12-يركز الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات الفيروسية المطلوبة لتوليف الحمض النووي الريبي الفيروسية المصانع الفيروس وتحتوي أيضا على البروتينات الخلوية13،،من1415،16، 17. IBs معرض سوبكومبارتمينت وظيفية تسمى حبيبات المرتبطة IB (إيباجس)، التي تركز سينثيتيزيد حديثا مرناً الفيروسية الوليدة جنبا إلى جنب مع البروتين M2-1. لا يتم كشف الجيش الملكي النيبالي الجينوم ول، ف ون في إيباجس. إيباجس هي هياكل كروية الحيوي صغيرة داخل الرابطة الذي يحمل خصائص السائل العضيات12. وعلى الرغم من الدور المركزي للرابطة في تكاثر الفيروس، المعروف القليل جداً حول طبيعة وهيكل داخلي، وتشكيل، وتشغيل هذه المصانع الفيروسية.

التعبير عن جينوم فيروس شلل الأطفال من كدنا مكن إنتاج استنساخ الفيروسية المعدية الأولى في عام 198118. للبحث عن فيروسات الحمض النووي الريبي السلبية واحد-الذين تقطعت بهم السبل، لم يكن حتى عام 1994 أن إنتاج أول فيروس داء الكلب عقب تعداء البلازميدات إلى خلايا19 وقع. وصدر أول بلازميد عكس الوراثية النظام القائم ل RSV في 199520. علم الوراثة العكسي أدت إلى إحراز تقدم كبير في مجال علم الفيروسات. إمكانية إدخال تعديلات محددة في الجينوم الفيروسي قدمت رؤى الحرجة في النسخ المتماثل والمرضية من فيروسات الرنا. ويسرت هذه التكنولوجيا أيضا إلى حد كبير تطوير لقاحات بالسماح التوهين محددة من خلال مجموعة مستهدفة من التعديلات. التعديلات الجينوم مما يتيح إجراء تقييم كمي سريع لتكاثر الفيروس إلى حد كبير تحسين فحص الأدوية المضادة للفيروسات، ودراسة لطريقة العمل.

على الرغم من أن وصف سابقا، يبقى الحصول على رسفس المعدلة وراثيا حساسة. هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لإنشاء نوعين من هرسف المؤتلف، على التوالي يعبر عن RSV-التجارة والنقل أو RSV-M2-1-التجارة والنقل. في هذا البروتوكول، يصف لنا تعداء الظروف اللازمة لإنقاذ الفيروسات التوليفية الجديدة، فضلا عن التضخيم بالحصول على الأرصدة الفيروسية مع ارتفاع عيار، مناسبة للتجريب استنساخه. بناء ناقلات الوراثة عكس في حد ذاتها لا يرد هنا. يصف لنا أساليب الحصاد المثلى وتجميد الأرصدة الفيروسية. الطريقة الأكثر دقة لقياس الجسيمات الفيروسية المعدية يظل البلاك المقايسة. الخلايا المصابة بتخفيف المسلسل من تعليق تم تحليلها والمحتضنة مع تراكب التي تحظر نشر الجزيئات الفيروسية الحرة في المادة طافية. في مثل هذه الظروف، سيكون فقط تصيب الفيروس الخلايا المتجاورة تشكل "لوحة" لكل الجسيمات المعدية الأولى. في مقايسة المعايرة RSV التقليدية، كشفت عنها immunostaining لويحات وتحسب تحت الملاحظة المجهرية. هذا الأسلوب مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط جداً مقايسة البلاك RSV استخدام تراكب ميكروكريستالاين سيليولوز التي تمكن من تشكيل لويحات مرئية بالعين المجردة. علينا إظهار كيف يمكن استخدام RSV-التجارة والنقل لتدبير RSV النسخ المتماثل، ومن ثم لقياس تأثير الأدوية المضادة للفيروسات. الجمع بين علم الوراثة العكسي وتكنولوجيا التصوير الحي، وعلينا أن نبرهن كيف يسمح RSV-M2-1-بروتينات فلورية خضراء العلماء إلى تصور م 2-1 في الخلايا الحية واتباع القوى المحركة لهياكل الفيروسي داخل الخلية، مثل الرابطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-المواد من إعداد

  1. شراء وسائل الإعلام الخلية (تعديل المصل انخفاض وسائط الإعلام، وسائل الإعلام الأساسية الدنيا [MEM]، 10 × الفنزويلية، ودولبيكو المتوسطة النسر [دميم])، كاشف تعداء، وميكروكريستالاين سيليولوز (انظر الجدول للمواد).
  2. الحصول على ناقلات التالية لعلم الوراثة العكسي: vector(s) الجينوم وناقلات التعبير ترميز البروتين ن والبروتينات المعقدة بوليميراز. ناقلات الجينوم تحتوي على الجينوم الكامل كدنا RSV-التجارة والنقل (ف-RSV-التجارة والنقل) و RSV-M2-1GFP (ف-RSV-M2-1GFP) مجرى النهر من المروج بوليميراز (بول T7) T7 الحمض النووي الريبي عاثية. ناقلات التعبير (سمي فن، فع، ع-L، وف-M2-1) تحتوي على تسلسل الترميز ن، ف، ل، أو M2-1 المصب T7 pol (انظر رينتشيفال et al.12 و راميش ويلتي et al.21 لمزيد من التفاصيل فيما يتعلق بنيات بلازميد).
  3. تعد وسائل الإعلام لثقافة خلية في بيئة معقمة وتعداء والعدوى. استخدام دميم مع مم 2 لتر-الجلوتامين تكملة مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) ووحدات مليلتر 1,000 البنسلين والستربتوميسين 1 ملغ/مل (أو بدون المضادات الحيوية) وتستكمل MEM مع مم 2 لتر-الجلوتامين مع FCS 0%، 2%، أو 10%، و 000 1 وحدة/مل البنسلين، و 1 ملغ/مل ستربتوميسين، سميت "المتوسطة كاملة" في البروتوكول التالية.
  4. الحصول على خلايا22 BSRT7/5 وجعل الأرصدة في إكمال المتوسطة وتستكمل مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في 1 إلى 2 × 106 خلايا/مل. المحافظة على مخزون الخلية في نيتروجين سائل. الحصول على خلايا HEp-2. خلايا HEp-2 في ذاكرة كاملة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في بيئة معقمة والثقافة BSRT7/5 خلايا في دميم كاملة.
  5. إعداد 10 x RSV حفظ حلاً (0.5 م حبيس و 1 م MgSO4 [الرقم الهيدروجيني 7.5] في الماء) في بيئة معقمة.
  6. الحصول على مجهر مقلوب الأسفار متوافق مع القياسات fluorescence بروتينات فلورية خضراء ومتوافقة مع التصوير الحي إذا كان من الضروري رصد عدوى. الحصول على قارئ ميكروسكوبية متوافق مع القياسات fluorescence بروتينات فلورية خضراء كوانتيتيشن من النسخ المتماثل RSV-التجارة والنقل.

2-الإنقاذ ومرور أول فيروس المؤتلف

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية في بيئة معقمة، باستخدام فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.

  1. قبل تعداء، اليوم الإدلاء بتعليق السطر خلية BSRT7/5 في 5 × 105 خلايا/مل في المتوسط كاملة. توزيع 2 مل تعليق الخلية الواحدة وكذلك في لوحة 6-جيدا. إعداد بئر واحدة للفيروس الذي هو الذهاب إلى إنقاذ وبئر واحدة إضافية للمراقبة السلبية. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. تحقق من صحة الخلايا في التقاء 80%-90% في اليوم التالي.
  2. إلغاء تجميد الوراثة عكس ناقلات (من الخطوة 1، 2) ف-RSV-التجارة والنقل وف-RSV-M2-1-التجارة والنقل، فضلا عن فن، فع، ع-L، وف-M2-1. مزيج، لكل فيروس الإنقاذ، 1 ميكروغرام من فن وع-ع، 0.5 ميكروغرام لرتبة ف-L، 0.25 ميكروغرام لرتبة ف-M2-1، و 1.25 ميكروغرام لرتبة ف-RSV (بروتينات فلورية خضراء أو بروتينات فلورية خضراء M2 1) في أنبوب.
    ملاحظة: يمكن أن تستخدم ناقلات التعبير مختلفة ن ف، ل وم 2-1؛ ومع ذلك، قد نسبة البروتينات الإبقاء على. تنفيذ مراقبة سلبية بالاستعاضة عن ناقلات ف RSV مع موجه فارغ.
  3. المضي قدما إلى تعداء، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة كاشف تعداء (انظر الجدول للمواد).
    1. إضافة 250 ميليلتر من المصل انخفاض متوسط لناقلات مختلطة. في أنبوب آخر، وتمييع 10 ميليلتر من تعداء الكاشف في 250 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط. بلطف دوامة كل الأنابيب وانتظر دقيقة 5 ميكس محتويات كلا أنابيب والانتظار لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. شطف الخلايا BSRT7/5 مع 1 مل من المصل انخفاض المتوسطة وتوزيع 1.5 مل MEM مع السفح 10% دون المضادات الحيوية كل بئر. إذا لزم الأمر، احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى يتم الانتهاء في الحضانة هو موضح في الخطوة 2.3.1.
    3. إضافة 500 ميليلتر من مزيج تعداء أعد الخطوة 2.3.1 إلى بئر عندما انتهت فترة الحضانة 20 دقيقة. وضع الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 3 أيام. لا تقم بتغيير الثقافة المتوسطة للخلايا خلال تعداء.
  4. مراقبة fluorescence التجارة والنقل (الإثارة في 488 نانومتر) والانبعاثات في 515 – 535 نانومتر تحت مجهر مقلوب الأسفار الساعة 20 x التكبير 1 x يوميا لرصد كفاءة الإنقاذ، في التجارة والنقل باستخدام تصفية.
  5. في اليوم الثاني بعد تعداء، بذور الخلايا لمرور أول من الفيروسات تم إنقاذهم. إعداد تعليق الخلايا HEp-2 في 5 × 105 خلايا/مل في المتوسط كاملة. توزيع 2 مل تعليق الخلية الواحدة وكذلك في لوحة 6-البئر (بئر واحدة كل الفيروسات للإنقاذ ومراقبة سلبية واحدة).
  6. اليوم الثالث من تعداء الخلايا الصفر في كل من لوحة BSRT7/5 ترانسفيكتيد 6-جيدا، جيدا باستخدام مكشطة مختلفة لكل بئر. نقل كل المحتوى جيدا (الخلايا والمادة طافية) في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2 عقيمة. دوامة كل أنبوب بقوة على الأقل 30 ثانية الإفراج عن الفيروس الذين تم إنقاذهم من أغشية الخلايا.
    ملاحظة: وهذا يتوافق مع مرور 0 (P0) الفيروس الذين تم إنقاذهم (الشكل 1).
  7. استخدام تعليق P0 فيروسية جديدة لتنفيذ التضخيم الأولى من الفيروسات تم إنقاذهم.
    1. إزالة المصنف المتوسطة الثقافة من لوحة 6-بئر HEp-2 قبل يوم واحد (راجع الخطوة 2، 5) وإضافة بسرعة 500 ميليلتر من تعليق P0 (من الخطوة 2، 6) كل بئر. ضع لوحة HEp-2 في 37 درجة مئوية في الروك انظر من رأي للانفعالات لينة ح 2.
    2. إزالة وتجاهل 500 ميليلتر من العدوى وإضافة 2 مل MEM مع FCS 2%. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 3 أيام. هذا وسوف تنتج مرور أول (P1) من الفيروسات تم إنقاذهم (الشكل 1).
  8. أضف 1/10 حجم 10 x RSV حفظ الحل (0.5 م حبيس و 1 م MgSO4 [الرقم الهيدروجيني 7.5]) إلى تعليق P0 المتبقية (من الخطوة 2، 6). دوامة microtubes بقوة عن 5 s وقاسمه المحتويات في الأنابيب المبردة المسمى بواسطة العلامات المقاوم للكحول. تزج أنابيب على الأقل 1 ح في الكحول بريكوليد في-80 درجة مئوية، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  9. تيتراتي الأسهم P0 (راجع الخطوة 2، 6) لكل الذين تم إنقاذهم الفيروسات (انظر الفرع 4 للمعايرة ميكروكريستالاين سيليولوز).
  10. مراقبة fluorescence التجارة والنقل (الإثارة في 488 نانومتر) والانبعاثات في 515 – 535 نانومتر الخلايا HEp-2 مصاب بتعليق P0 تحت مجهر مقلوب الأسفار في التكبير x 20 x 1 يوميا لرصد العدوى. مراقبة تحت مجهر برايتفيلد مظهر سينسيتيا الصغيرة والخلية المفرزة التي تعكس تأثير سيتوباثوجينيك RSV (CPE) (انظر الشكل 2).
  11. علما بأن فشل عملية الإنقاذ إذا الأسفار ولا CPE مرئياً بعد 2-3 أيام.
  12. تجميع مرور أولى (P1) في يوم 3 أو 4 كما هو موضح في الخطوة 2، 6. وباختصار، تتخلص من الخلايا، وجمع الخلايا والمادة طافية معا، دوامة لهم، إضافة حل الحفظ كما هو موضح في الخطوة 2.8، الكوة العينة، وتجميدها.
  13. تيتراتي (انظر القسم 4 لفحص المعايرة) وتضخيم مرور الأولى (انظر القسم 3 للتضخيم).

3-تضخيم الفيروسات تم إنقاذهم

ملاحظة: البروتوكول التالي يصف التضخيم الفيروسات الذين تم إنقاذهم في قارورة2 75 سم. تكييف حجم قارورة على وحدة التخزين المطلوبة وتعدد المطلوب للعدوى (وزارة الداخلية). ويبين الجدول 1 كميات لقوارير مختلفة. تنفيذ كافة الخطوات التالية في بيئة معقمة في فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.

  1. إعداد تعليق الخلايا HEp-2 في 5 × 105 خلايا/مل في المتوسطة كاملة، في اليوم السابق التضخيم. توزيع 15 مل تعليق الخلية الواحدة 75 سم2 قارورة واحتضان قوارير في 37 درجة مئوية و 5% CO2. إعداد قارورة واحدة كل الفيروسات تضخيم.
  2. في اليوم التالي لبدء الحضانة، تحقق من صحة الخلايا روافد 80%-100%.
  3. تمييع تعليق الفيروسية من الخطوة 2.12 في MEM دون FCS للحصول على تعليق 3 مل في 50,000 بفو/مليلتر (المقابلة لوزارة الداخلية 0.01 بفو/خلية).
  4. إزالة المتوسطة وإضافة تعليق الفيروسية 3 مل بسرعة. مكان قارورة على 37 درجة مئوية في الروك انظر من رأي للانفعالات لينة ح 2.
  5. إزالة وتجاهل العدوى وإضافة 15 مل MEM مع FCS 2%. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 2-4 أيام.
  6. تحقق من مورفولوجيا الخلايا والأسفار التجارة والنقل (الإثارة في 488 نانومتر) والانبعاثات في 515 – 535 نانومتر تحت مجهر مقلوب الأسفار الساعة 20 x التكبير بغية تقدير الوقت المناسب للحصاد الفيروسات. لاحظ أن هذا هو عادة عندما يتم فصل 50%-80% طبقة الخلايا HEp-2 بسبب CPE RSV الذي يحدث بين 48 و 72 ساعة بوستينفيكشن (بي) (انظر الشكل 3).
  7. تتخلص من كافة الخلايا باستخدام مكشطة خلية. جمع الخلايا والمادة طافية معا وتحويلها إلى أنبوب الطرد مركزي 50 مل.
  8. أضف 1/10 حجم 10 × حل الحفظ RSV (0.5 "م حبيس" و 1 م MgSO4 [الرقم الهيدروجيني 7.5]). دوامة الأنابيب قوة ل 5 ق وتوضيح التعليق الطرد المركزي 5 دقائق في 200 x ز.
  9. نقل المادة طافية إلى أنبوب 50 مل. الدوامة بإيجاز وقاسمه التعليق في الأنابيب المبردة المسمى بواسطة العلامات المقاوم للكحول. تزج الأنابيب في الكحول بريكوليد-80 درجة مئوية على الأقل 1 ح وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  10. إلغاء تجميد أحد مختبرين تيتراتي بتعليق الفيروسية (انظر القسم 4).

4-لوحة معايرة الإنزيم

  1. إعداد لوحات 12-جيدا للمعايرة في اليوم قبل إجراء الفحص معايرة (ستة آبار سيتعين أن تيتراتي أنبوب واحد من الفيروسات). البذور الآبار مع 1 مل خلايا HEp-2 في 5 × 105 خلايا/مل في المتوسط كاملة.
  2. وفي اليوم التالي إعداد تعليق عقيمة ميكروكريستالاين سيليولوز (2.4% [w/v] في الماء) (انظر الجدول للمواد).
    1. تفريق 2.4 غرام مسحوق ميكروكريستالاين سيليولوز في 100 مل ماء المقطر، استخدام محرض مغناطيسي قياسية، حتى حل كامل من المسحوق (عادة ح 4 – 12). اﻷوتوكﻻف التعليق على 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وتخزينه في درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
      ملاحظة: في ظل هذه الظروف، التعليق مستقرة لمدة سنة واحدة.
    2. بعد فتح الحل في بيئة معقمة، احفظها في 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر. دائماً مزيج تعليق قبل الاستخدام (بالمصافحة باليد أو فورتيكسينج) للتأكد من أنها متجانسة.
  3. إعداد 2 × MEM في بيئة معقمة. تمييع MEM التجارية 10 x مع الماء المعقم وإضافة لام الجلوتامين و 1,000 وحدة/مل البنسلين والستربتوميسين 1 ملغ/مل. اهتز إضعاف قوة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: نفذ الخطوات 4.4-4.10 في بيئة معقمة باستخدام فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.
  4. إعداد ست أنابيب تحتوي على 900 ميليلتر من MEM دون FCS كل الفيروسات تكون معاير (أنابيب المعايرة). ذوبان الجليد مختبرين الفيروس، دوامة لهم قوة ل 5 s، ونقل 100 ميليلتر للمعايرة أول أنبوب.
  5. أداء إضعاف إضعاف 6 x، كما يلي. إضافة 100 ميكروليتر من الفيروس إلى 900 ميكروليتر من المتوسطة في الأنبوب الأول، وضع الغطاء على الأنبوب، ومزيج محتوياتها قبل فورتيكسينج لبضع ثوان. تغيير التلميح على الماصة، إضافة 100 ميليلتر لتمييع الأولى إلى 900 ميليلتر من المتوسطة في الأنبوب الثاني، وضع الغطاء على أنبوب ودوامه. كرر الإجراء حتى أنبوب السادسة.
    ملاحظة: من المهم جداً لتغيير التلميح لكل تخفيف.
  6. كتابة الفيروس اسم وتخفيف حظيرة على لوحات HEp-2 12-جيدا. إضافة علامة لمطابقة اللوحة وغلافه نظراً لأنهم يمكن فصلها خلال تلطيخ (الخطوة 4.9). إزالة المتوسطة من اللوحات وتوزيع 400 ميليلتر لتمييع واحد كل بئر. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 2، للفيروس الامتزاز.
    ملاحظة: تغيير تلميح ماصة بين كل العدوى أو تنطلق من أدنى إلى أعلى تركيز مع نصيحة نفسه. تطعيم سلسلة محدودة من لوحات (1 إلى 2) في نفس الوقت لتجنب الخلايا التجفيف.
  7. إعداد تراكب ميكروكريستالاين سيليولوز أثناء الامتزاز الفيروس (إعداد عفوي). للحصول على 100 مل تراكب، مزيج من 10 مل تعليق 2.4% ميكروكريستالاين سيليولوز، 10 مل 2 × MEM، و 80 مل من MEM مع FCS 2%.
    1. ضبط درجة الحموضة 2 × MEM إلى حوالي 7.2 بمحلول بيكربونات الصوديوم عقيمة 7.5 في المائة، بعد أن مؤشر اللون. أضف تعليق ميكروكريستالاين سيليولوز والذاكرة والمزيج بقوة.
  8. تضاف في نهاية الحضانة ح 2، 2 إلى 3 مل تراكب لكل بئر من لوحات 12-جيدا دون إزالة العدوى. كن حذراً لتجنب تلوث الآبار المجاورة مع إينوكولومس عيار الفيروسية عالية. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 6 أيام. لا تقم بتحريك اللوحة ولا تقم بتحريك الحاضنة أثناء الحضانة.
  9. المضي قدما بوصمة عار الخلايا، باستخدام الحل البنفسجي كريستال (8% الكريستال البنفسجي [v/v] ونسبة 2% فورمالدهايد [v/v] 20% إيثانول [v/v] في المياه).
    1. حماية سطح العمل للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع ورقة (البنفسجي كريستال بشدة ألوان السطوح).
    2. تهز بلطف لوحات الإقلاع تراكب ميكروكريستالاين سيليولوز. إزالة في supernatants وتغسل الخلايا 2 x 1 x مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). التعامل مع لوحات واحداً تلو الآخر لتجنب الخلايا التجفيف. أضف 1 – 2 مل من محلول الكريستال البنفسجي وانتظر 10-15 دقيقة إزالة الحل، التي يمكن إعادة استخدامها لتلوين لوحة اللاحقة.
    3. تزج بلوحات والأغطية في بليتش جديدة لبضع ثوان، ومن ثم غسلها جيدا بماء الصنبور. لاحظ أن يتم تطهير لوحات ويغطي بالمبيض.
    4. وضع لوحات وأغطية على مناشف ورقية والسماح لهم الجافة. الجافة اللوحات في درجة حرارة المحيطة بعد الشطف المياه وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. للتخزين فترات طويلة (شهور)، تبقى لوحات محمية من الضوء لحماية اللون. لاحظ أن إذا تفقد الخلايا على التلون، أنها يمكن أن تكون ملطخة مرة أخرى كريستال بنفسجي.
  10. حساب التتر الفيروس. عد لويحات في آبار لوحات الجافة، والتي تكون مرئية بالعين المجردة. تأكد من أن عدد اللوحات لتخفيف مختلفة مترابطة (عامل 10 بين كل تمييع). اختر البئر التي لويحات أسهل الاعتماد. تقييم عدد لويحات مقابل حجم العدوى والتخفيف.
    ملاحظة: على سبيل المثال قدمت في الشكل 4، تحسب لويحات 21 في التخفيف 10-5 . وهذه تناظر عيار من
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2

5-استخدام الفيروس المؤتلف هرسف-التجارة والنقل لمراقبة النسخ المتماثل فيروسية في الخلايا تعامل مع الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة أو الأدوية المضادة للفيروسات

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات باستثناء 5.1 و 5.2.5 في بيئة معقمة باستخدام فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.

  1. رصد تأثير الجينات الخلوية إسكات على الضرب RSV
    ملاحظة: تعتمد البروتوكول تعداء على الكاشف (انظر الجدول للمواد).
    1. إعداد لوحات 96-جيدا لقياس التجارة والنقل. يومين قبل الفحص، نظراً للحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA)، تعد حلاً المصل انخفاض الوسائط التي تحتوي على siRNA بتركيز 100 نانومتر وكاشف تعداء siRNA تمييع في 1/500. احتضان الحل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة 25 ميليلتر من الحل إلى الآبار التي بليت أعدت في 5.1.1 (في ثلاث نسخ). بذور الآبار مع ميليلتر 75 من تعليق لخلايا A549 في 4 × 105 خلايا/مل في المتوسط كاملة دون المضادات الحيوية للحصول على تركيز خلية الأخيرة من 3 × 105 خلايا/مل. احتضان لوحة ح 48 شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
      ملاحظة: أن تركيز siRNA النهائي هو 25 نانومتر وحجم الكاشف تعداء النهائي 0.5 ميليلتر/جيد).
    3. تصيب الخلايا كما يلي. إزالة المتوسطة من الآبار. إضافة 100 ميليلتر من تعليق RSV-التجارة والنقل في 50,000 بفو/ملليلتر واحتضانها ح 2 في CO 37 درجة مئوية و 5%2. إزالة تعليق الفيروسية وإضافة 100 ميليلتر من دميم مع FCS 2% ودون الأحمر الفينول. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    4. في 24 ساعة وبي ح 48، قياس الأسفار، واستخدام سبيكتروفلوروميتير تعيين لموجات الإثارة والانبعاثات من 488 و 520 نانومتر، على التوالي (هو التعبير عن الأسفار في الأسفار النسبية وحدات). استخدام خلايا A549 مصاب كمعايير لمستويات الأسفار والخلفية.
      ملاحظة: الخلايا بحاجة إلى أن تكون ثابتة مع بارافورمالدهيد 4% (PFA) قبل قياس لهم دون غطاء لوحة.
  2. تقييم للمخدرات تثبيط استخدام RSV-بروتينات فلورية خضراء
    1. إعداد لوحات 96-جيدا لقياس التجارة والنقل. في اليوم السابق الفحص، البذور الآبار مع 100 ميليلتر من تعليق الخلايا HEp-2 في 5 × 105 خلايا/مل في المتوسط كاملة دون الأحمر الفينول.
    2. إعداد إضعاف مسلسل اختبار المخدرات (AZ4316 في هذا المثال) في MEM تكملها FCS 2% والمضادات الحيوية (50 ميليلتر للبئر الواحد). إعداد تعليق فيروسية في 10,000 بفو/مل في MEM دون عامل الأوعية الدموية stromal (SVF) ودون الفينول الأحمر (50 ميليلتر للبئر الواحد).
    3. إزالة المتوسطة من HEp 96-جيدا-2 لوحة وإضافة 50 ميليلتر من تعليق المخدرات و 50 ميليلتر من تعليق الفيروسية (في ثلاث نسخ). أداء مرض صورية بالتوازي كعنصر تحكم.
      ملاحظة: قد تكون مختلطة بتمييع المخدرات وتعليق الفيروسية قبل إضافتها على الخلايا، أو يمكن إضافتها بشكل تسلسلي.
    4. احتضان لوحة ح 48 شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
    5. قياس الأسفار، باستخدام سبيكتروفلوروميتير كما هو موضح في الخطوة 5.1.4. تستخدم الخلايا المصابة موك HEp-2 كمعايير لمستويات الخلفية الفلورية.

6-وصف للتعريب M2-1 في فيفو بفيروس RSV-M2-1-بروتينات فلورية خضراء المؤتلف

ملاحظة: نفذ الخطوات 6.1 و 6.2 في بيئة معقمة، باستخدام فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.

  1. إعداد تعليق الخلايا HEp-2 في 5 × 105 خلايا/مل في المتوسط كاملة. ويعيش البذور 1.5 مل تعليق خلية في 35 مم طبق بيتري بيرمينت CO2 وتكييفها للتصوير.
  2. إجراء العدوى اليوم بعد البذر بفيروس RSV-M2-1-التجارة والنقل في وزارة الداخلية 1، كما هو موضح في الخطوات 3، 3 – 3.5 (إزالة المتوسطة، إضافة ميليلتر 500 إلى 1 مل العدوى، واحتضان العينة في 37 درجة مئوية بينما تهتز برفق ح 2؛ والعدوى وإضافة 1.5 مل MEM مع 2 % سفح المنحدر القاري). احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 للوقت المطلوب (IBs سوف تبدأ في الظهور من 10 ح بي).
  3. يسخن الدائرة المجهر المقلوب مجهزة 40 x 100 x أهداف في 37 درجة مئوية، قبل وضع طبق بتري يحتوي على الخلايا المصابة في المرحلة الحضانة. افتح العرض2 CO والانتظار لتحقيق الاستقرار على التركيز.
  4. القيام بالتصوير مع المرشحات المتوافقة مع التجارة والنقل، وتحت تردد إثارة منخفض الكثافة والصورة (من 1 إلى صورة 0.1 في الدقيقة) لتقليل الضيائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل، يمكننا وصف بروتوكول مفصلاً لإنتاج فيروسات RSV المؤتلف معربا عن بروتين فلوري (الشكل 2). في برسف-التجارة والنقل، تم إدخال الجين التجارة والنقل بين الجينات ف وم، كما هو موضح للجينات الكرز في الأعمال المنشورة سابقا21. في برسف-م 2-1-التجارة والنقل، الجينات M2 يمسها وجينات إضافية الترميز م 2-1-التجارة والنقل تم إدراجها بين الجينات SH وز12. الخطوة الأولى، المقابلة لإنقاذ الفيروس في الخلايا BSRT7/5، ويظهر ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم طريقة لإنقاذ المؤتلف رسفس من البلازميدات الخمسة، وعلى التضخيم. القدرة على التلاعب جينوم الفيروسات أحدث ثورة في بحوث علم الفيروسات لاختبار الطفرات والتعبير عن جينات إضافية أو بروتين فيروسي المعلمة. RSV لدينا وصف والمستخدمة كمثال في هذا المقال هو فيروس التعبير عن جين مراسل، RSV-بروتينات فلورية خضراء (غير منشور)، وتعرب عن تنصهر بروتين M2-1 ل علامة التجارة والنقل12. إنقاذ RSV تحديا وتتطلب الممارسة. كفاءة تعداء أمر بالغ الأهمية، اعتماداً على تشكيلة الحكمة من الكاشف تعداء وتحسين سابقة من بروتوك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدكتور تشين يو من استرا زينيكا R & D بوسطن، ماجستير، الولايات المتحدة الأمريكية، لتوفير الدواء AZD4316. الكتاب ممتنون لمنصة سيماجيس للوصول إلى المجهر أوليمبوس ScanR، الذي كان يدعمه المنح المقدمة من المنطقة القارسة (الصحة واحد خافت). الكتاب الاعتراف بدعم من INSERM وجامعة فرساي ساينتكوينتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
35 مم & طبق صغير لتصوير الخلايا الحيةIbidi81156
A549ATCCATCC CCL-185
Avicel RC-591FMC BioPolymerAvicel RC-591تتوفر المعلومات الفنية وغيرها من المعلومات حول Avicels على http://www.fmcbiopolymer.com. يحفظ في درجة حرارة الغرفة. تم تحسين البروتوكول في الخطوة 4 لهذا الكاشف.
BSRT7/5غير متوفر تجاريا، انظر المرجع 22. Buchholz et al. 1999
محلول بنفسجي كريستاليمجهر سيجماHT90132
فلوري للملاحظاتأوليمبوسIX73 مجهر
مجهر مضان للفحص المجهريأوليمبوسScanR مجهر
HEp-2ATCCCCL -23
HEPES & GE ؛ 99.5٪SigmaH3375
L-Glutamine (200 ملم) ThermoFisherScientific25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENTThermoFisherScientific 11668019 Protocol في الخطوة 2.3. تم تحسينه لهذا الكاشف.
MEM (10x) ، بدون جلوتامينThermoFisher Scientific11430030
MEM ، مكمل GlutaMAXThermoFisher Scientific41090-028
MgSO4 Reagent Plus ، & ge ؛ 99.5٪SigmaM7506
Opti-MEM I مصل متوسطمتوسط ThermoFisher Scientific51985-026
محلول مائي بارافورمالدهيد ، 32٪ ،علوم المجهر الإلكترونيEM 15714
البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل)
غير متوفرةانظر المرجع 21. Rameix-Welti et al. 2014
انظر Saw RockerVWR444-0341
Si RNA GAPDHDharmaconON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		SMARTpool و 3 من 4 siRNAs فردية صممها Dharmacon.
Si RNA IMPDH2DharmaconON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		SMARTpool من 4 siRNAs فردية صممها Dharmacon.
المراجع والتسلسلات الفردية
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC ؛
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV NDharmaconON-TARGETplus مخصص siRNAUUCAGAAGAACUAGAGGCUAU و UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NTDharmaconON-TARGETplus كاشف نقل SiRNA غير المستهدف للتجمع
DharmaconDharmaFECT 1 المرجع: تم تحسين بروتوكول T-2001-03في الخطوتين 5.1.1.و 5.1.2 لهذا الكاشف.
بيكربونات الصوديوم 7.5 ٪ محلولThermoFisher Scientific25080094
SpectrofluorometerTecan TecanM200PRO
أوليمبوسأوليمبوس من الدرجة بلازميدات ThermoFisher Scientific 15140122 تجاريا اللانهائي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
  3. DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
  4. DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
  5. Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
  6. Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
  7. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
  8. Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958(2010).
  9. Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
  10. Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
  11. Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
  12. Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563(2017).
  13. Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
  14. Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
  15. Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
  16. Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
  17. Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
  18. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  19. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
  20. Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
  21. Rameix-Welti, M. -A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104(2014).
  22. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
  23. Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
  24. Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
  25. McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
  26. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
  27. Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
  28. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
  29. Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
  30. Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
  31. Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
  32. Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
  33. DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
  34. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  35. Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BSR T7 5 HEp 2 GFP

مقالات ذات صلة