الهدف من هذا البروتوكول هو وصف نهج لتحليل سلوك الخلايا الجذعية العصبية الكبار / الخلايا السلف ردا على التلاعب الكيميائي من دائرة عصبية محلية محددة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مراقبة الدائرة تنظيم محدد من خلايا السلائف العصبية فرس النهر الكبار
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تكوين الأعصاب لدى البالغين هو عملية ديناميكية تقوم من خلالها الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) التي تم تنشيطها حديثًا في المنطقة تحت الحبيبية (SGZ) من الجبس الدنتات (DG) بإنشاء خلايا عصبية جديدة، والتي تندمج في دائرة عصبية موجودة وتساهم في وظائف فرس النهر المحددة . الأهم من ذلك، تكوين الأعصاب الكبار هو عرضة للغاية للمحفزات البيئية، والذي يسمح لتنظيم تعتمد على النشاط من مختلف الوظائف المعرفية. مجموعة واسعة من الدوائر العصبية من مناطق الدماغ المختلفة ينظم هذه الوظائف المعرفية المعقدة. ولذلك من المهم أن نفهم كيف تنظم الدوائر العصبية المحددة تكوين الأعصاب للبالغين. هنا، ونحن نصف بروتوكول للتعامل مع نشاط الدائرة العصبية باستخدام مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل مصمم الأدوية (DREADDs) التكنولوجيا التي تنظم NSCs وذرية حديثي الولادة في القوارض. ويشمل هذا البروتوكول الشامل حقن الجسيمات الفيروسية المجسمة، والتحفيز الكيميائي للدوائر العصبية المحددة، والإدارة التناظرية الثيميدين، ومعالجة الأنسجة، ووضع العلامات المناعية، والتصوير البؤري، والتصوير تحليل مراحل مختلفة من الخلايا العصبية السلائف. يوفر هذا البروتوكول تعليمات مفصلة حول تقنيات استرجاع المستضد المستخدمة لتصور NSCs وذريتها ويصف طريقة بسيطة، ولكنها فعالة لتعديل دوائر الدماغ باستخدام كلوزابين N-أكسيد (CNO) أو CNO التي تحتوي على مياه الشرب و الفيروسات التي تعبر عن الفزع. تكمن قوة هذا البروتوكول في قدرته على التكيف لدراسة مجموعة متنوعة من الدوائر العصبية التي تؤثر على تكوين الأعصاب للبالغين المستمدة من NSCs.
المقدمة
تكوين الأعصاب للبالغين هو عملية بيولوجية يتم من خلالها ولادة الخلايا العصبية الجديدة في شخص بالغ ودمجها في الشبكات العصبية القائمة1. في البشر ، تحدث هذه العملية في سايروس dentate (DG) من الحصين ، حيث يولد حوالي 1400 خلية جديدة كل يوم2. هذه الخلايا موجودة في الجزء الداخلي من المديرية العامة، التي تأوي محراب عصبي، يسمى المنطقة تحت الحبيبية (SGZ). هنا، تخضع الخلايا الجذعية العصبية البالغة (NSCs) لعملية تنموية معقدة لتصبح خلايا عصبية تعمل بكامل طاقتها تساهم في تنظيم وظائف الدماغ المحددة، بما في ذلك التعلم والذاكرة، وتنظيم المزاج، واستجابة الإجهاد3 ،4،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نورث كارولينا تشابل هيل على جميع الإجراءات بما في ذلك المواضيع الحيوانية.
1. حقن مجسمة من الجسيمات الفيروسية
- تحديد الدوائر العصبية المعنية. هذا سوف يحدد الفيروس وخط الماوس المستخدمة للإجراء التالي.
ملاحظة: على سبيل المثال، يتم تحفيز إسقاطات الخلايا الطحلبية التعارضية لتحليل آثارها على تكوين الأعصاب للبالغين. يتم تسليم الجسيمات الفيروسية ترميز AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry إلى المدير ية من 5ht2A-Cre الفئران15. - إدارة ميلوكسيكام (5 ملغ / كغ، تحت الجلد) ما لا يقل عن 30 دقيقة قبل العملية لتوفير التسكين الوقائي ل8 أسابيع من....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد الإجراءات التجريبية المذكورة أعلاه (الشكل1A،B) ، تمكنا من تحديد آثار تحفيز إسقاطات الخلايا الطحلبية التعارضية على محراب الأعصاب داخل الحصين. من خلال استخدام فيروس "كيكيو" الذي يعتمد على "كري" و"تحفيز" و"DREADD" المقترن بخلية طحلبية تحمل علامة 5-HT2A Cre-line، تمكنا من تنشيط الإسقاطات المحفزة بشكل انتقائي من الخلايا الطحلبية على الـ DG المضادة وقررنا أن الخلية الطحلبية القوية تعزيز التحفيز تنشيط الخلايا الجذعية (الشكل1C). تحققنا من التسليم ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الهدف من هذا البروتوكول هو تقييم كيفية التلاعب الدوائر العصبية محددة ينظم تكوين الأعصاب فرس النهر الكبار في الجسم الحي باستخدام سلسلة من تقنيات الكيمياء المناعية. تنظيم النشاط المعتمد على النشاط من تكوين الأعصاب الكبار بوساطة دوائر عصبية محددة هو تقنية قيمة مع إمكانية كبيرة لإجراء تعديلات لدراسة مجموعة متنوعة من الدوائر العصبية. نجاح هذه الأنواع من التجارب يعتمد على عوامل متعددة بما في ذلك التسليم الفيروسي الدقيق، واختيار الفيروسية المناسبة للتلاعب المطلوب، والتسليم السليم للنظير الثيميدين، وعمر الحيوان، وكفاءة تلطيخ الم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تلقى L.J.Q. الدعم من المعهد الوطني للصحة العقلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة في إطار ملحق التنوع R01MH111773، فضلا عن منحة تدريبية T32 T32T007431-20. تم دعم هذا المشروع من المنح المقدمة إلى J.S. من NIH (MH111773, AG058160, و NS104530).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 24 لوحة بئر | ثيرمو فيشر Scientific | 07-200-84 | |
| 48 بئر لوحة | دنفيل Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| الكحول 70٪ الأيزوبروبيل | ثيرمو فيشر العلمي | 64-17-5 | |
| وسادات إعداد الكحول | ثيرمو فيشر العلمية | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES ؛ RRID: AB_2314882 | |
| مكافحة الماعز DCX | سانتا كروز | القط # SC_8066 ؛ RRID: AB_2088494 | |
| مضاد للفأر Tbr2 | ثيرمو فيشر العلمي | 14-4875-82 ؛ RRID: AB_11042577 | |
| محلول البيتادين (بوفيدون اليود)مخزون | الأمازون | ||
| [.1M] حامض الستريك (21 جم / لتر حامض الستريك) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- أكسيد | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| برنامج متحد البؤر (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (أسود) | |
| كبريتات النحاس (II) مسحات قطنية خماسية | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Amazon | |||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| حساسة مسح Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| مثقاب 0.5 مم | أدوات العلوم الدقيقة | 19007-05 | |
| الإيثيلين جلايكول | الحرارية فيشر العلمية | E178-1 | |
| إبرة هاميلتون 2 بوصة | شركة Hmailton | 7803-05 | |
| حقنة هاميلتون 5 & L موديل 75 RN | Hmailton مرجع | الشركة: 87931 | |
| مثقاب عالي السرعة | Foredom | 1474 | |
| مضخة تسريب | جهاز هارفارد | 70-4511 | |
| محلول ملحي عن طريق الحقن | للرعاية الصحية على جانب الجبل | NDC 0409-4888-20 | |
| حقنة الأنسولين | BD محاقن | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax للحيوانات الصغيرة | KOPF | Instruments موديل 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (منتج إزالة الشعر) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4٪ | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| محلول الفوسفات المخزن (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet مرهم | Puralube | ||
| Slide Rack 20 وحدة الشريحة | علم المجهر الإلكتروني | 70312-24 | |
| حامل رف الشريحة | علم المجهر الإلكتروني | 70312-25 | |
| وسادة تسخين الصغيرة | K & H | ||
| السكروز | سيجما ألدريتش | S0389 | |
| سوبر PAP قلم طرف 4 مم | PolySciences | 24230 | |
| مشرط جراحي | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| سترات ثلاثي الصوديوم [0.1 م] سترات ثلاثي الصوديوم (29.4 جم / لتر سترات ثلاثية الصوديوم) | سيجما ألدريتش | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| ملاقط | لاصقة مناديل أمازون | ||
| البيطرية بوند | 3M | 1469SB |
المراجع
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
