مقالة منهجية

تصور ضعف الحواجز بطانية والدبقيه نيوروفاسكولار وحدة خلال النخاع الذاتية التجريبية في فيفو

DOI:

10.3791/59249

⸱

مارس 26, 2019

 , 
1Theodor Kocher Institute, University of Bern

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولات للتحقيق في الأضرار بوحدة neurovascular خلال النخاع الذاتية التجريبية المجراة. ونحن على وجه التحديد معالجة كيفية تحديد نفاذية حاجز الدم في الدماغ والنشاط جيلاتيناسي المعنية بالهجرة الكريات البيض عبر ليميتانس إطلاق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وحدة neurovascular (NVU) تتألف من خلايا بطانية microvascular تشكيل حاجز الدم في الدماغ (BBB)، غشاء بطانية مع جزءا لا يتجزأ من بيريسيتيس، وليميتانس إطلاق تتألف من الغشاء الطابق السفلي متني وأستروسيتيك نهاية-تغذية تبني الجانب أبلومينال من ميكروفيسيلس الجهاز العصبي المركزي (CNS). بالإضافة إلى الحفاظ على الجهاز العصبي المركزي يتحكم التوازن NVU الاتجار بالخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي. أثناء إيمونوسورفيلانسي للجهاز العصبي المركزي العدد المنخفض لتنشيط الخلايا الليمفاوية يمكن عبور حاجز غشائي دون التسبب في اختلال وظيفي BBB أو الأمراض السريرية. على النقيض من ذلك، أثناء نيوروينفلاميشن كما هو الحال في التصلب المتعدد أو نموذجها الحيواني النخاع الذاتية التجريبية (إي) عددا كبيرا من الخلايا المناعية يمكن أن يعبر بي بي بي، وبعد ذلك إطلاق ليميتانس في نهاية المطاف التوصل إلى حمة الجهاز العصبي المركزي وتؤدي إلى الأمراض السريرية. هجرة الخلايا المناعية إلى حمة الجهاز العصبي المركزي وبالتالي عملية من خطوتين ينطوي هجرة متسلسلة عبر حاجز غشائي والدبقيه NVU توظيف الآليات الجزيئية المتميزة. إذا بعد مرورهم عبر حاجز غشائي، خلايا تي اللقاء بهم مستضد المشابهة في ارتشاح خلايا مستضد تقديم ستبدأ إعادة تنشيط المحلية اللاحقة آليات تؤدي إلى تفعيل التنسيق جيلاتيناسيس، الذي سيتم تمكين الخلايا T لعبور الحاجز الدبقية وأدخل حمة الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، تقييم BBB النفاذية ونشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط في العلاقة المكانية لتراكم الخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي خلال ع على حد سواء، يسمح بتحديد فقدان سلامة حواجز NVU بطانية والدبقيه. نعرض هنا كيفية حمل ع في الفئران C57BL/6 بالتحصين النشط وكيفية تحليل في وقت لاحق نفاذية BBB المجراة باستخدام مزيج من تتبع الفلورسنت خارجية. نحن تظهر كذلك، كيفية تصور وتعريب جيلاتيناسي النشاط في أدمغة ع حسب زيموجافي في الموقع بالإضافة إلى ستينينجس إيمونوفلوريسسينت BBB الطابق السفلي الأغشية والخلايا CD45 + الغازية المناعية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز العصبي المركزي (CNS) وينسق جميع الجسم والوظائف العقلية في الفقاريات، والتوازن في الجهاز العصبي المركزي ضروري لاتصال سليم للخلايا العصبية. التوازن CNS تبرره وحدة neurovascular (NVU)، الذي يحمي في الجهاز العصبي المركزي من الوسط تغير من مجرى الدم. NVU يتكون من خلايا بطانية ميكروفاسكولار الجهاز العصبي المركزي، وهي فريدة من نوعها المتحلل وإقامة حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) في الحديث المتبادل المستمر مع بيريسيتيس، أستروسيتيس، والخلايا العصبية، ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM)، إنشاء متميزة الطابق السفلي الأغشية1. الغشاء بطانية انشيثيس هذا الجانب أبلومينال لخلايا بطانية BBB تؤوي عددا كبيرا من بيريسيتيس، وهي تتألف من α4 لامينين و α5 لامينين، بالإضافة إلى أخرى بروتينات ECM2. على النقيض من ذلك، الغشاء متني يتكون من laminin α1 و laminin α2 وهو تبني بإقدام نهاية أستروسيتيك. الغشاء الطابق السفلي متني جنبا إلى جنب مع النهاية astrocyte-الأقدام يؤلف ليميتانس إطلاق يعزل شبكة الخلايا العصبية الجهاز العصبي المركزي من ارتشاح السائل الدماغي النخاعي شغلها أو تحت العنكبوتية ممنوع3. سبب بنية فريدة من نوعها NVU، خلية محصنة ضد الاتجار بالأشخاص إلى الجهاز العصبي المركزي متميزة من أن في الأنسجة المحيطية كما أنها تتطلب عملية من خطوتين مع الخلايا المناعية، أولاً خرق BBB بطانية، وبعد ذلك إطلاق ليميتانس من أجل الوصول إلى حمة الجهاز العصبي المركزي.

التصلب المتعدد (MS) هو مرض نيوروينفلاماتوري مشتركة للجهاز العصبي المركزي، فيها عدد كبير من الخلايا المناعية بتعميم أدخل الجهاز العصبي المركزي ويسبب نيوروينفلاميشن، demyelination، وفقدان التنسيق BBB سلامة4. فقدان سلامة BBB أوائل مميزة لمرض التصلب العصبي المتعدد، كما أشارت إلى وجود تباين غادولينيوم تعزيز آفات في الجهاز العصبي المركزي كتصور بالتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)5. التسرب الكريات البيض في الجهاز العصبي المركزي تحدث على مستوى الأوردة بوستكابيلاري؛ ومع ذلك، تظل الآليات الدقيقة التي تشارك في ديابيديسيس الخلايا المناعية عبر غشاء الطابق السفلي BBB وحاجز الدبقية في وقت لاحق إلى استكشاف. النخاع الذاتية التجريبية (ع) بمثابة نموذج لحيوانات لمرض التصلب العصبي المتعدد، وقد ساهم مساهمة كبيرة في معرفتنا الحالية حول مرض التصلب العصبي المتعدد المرضية. على سبيل المثال، باستخدام نموذج إي أنه تم اكتشاف أن يحدث التسرب الكريات البيض في عملية متعددة الخطوات، بما في ذلك التقاط أولى والمتداول خطوة بوساطة سيليكتينس وجزيئات الميوسين الشبيهة مثل سيليكتين ف بروتين سكري [ليغند] (بسجل)-1، تليها إنتغرين-تعتمد على اعتقال الراسخ والزحف من خلايا تي على BBB خلايا بطانية للجانبين المتساهلة ديابيديسيس6.

مرة واحدة قد عبروا خلايا تي بي بي بي بطانية والغشاء بطانية، يحتاجون إلى اللقاء بهم مستضد المشابهة في الضامة أو الخلايا الجذعية استراتيجيا في المسافات ليبتومينينجيل أو ارتشاح مترجمة. يدفع هذا التفاعل إنتاج المحورية من الوسطاء المحترفين التحريضية الزناد تلك الآليات التالية اللازمة لغزو أنسجة الجهاز العصبي المركزي من الخلايا المناعية عبر إطلاق ليميتانس7،،من89. تفعيل التنسيق مصفوفة-ميتالوبروتيناسيس (MMP)-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-9 يغير التنشيط تشيموكيني ويؤدي إلى تدهور مستقبلات مصفوفة خارج الخلية في نهاية أستروسيتي-أقدام، وشرط مسبق للمناعة الخليوي الهجرة عبر ليميتانس إطلاق في حمة الجهاز العصبي المركزي، والحث على ظهور الأعراض السريرية من ع10،11.

الجمع بين الكشف عن الجهاز العصبي المركزي التسلل إلى الخلايا المناعية مع بي بي بي نشاط التسرب وجيلاتيناسي في مقاطع أنسجة الجهاز العصبي المركزي يوفر معلومات قيمة حول سلامة وظيفية حاجز غشائي والدبقيه في سياق neuroinflammation. على سبيل المثال، نحن مؤخرا التحقيق فقدان التأسيسي للجزيء الالتصاق هالة جزيء مفرق ضيق غشائي (جام)-ب في الاتجار بالخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي في سياق إي. بالمقارنة مع صحية البرية من نوع C57BL/6 الفئران، أظهرت صحي المربي-ب-ناقص ليتيرماتيس ليس الأضرار بسلامة BBB كما هو موضح بتقييم نفاذية المجراة باستخدام تتبع الذاتية فضلا عن الخارجية12. في سياق ع، أظهرت الفئران جام-ب-ناقص C57BL/6 أعراض المرض يحسن، الذي ارتبط بمحاصرة الخلايا الملتهبة في ليبتومينينجيل وارتشاح ممنوع12. لدراسة هذه الظاهرة طبقنا في الموقع زيموجرافي، يسمح تحديد النشاط جيلاتيناسي لاختبار ما إذا كان انعدام النشاط جيلاتيناسي في جام-ب-ناقص الفئران قد تكون مسؤولة عن انخفاض عدد الخلايا المناعية قادرة على خرق إطلاق ليميتانس12.

نظراً للتوفر مختلف وراثيا الماوس النماذج التي تفتقر إلى مثل الجزيئات مفرق ضيق BBB المختلفة التي قد تتسبب في تغييرات في وظيفة بي بي بي، والمنهجيات اللازمة للتحقيق في سلامة BBB مهمان. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر الأدوية المطورة حديثا على الحواجز NVU. هنا نعرض كيفية حمل ع في الفئران C57BL/6 بالتحصين النشط مع بروتين سكري oligodendrocyte المايلين (موج)-الببتيد aa35-55 في مأمونية كاملة فروند. ثم نشرح كيفية تعريب تسلل الخلايا المناعية عبر حواجز بطانية والدبقيه NVU وكيفية دراسة سلامة المجراة في حاجز غشائي والدبقيه بالكشف في الموقع تتبع الخارجية والنشاط جيلاتيناسي، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الدراسات أجريت في إطار المبادئ التوجيهية وفقا للتشريعات السويسرية لحماية الحيوانات، وقد وافق عليها "مكتب الطب البيطري" في كانتون برن، سويسرا (أرقام إذن: يكون 31/17 وأن 77/18).

1-الإسكان في الفئران C57BL/6 في الممرض محددة مجاناً (منتدى جنوب المحيط الهادئ) الشروط

  1. دورة البيت الفئران في أقفاص التهوية الفردية مع ح 12/12 الضوء الظلام. توفير الغذاء والمياه ليبيدوم الإعلانية. مراقبة الجودة الميكروبيولوجية للفئران، خضع الفوج التجريبية المراقبة الصحية الفصلية بالفراش قذرة الحراس بعد فيلاسا التوصيات13.
  2. استخدام اللكمات الإذن بمناسبة الأسبوع 8-12 القديمة الإناث C57BL/6 الفئران فردياً.

2-تحصين الفئران C57BL/6

  1. إعداد حلول14:
    1. ل Adjuvant (CFA إكمال فروند)، مزيج 30 مل Adjuvant "ناقصة فروند" مع 120 ملغ حرارة بيستليد طازجة إبطال بكتريا السل (H37RA) تحت غطاء دخان. حل تخزين المخزون عند 4 درجة مئوية.
    2. لحل الأسهم MOGaa35-55-الببتيد، حل MOGaa35-55-الببتيد في برنامج تلفزيوني العقيمة (4 مغ/مل) وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    3. إعداد موج-المستحلب:
      1. تمييع 1:2 مع الحل الببتيد موج الأسهم في microtube 2 مل فرنكات الجماعة المالية الأفريقية.
      2. ختم microtube مع ختم الفيلم وإصلاحها في دوامة خلاط بالكامل الذي يغطي الأنبوب بشريط لاصق. مستحلب دوامة ح 4 في 4 درجات مئوية.
    4. إعداد المحاقن مع مستحلب ستابل:
      1. تأخذ microtube وتدور بسرعة إلى أسفل الطبقة الحساسة طاولة صغيرة للطرد مركزي باستخدام. جمع مستحلب في محقن باستخدام إبرة حقن 18 × 1 '' (1.2 ملم × 40 ملم).
      2. وفقا لعدد الفئران ضبط حجم مستحلب في المحاقن (100 ميليلتر في الماوس) واستبدال الإبرة ز 18 بإبرة حقن 27 × ¾ '' (0.4 مم × 19 مم). ختم إبرة حقن المرفقة للمحاقن مع ختم الفيلم.
    5. للسعال الديكي السمية (PTx) الأسهم الحل، حل 50 ميكروغرام من PTx المجففة بالتبريد في 500 ميليلتر من PBS العقيمة (100 نانوغرام/ميليلتر). حل تخزين المخزون عند 4 درجة مئوية.
    6. لحل العامل PTx، مزيج ميليلتر 97 من برنامج تلفزيوني العقيمة مع 3 ميليلتر PTx حل الأسهم (300 نانوغرام/100 ميليلتر) للماوس (لاستخدام الحقن داخل إبرة 30 x ½ '' (0.3 مم × 13 مم)).
  2. ع التعريفي
    1. تخدير الفئران C57BL/6 مع إيسوفلوراني باستخدام نظام المبخر. للحث على التخدير في الفئران، الكشف عن الماوس إلى 4.5% إيسوفلوراني في الأوكسجين في غرفة حضانة صغيرة قبل نقل الماوس إلى فاسيماسك مع إيسوفلوراني 2.1%. استخدم وحدة تخدير مجهزة بالتدفئة لوحة لمنع انخفاض حرارة الجسم الماوس.
    2. إصلاح الماوس أنيسثيتيزيد في يد واحدة وأول مرة حقن 30 ميليلتر من MOG35-55/CFA-مستحلب تحت الجلد في الساق الخلفية سطوح السفوح (الشكل 1:1 + 2؛ من مجموع 60 ميليلتر؛ والجناح الأيسر 30 ميليلتر والجناح الأيمن 30 ميليلتر) القرب من العقد اللمفية الاربية.
    3. ضع الماوس على البطن، وضخ 20 ميليلتر من MOGaa35-55/CFA-مستحلب في اليسار واليمين لينة الأنسجة الدهنية في جذر الذيل (الشكل 1:3 + 4؛ في مجموع 40 ميليلتر؛ والجانب الأيمن والجانب الأيسر ذيل الجذر 20 ميليلتر ذيل الجذر 20 ميليلتر) ومعالجة تجميعية قليلاً من MOGaa35-55/CFA-مستحلب int o رقبة الماوس (الشكل 1: 5).
    4. حقن 100 ميليلتر من حل PTx إينترابيريتونيلي في الماوس. عقد رئيس الماوس أسفل وسط الجسم تجنب حقن في الأمعاء.
    5. محل صيانة النظام الغذائي (المغذيات الرئيسية اكستروداتي: البروتين الخام 18.5% النفط الخام من الدهون 4.5% ألياف خام 4.5%؛ والرماد الخام 6.5 في المائة؛ والنشا 35%; الطاقة الأيضية: 13.1 مللي جول/كغ) إلى تربية النظام الغذائي (المغذيات الرئيسية اكستروداتي: البروتين الخام 23.5 في المائة؛ الدهون الخام 5.5% والألياف الخام 3%؛ الرماد الخام 5.7 في المائة؛ نشأ 36%؛ الطاقة الاستقلابية: 14.3 مللي جول/كغ) بغية تزويد الفئران بارتفاع محتوى الطاقة في الغذاء قبل وأثناء المرض السريرية المتوقعة.
    6. إزالة قناع الوجه ونقل الماوس إلى قفصة المنزل مع لوحة الاحترار. تأكد من أن الماوس مستيقظا تماما ومتحركة بعد 10 دقائق.
    7. كرر PTx الحقن (2.2.4) 48 ساعة بعد العلاج الأولى.

3-سجل من الفئران ع

  1. فحص الحالة الصحية للفئران ع كل صباح بإلقاء نظرة داخل الأقفاص.
  2. نقاط EAE الفئران بعد ظهر كل يوم.
  3. تستغرق كل الفأرة الفردية المدرجة في التجربة ع الخروج من القفص والاختيار ما إذا كان الذيل وقد تبطئ بتحريكه إلى الأعلى بواسطة إصبع. ماوس صحية سوف يتمادى ذيله (الذيل قد تبطئ). إذا كانت قد بدأت ع السريرية، سوف تبطئ الذيل السفلي، مرئية بانخفاض تدريجي من الذيل. في نهاية المطاف الماوس لن تكون قادرة على رفع ذيله على الإطلاق.
  4. ضع كل الماوس الفردية المدرجة في التجربة ع على مقاعد البدلاء نظيفة ومراقبة وتوثيق سلوك سيرا على الأقدام. انظر الجدول 115 للتهديف معايير لتقييم شدة المرض (ع نقاط).
  5. تقييم وتوثيق وزن الماوس كل المدرجة في هذه التجربة.
  6. لتأمين الغذاء الكافي، وامتصاص المياه من الفئران عرض ع سريرية النتيجة 1 الإمدادات الغذائية ترطب في صحن بلاستيك على الجزء السفلي من القفص وتحديث يوميا.

4. فحص نفاذية في الحية

  1. الأعمال التحضيرية للحلول:
    1. لحلول ديكستران المخزون، وحل 10 ملغ 10 كاتشين ديكستران أليكسا فلور 488، فضلا عن 3 كاتشين "ديكستران تكساس الأحمر" في 500 ميليلتر من محلول كلوريد الصوديوم 0.9% (20 ملغ/مل).
    2. لحل العامل ديكستران، فقط قبل الحقن بيبيت 55 ميليلتر من 10 كاتشين ديكستران أليكسا فلور 488 الأسهم الحل (20 ملغ/مل) على قطعة من ختم الفيلم وإضافة 55 ميليلتر من 3 كاتشين ديكستران حل الأسهم "الحمراء تكساس" (20 ملغ/مل). خلط وجمع 100 ميليلتر في محقن غرامة المتاح (تركيز نهائي 2 مغ/100 ميليلتر).
    3. لحل الأسهم 10% فورمالدهايد (PFA)، تجمع بين 10 غم من مسحوق إضافية نقية و 100 مل من برنامج تلفزيوني 200 ميليلتر من 1N هيدروكسيد الصوديوم في الكأس الزجاجية النظيفة والحرارة تصل إلى دقة 56 درجة مئوية تحت التحريك باستخدام محرض مغناطيسي؛ منهاج عمل بيجين الحفاظ على 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يذوب تماما منهاج عمل بيجين؛ يبرد لدرجة حرارة الغرفة؛ ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4؛ والتصفية من خلال عامل تصفية ورق. مخزن في-20 درجة مئوية. الحل الأسهم يمكن أن تضعف زيادة استخدام برنامج تلفزيوني.
  2. قريبا تخدير صحية C57BL/6 الفئران أو الفئران C57BL/6 يعانون من ع إيسوفلوراني (الماوس سيتم مخدراً حوالي 1 دقيقة). استخدام نظام الآلي كما هو الحال في خطوة 2.2.1 (الفئران سوف يتعرض إلى 4.5% isoflurane في الأوكسجين في دائرة التعريفي وثم نقل إلى فاسيماسك مع إيسوفلوراني 2.1%).
  3. ضع الماوس أنيسثيتيزيد في الموضع الأفقي في الجدول، ثم عن طريق الوريد (مثل الرجعية-أوربيتالي) بحقن 100 ميليلتر من الفلورسنت تتبع الماوس قبل أن يستيقظ الماوس.
  4. فورا إزالة facemask وتأكد من الفأر مستيقظا تماما ومتحركة بعد التخدير قصيرة. واسمحوا الراسم تعميم لمدة 15 دقيقة.
  5. المضي قدما في الخطوة 5، 1.

5-نضح فئران

  1. لتقييم نفاذية المجراة:
    1. بدء الإجراء 15 دقيقة بعد حقن الراسم الفلورسنت بتحريض التخدير isoflurane العميق. للحث على استخدام التخدير العميق في الفئران 2.3% إيسوفلوراني في الأوكسجين. استخدام مخلب انسحاب المعاكسة للحكم على عمق التخدير (قرصه الجلد بين أصابع القدم؛ والافتقار إلى الانحناء يشير إلى عمق كاف)، والتحقيق في ردود الفعل فوريليمب واللكتات في الفئران التي تعرضت إلى ع.
    2. إصلاح الماوس على ظهرها والرش البطن مع الإيثانول. فتح الصدر باستخدام مقص وإزالة الحاجز. فتح الاذين الأيمن من قلب ينبض باستخدام مقص ونتخلل الماوس عن طريق البطين الأيسر للقلب مع 10 مل من برنامج تلفزيوني تليها مل 10% 4 منهاج العمل في برنامج تلفزيوني.
      تنبيه: لتجنب استنشاق منهاج عمل بيجين، نتخلل الماوس في غطاء دخان.
    3. انتقل إلى القسم 6.
  2. زيموجرافي في الموقع :
    1. حمل التخدير العميق isoflurane استخدام isoflurane 2.3% في الأوكسجين في ماوس يعاني من ع، وتحقق من عمق التخدير كما في الخطوة 5.1.1.
    2. بعد ذلك، إصلاح الماوس على ظهرها والرش البطن مع الإيثانول. فتح الصدر باستخدام مقص وإزالة الحاجز. فتح الاذين الأيمن من قلب ينبض باستخدام مقص ونتخلل الماوس عن طريق البطين الأيسر للقلب مع 20 مل من برنامج تلفزيوني.
    3. انتقل إلى القسم 6.

6-تشريح وتجميد العقول

  1. إعداد حمام التبريد:
    1. ملء حاوية ديوار مسطحة مع الثلج الجاف المجروش وإضافة 2-ميثيلبوتاني (إيسوبينتاني) حتى يصل السائل إلى حوالي 1 سم فوق حزمة الجليد الجاف. تغطية مع غطاء فضفاض--مثلاً، تغطية دلو الجليد.
  2. مقطع قبالة رأس الماوس perfused مع مقص حاد وإزالة الجلد والاذنين باستخدام مجموعة أصغر من المقص.
  3. تشريح بعناية في قلنسوة بقطع من ماغنوم ثقبة نحو جبهة اليسار والجانب الأيمن يسمح ابفولد قلنسوة على الدماغ. ثم، بعناية انتشال الدماغ سليمة من قاعدة الجمجمة بينما قطع الأعصاب البصرية باستخدام ملعقة مسطحة معدنية.
  4. وضع الدماغ على رقائق الألومنيوم وقطع الدماغ في ثلاثة أجزاء (أمامي الدماغ، المخ الأوسط، والمخيخ + جذع الدماغ) بوضع تخفيضات الاكليلية اثنين.
  5. ملء كريومولد (25 مم × 20 مم × 5 مم) للربع الأول مع مصفوفة قطع (O.C.T.) ودرجة الحرارة المثلى ووضع شرائح المخ مع الجانب الأمامي من كل قطعة الدماغ التي تواجه هبوطاً في كريومولد وتغطي الأنسجة تماما مع مصفوفة O.C.T..
  6. ضع كريومولد مع الأنسجة في اتجاه أفقي في الحمام 2-ميثيلبوتاني وتأكد من أن الأنسجة يتجمد من الأسفل إلى الأعلى داخل 1 دقيقة عن طريق تجنب غمس كتلة الأنسجة كامل في الحمام.
  7. نقل الأنسجة المجمدة إلى-80 درجة مئوية للتخزين، والمضي قدما في الباب 7.

7-إعداد مقاطع الأنسجة المجمدة

  1. توازن درجة الحرارة من الأنسجة المجمدة من-80 درجة مئوية إلى-20 درجة مئوية في كريوستات لمدة 30 دقيقة.
  2. إزالة كتلة الأنسجة من كريومولد وجبل على حامل مناديل كريوستات (تعيين إلى-15 درجة مئوية) باستخدام مصفوفة O.C.T..
  3. تقليم حواف كتلة الأنسجة على الحامل كريوستات مشرط حاد، والبدء في قطع إلى كتلة الأنسجة عن طريق إزالة 20 ميكرومتر الأقسام مع السكين كريوستات حتى الأنسجة مرئياً.
  4. لتحليل المجراة في BBB النفاذية:
    1. قص 6-10 ميكرون أقسام الأنسجة وجمعها على الشرائح الزجاجية الالتصاق فورا صورة الأجزاء مغطاة بغطاء زلة استخدام مجهر الأسفار.
    2. تقييم ظهور الأوعية الدموية في الدماغ (إيلاء الاهتمام إلى حادة الحدود غير راشح الأوعية الدموية مقارنة بنشر أنماط الأسفار التي لوحظت بالنسبة للأوعية الدموية راشح). كمراقبة إيجابية، التحقق من تسرب التتبع إلى ستروما من أجهزة سيركومفينتريكولار أو الضفيرة شرويد التي تفتقر بي بي بي.
  5. زيموجرافي في الموقع :
    1. قص 6 أقسام الأنسجة ميكرومتر استخدام كريوستات وجمعها على الشرائح الزجاجية الالتصاق وتجميد أقسام الأنسجة في-20 درجة مئوية في صندوق تجميد يحتوي على هلام السليكا في الغطاء.

8-زيموجرافي في الموقع جنبا إلى جنب مع تلطيخ الفلورة laminin/CD45

  1. إعداد الحلول:
    1. إعداد الحل التضمين:
      1. مزيج ز 6 من الجلسرين (الصف التحليلية) ز 2.4 من بولي (الفينيل الكحول)، 6 مل من ddH2O ومل 12 0.2 M تريس المخزن المؤقت، درجة الحموضة 8، وآثاره (محرض المغناطيسية) الحل بالنسبة ح 4 في الرايت
      2. نقل الحل إلى أنبوب الطرد مركزي 50 مل والسماح لها بالراحة ح 2 في الرايت وفي وقت لاحق احتضان الحل لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية (حوض ماء) وجهاز الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 2,700 س ز في درجة حرارة الغرفة.
      3. تأخذ المادة طافية وتجميد في مختبرين في-20 درجة مئوية.
    2. إعداد الحل الجيلاتين البارد:
      1. حل 0.1 غرام جيلاتين البارد من الجلد البقري في 10 مل ddH2O.
      2. وليكن نقع لمدة يوم واحد على الأقل وتخزين مختبرين في 4 درجات مئوية.
    3. تحضير الميثانول المثلج (-20 درجة مئوية):
      1. وضع 100 ٪ الميثانول في جرة كوبلين وباردة إلى أسفل إلى-20 درجة مئوية.
    4. إعداد أزيد الصوديوم 10% محلول المخزون:
      1. ز 1 من أزيد الصوديوم بإضافة إلى 10 مل ddH2O وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    5. إعداد حل عملي أزيد الصوديوم 0.1%:
      1. ميكس 99 ميليلتر من ddH2O مع 1 ميليلتر من أزيد الصوديوم 10% محلول الأسهم.
    6. حل 1 ملغ fluorescein مترافق تطفئ صبغ (DQ) الجيلاتين من جلد الخنزير في 1 مل أزيد الصوديوم تعمل 100 مختبرين ميليلتر الشمالية البالغة حل وتخزين محمية من الضوء في 4 درجات مئوية.
    7. حل 30 ملغ مونوهيدرات 1,10-فينانثروليني في 76 ميليلتر من الإيثانول ومخزن في-20 درجة مئوية.
    8. إعداد 25 × الحل مثبط البروتياز:
      1. إضافة قرص 1 من مثبطات البروتياز الحرة يدتا إلى 2 مل ddH2O. مخزن في-20 درجة مئوية.
    9. قبل الاستخدام، إعداد رد فعل الحل (150 ميليلتر في القسم):
      1. الطرد المركزي الحل الجيلاتين دي كيو 1 ملغ/مل لمدة 5 دقائق في 13,300 س ز.
      2. مزيج 127.2 ميليلتر ddH2O، 15 ميليلتر من 10 س رد فعل المخزن المؤقت (جيلاتيناسي/كولاجيناز "المقايسة طقم"؛ انظر الجدول للمواد)، 0.3 ميليلتر من الجيلاتين البارد 20 ملغ/مل، 1.5 ميليلتر من الجيلاتين دي كيو 1 ملغ/مل وميليلتر 6 من 25 × الحل مثبط البروتياز.
    10. قبل استخدام إعداد حل رد فعل سلبي السيطرة فينانتروليني (150 ميليلتر في القسم):
      1. ميليلتر 125.2 مزيج من ddH2O وميليلتر 15 من 10 x رد فعل المخزن المؤقت, ميليلتر 0.3 الجيلاتين البارد 20 ملغ/مل، 1.5 ميليلتر من الجيلاتين دي كيو 1 ملغ/مل، ميليلتر 6 من 25 x مثبط البروتياز يدتا الحرة 2 ميليلتر من م 2 1,10-فينانتروليني (MMP المانع).
    11. قبل الاستخدام، إعداد حل رد فعل السيطرة السلبية (غير الفلورية) الجيلاتين البارد (150 ميليلتر في القسم):
      1. 128.7 مزيج ميليلتر ddH2O، 15 ميليلتر من 10 س رد فعل المخزن المؤقت، 0.3 ميليلتر من الجيلاتين البارد 20 ملغ/مل وميليلتر 6 من مثبط البروتياز 25 x يدتا خالية.
    12. إعداد جسم الابتدائي كوكتيل كونتيرستاينينج، على سبيل المثال، 0.95 ميكروغرام/مل أرنب [بولكلونل] مكافحة لامينين جسم وجسم CD45 مكافحة الفئران [بولكلونل] 10 ميكروغرام/مل في جيش صرب البوسنة 1% في برنامج تلفزيوني، وإعداد التحكم المناسبة ايستب الكوكتيل جسم الأولية.
    13. إعداد حل جسم الثانوي، على سبيل المثال، 7.5 ميكروغرام/مل Cy3 الماعز لمكافحة الفئران + 15 ميكروغرام/مل AMCA أرنب المضادة في جيش صرب البوسنة 1% في برنامج تلفزيوني (حماية من الضوء).
  2. ذوبان الجليد 6 ميكرومتر الدماغ غير ثابت الأنسجة المقاطع من الفئران ع داخل مربع تجميد بلاستيكية تحتوي على هلام السليكا في الغطاء بغطاء دخان تجنب الاحتفاظ بالماء للأنسجة وفصل 2 أقسام الأنسجة على شريحة واحدة عن طريق رسم خطوط مع مياه صد القلم
  3. إعداد رد فعل الحلول (الخطوات 8.1.9-8.1.11)، والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في س 13,400 ز في درجة حرارة الغرفة، وقبل الحارة إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.
  4. ترطيب أقسام الأنسجة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية باستخدام 1 س رد فعل المخزن المؤقت. ثم، من أجل إيقاف 1 س رد فعل المخزن المؤقت وإضافة حل رد فعل على قطاعات النسيج واحتضانها ح 4 في 37 درجة مئوية. تغسل شرائح 5 مرات في ddH2O.
  5. إصلاح الأبواب لمدة 5 دقائق مع الميثانول المثلج في-20 درجة مئوية وبعد ذلك يغسل المقاطع مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
  6. إضافة 1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني للمقاطع واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (حماية من الضوء). ثم تجاهل جيش صرب البوسنة 1% في برنامج تلفزيوني من الفروع بواسطة التقليب الشرائح على الأنسجة وإضافة كوكتيل جسم الأولية واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة (حماية من الضوء).
  7. تغسل الأجزاء مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة كوكتيل جسم الثانوية واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة (حماية من الضوء).
  8. تغسل الأجزاء مرتين مع برنامج تلفزيوني، جبل الشرائح مع تضمين الحل، اسمحوا المقاطع المحملة جاف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (حماية من الضوء). وأخيراً، تحليل المقاطع الأنسجة الملطخة باستخدام مجهر فلوري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينبغي أن يؤدي تقييم لمسار السريرية إي في الفئران C57BL/6 في منحنى مرض كما هو مبين في الشكل 2 ألف والتغيرات في وزن الجسم الماوس النحو المبين في الشكل 2. الفئران C57BL/6 تحصين مع MOGaa35-55 وعادة ما تبدأ أعراض المرض حوالي 10-12 يوم بعد التحصين النشط (الشكل 1A). عادة، تظهر الفئران المحصنين قطره عابرة من وزن الجسم في اليوم التالي لحقن المستحلب والجرعة الأولى من السم السعال الديكي (الشكل 1B). من يوم 2 بعد ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا للحث ورصد ع الإناث C57BL/6 الفئران. الإناث ويتم اختيار تفضيلي، وهناك نسبة نساء: الرجال 3:1 في مرض التصلب العصبي المتعدد. لتقييم مدى خطورة EAE، قدمنا استخدام ورقة سجل 3 نقاط. وسجل خطورة ع هو عموما فيما يتعلق بخطورة الاختلالات الحركية. الفئران مع تقدم مراحل ع، نستعرض أي نقاط أعلاه 2 ينبغي التضحية بها لتجنب المعاناة غير الضرورية للحيوانات. وبالتالي، فمن المستحسن نقاط الفئران في فترات إغلاق مثلاً مرتين يوميا كما هو موضح في البروتوكول.  وهناك عدة التهديف الروتينية المستخدمة، وردت إلى من 0-3 يشير إلى 0-6

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونعترف مع الامتنان Sorokin ليديا، الذي قد يشارك في بلدها الأصلي في الموقع زيموجرافي البروتوكول10 معنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأجسام المضادة للأرانب AMCAJackson ImmunoResearch111-156-045تخزين في 4 درجات ؛ C; حماية من الضوء
الأجسام المضادة المضادة ل CD45 (30F11)Pharmingen07-1401يخزن في 4 درجات ؛ C
الأجسام المضادة المضادة لللامينينDAKOZ0097تخزين عند 4 درجات ؛ C
تربية الأغذيةعلى سبيل المثال PROVIMI KLIBASA 3336
أقفاص ذات تهوية فردية ، الخط الأزرق من النوع الثاني أو الثالثعلى سبيل المثال Tecniplast 1145T ، 1285L
BSA fraction VApplichemA1391تخزين في 4 درجات ؛ جرة
جيلاتين Cالباردة Sigma-AldrichG 9391
Coplin + رفعلى سبيل المثال Carl Roth GmbH + Co. KGH554.1 ؛ H552.1
Cy3 الأجسام المضادة للفئرانجاكسون ImmunoResearch111-156-144يخزن في 4 درجات ؛ C; حماية من الضوء
زلات الغطاء 24 × 40 مم # 1على سبيل المثال Thermo Scientific85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 ميجاوات)على سبيل المثال المجسات الجزيئيةD22910تخزن عند -20 درجة ؛ C; حماية من الضوء
Dextran Texas Red (3000 ميجاوات)InvitrogenD3328مخزن عند -20 درجة ؛ C; الحماية من الضوء
EnzChek Gelatinase / Collagenase Assay Kit   ؛ثيرمو فيشر العلمية. EnzCheckE12055مخزن في -20 & درجة ؛ C; حماية شكل
الفئران الخفيفة الإناث C57BL / 6J (8-12 أسبوعا)على سبيل المثال Janvier Labsالإناث ، 8-12
أسبوعا صندوق تجميد لشرائح الأنسجةمثل Carl Roth GmbH + Co. KG2285.1
18G x 1 & frac12 ؛ ’ ’ (1.2 مم × 40 مم) إبرة حقنمثل BD و BD Microlance 3304622
27G x ¾ ؛ ’ ’ – رقم 20 (0.4 مم × 19 مم) إبرة حقنمثل BD و BD Microlance 3302200
30G x ½ ؛ ’ ’ (0.3 مم × 13 مم) إبرة حقنمثل BD و BD Microlance 3304000
Freund غير المكتمل s مساعد (IFA)على سبيل المثال متجر سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc-24648في 4 درجة ؛ C
صيانة الأغذيةعلى سبيل المثال PROVIMI KLIBA SA3436
MOGaa35-55 الببتيدعلى سبيل المثال GenScriptStore عند -80 درجة ؛
شرائح المجهر C (Superfrost Plus) ThermoScientificJ1800AMNZ
المتفطرة السلية < / em>H37RAعلى سبيل المثال231141تخزين في 4 درجات ؛ ج 
كلوريد الصوديوم 0.9٪B. براون3535789
مركب OCT (Tissue-Tek)ساكورا4583
أومنيكان 50 30 جم × ½ ؛ ’ 'B. Braun9151125S
ParaformaldehydeMerck30525-89-4
سم السعالالديكي على سبيل المثال List Biological Laboratories، Inc.180متجر عند 4 درجات ؛ C
بولي (كحول فينيل) (Mowiol 4-88)Sigma-Aldrich81381
مثبط البروتياز خالي من EDTA (Roche)Sigma-Aldrich4693132001Store at 4 & deg ؛
، على سبيل المثال ، قلم DAKO، على سبيل المثالS2002
، على سبيل المثال Parafilm M، على سبيل المثال ، Sigma-AldrichP7793
، هلام السيليكا، على سبيل المثال Carl Roth GmbH + Co. KG9351.1
مقص غرزةFST 15012-12
حقنة 1 مل، على سبيل المثال حقنة PRIMO62.1002
، 10 مل، على سبيل المثال CODAN Medical نظام مبخر ApS2022-05
Univentor 400UNO. بي
BD قلم طارد C ، فيلم مانع للتسرب DAKO

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363(2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C57BL 6

مقالات ذات صلة