مقالة منهجية

تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية

13.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59254

⸱

سبتمبر 11, 2019

 , 
1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2The Nano Institute of Utah, University of Utah, 3Center for Photonics and Quantum Materials, Skolkovo Institute of Science and Technology, 4Biopharmaceutical Cluster 'Northern', Moscow Institute of Physics and Technology

في هذه المقالة

ملخص

يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لشل الحركة الخالية من الملصقات من الحويصلات الخارجية والحويصلات خارج الخلية من العينات السائلة وتصويرها عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). وتستخدم الصور AFM لتقدير حجم الحويصلات في الحل وتميز الخصائص البيوفيزيائية الأخرى.

الملخص

إكسوسومات وغيرها من الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي المجمعات الجزيئية تتكون من حويصلة غشاء الدهون، والديكور السطحي من قبل بروتينات الغشاء والجزيئات الأخرى، والمحتوى الإنارة المتنوعة الموروثة من الخلية الأم، والتي تشمل RNAs، البروتينات، وDNAs. وقد أصبح توصيف الأحجام الهيدرودينامية للمركبات الكهربائية، الذي يعتمد على حجم الحويصلة وطبقته الإكليلية التي تشكلها الزخارف السطحية، أمرا روتينيا. بالنسبة للاكسوسوسوم، أصغر المركبات الكهربائية، الفرق النسبي بين أحجام الهيدروديناميكا والحويصلات كبير. ولا يزال توصيف أحجام الحويصلات بواسطة التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال المبرد (cryo-TEM)، وهو تقنية قياسية ذهبية، يشكل تحدياً بسبب تكلفة الأداة، والخبرة المطلوبة لإجراء إعداد العينة، والتصوير، و تحليل البيانات، وعدد قليل من الجسيمات التي غالبا ما لوحظت في الصور. وثمة بديل متاح على نطاق واسع ويمكن الوصول إليه هو الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM)، الذي يمكن أن ينتج بيانات متعددة الاستخدامات عن الهندسة ثلاثية الأبعاد، والحجم، وغيرها من الخصائص الفيزيائية الحيوية للحويصلات خارج الخلية. ويرشد البروتوكول المطور المستخدمين في استخدام هذه الأداة التحليلية ويحدد سير العمل لتحليل المركبات الكهربائية من قبل AFM، والذي يتضمن إعداد عينة لتصوير المركبات الكهربائية في شكل رطب أو المجففة، والجمود الكهروستاتيكي لل الحويصلات على الركيزة، والحصول على البيانات، وتحليلها، والتفسير. وتبين النتائج التمثيلية أن تثبيت المركبات الكهربائية على سطح الميكا المعدل يمكن التنبؤ به، ويمكن تخصيصه، ويسمح للمستخدم بالحصول على نتائج تغيير الحجم لعدد كبير من الحويصلات. وقد تبين أن تغيير حجم الحويصلة استنادا إلى بيانات AFM يتسق مع التصوير بالتبريد- TEM.

المقدمة

توجد الحويصلات خارج الخلية (EVs) في جميع سوائل الجسم، بما في ذلك الدم والبول واللعاب والحليب والسائل السلوي. تشكل Exosomes فئة منطقة من المركبات الكهربائية المتمايزة عن المركبات الكهربائية الأخرى عن طريق التكوين الحيوي الأنبي، وعلامات المسار الأنبي، وأصغر حجم بين جميع المركبات الكهربائية. وكثيرا ً ما يتم الإبلاغ عن حجم الاكسوسوسوم مع تباين كبير بين الدراسات. تم العثور على نتائج التحجيم لتكون تعتمد على طريقة، مما يعكس الفرق في المبادئ المادية المستخدمة من قبل تقنيات تحليلية مختلفة لتقدير أحجام EV1،2. على سبيل المثال، يقدر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) - وهو تقنية توصيف الحجم الأكثر استخداماً - حجم المركبات الكهربائية كأقطار هاديدينامية، والتي تميز مقاومة حركة البراونيان للمركبات الكهربائية في الحل. قطر هيدرودينامي أكبر من الحويصلة ينطوي على انخفاض حركتها في السائل. الطبقة الإكليلية حول الحويصلات، تتكون من البروتينات السطحية والجزيئات الأخرى الراسية أو الممتزة على سطح الغشاء، تعيق إلى حد كبير التنقل وتزيد من الحجم الهيدرودينامي للمركبات الكهربائية. ومن الناحية النسبية، فإن هذه الزيادة كبيرة بشكل خاص بالنسبة للإكسوسوم3، كما هو موضح في الشكل 1.

التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال المبرد (CRYO-TEM) هو تقنية نهائية في تحديد أحجام الحويصلات ومورفولوجيا في حالاتها المرطبة. ومع ذلك، فإن التكلفة العالية للأجهزة والخبرة المتخصصة اللازمة لاستخدامها بشكل صحيح تحفيز استكشاف التقنيات البديلة التي يمكن أن تصور المركبات الكهربائية رطب. وهناك عدد صغير نسبيا من المركبات الكهربائية التي لوحظت أو تتميز في الصور المكتسبة بالتبريد TEM هو عيب ملحوظ آخر من هذه التقنية.

تصور مجهرية القوة الذرية (AFM) الطوبوغرافيا ثلاثية الأبعاد للمركبات الكهربائية المرطبة أو المجففة4و5و6عن طريق مسح مسبار عبر الركيزة لتنقيط صورة الجسيمات على السطح. وترد في هذه الدراسة الخطوات الأساسية للبروتوكول الذي يميز المركبات الكهربائية من جانب AFM. قبل تصوير الحويصلات في السائل، يجب أن تكون معطلة على الركيزة إما عن طريق الربط إلى سطح وظيفي، ومحاصرة في مرشح، أو عن طريق الجذب الكهروستاتيكي7. التثبيت الكهروستاتيكي على الركيزة المشحونة بشكل إيجابي هو خيار مناسب بشكل خاص لشل من exosomes المعروف أن لديها إمكانات زيتا سلبية. ومع ذلك، فإن نفس القوى الكهروستاتيكية التي تعطل الحويصلات خارج الخلية على السطح تشوه أيضا شكلها، مما يجعل تحليل البيانات بعد التصوير ضروريًا. نقوم بتفصيل هذه النقطة من خلال وصف الخوارزمية التي تقدر حجم الحويصلات الكروية في الحل استناداً إلى بيانات AFM على الشكل المشوه للاكسوسوم اتّبأ على السطح.

في البروتوكول المطور، يتم عرض إجراء تجميد الحويصلات الكهروستاتيكي القوي، وتليه الخطوات اللازمة لإجراء تصوير القوة الذرية في الدول المرطبة أو المجففة. يتم تحديد العوامل التي تؤثر على التركيز السطحي للحويصلات المعطلة. وتُعطى الإرشادات بشأن كيفية إجراء عملية التعطيل الكهروستاتيكي للعينات ذات التركيزات المختلفة للمركبات الكهربائية في الحل. ويناقش اختيار الظروف التجريبية التي تسمح بتقدير توزيعات الاحتمالات التجريبية لمختلف الخصائص البيوفيزيائية استنادا إلى عدد كبير بما فيه الكفاية من الحويصلات المعطلة. وترد أمثلة على تحليل ما بعد التصوير لبيانات AFM. وعلى وجه التحديد، يتم وصف خوارزمية لتحديد حجم الحويصلات في الحل استناداً إلى توصيف AFM للمركبات الكهربائية المعطلة. وتظهر النتائج التمثيلية اتساق التحجيم الحويصلة من قبل AFM مع نتائج التصوير بالتبريد TEM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. عزل المركبات الكهربائية من السوائل الحيوية

  1. عزل المركبات الكهربائية بإحدى الطرق المعمول بها، مثل التفاضل الفائقجداً 8، هطول الأمطار، أو الكروماتوغرافيا ذات الاستبعاد الكبير9.
  2. تأكيد وجود العلامات الحيوية السطحية والقطنية المتوقعة وعدم وجود علامات بيولوجية تشير إلى التلوث المتبادل للإعداد. تأكيد مورفولوجيا ثنائية الطبقات من الجسيمات المعزولة عن طريق المجهر الإلكتروني.
    ملاحظة: عند عزل الاكسوسوم، يجب أن يكون توزيع الحجم الهيدرودينامي الذي يقاس بتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) أو تشتت الضوء الديناميكي في النطاق المتوقع. تفاصيل EV والعزلة الخارجية خارج نطاق هذا البروتوكول. تعتمد الطريقة المختارة على الأسئلة التجريبية والهدف من الدراسة10. توفر الخطوات التالية توضيحًا ملموسًا لإجراء إثراء الاكسوسوسوم عن طريق هطول الأمطار من وسط نمو خلايا سرطان الثدي MCF-7 باستخدام مجموعة هطول الأمطار المتاحة تجارياً(جدول المواد).
  3. قبل توسيع زراعة الخلايا، تخزين خلايا سرطان الثدي MCF-7 في النيتروجين السائل. إذابة الخلايا إلى الثقافة الفرعية.
  4. بعد ممارسات العقيم، وأداء طلاء الخلايا على لوحات 150 ملم. استخدام متوسط النمو يتكون منالحدالأدنى من المتوسط الأساسية النسر، 0.01 ملغ / مل الأنسولين المؤتلف الإنسان، و 10٪ خارج اكسسوم المصل البقري الجنين.
  5. تُنير الثقافة بنسبة 95% من الهواء و5% من ثاني أكسيد الكربون2 وحضانة في 37 درجة مئوية.
  6. بعد تسوية الخلايا (حوالي 24 ساعة بعد الطلاء)، تغيير وسائل الإعلام. تقسيم لوحة في نسبة 1:10 والثقافة عشر لوحات، كل منها تحتوي على 20 مل من وسائل الإعلام.
  7. حصاد وجمع وسائل الإعلام من 9 من هذه اللوحات (180 مل) في ~ 70-80٪ التقاء عندما الخلايا لا تزال في مرحلة النمو.
  8. تقسيم وسائل الإعلام إلى 60 مل و 120 مل، وتنقسم إلى مزيد من 30 مل / أنبوب، والطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 15 دقيقة.
  9. نقل supernatant من كل أنبوب إلى أنبوب معقمة جديدة 50 مل وأداء العزلة الخارجية.
  10. عزل exosomes عن طريق هطول الأمطار وفقا للبروتوكولات المنشورة (انظر، على سبيل المثال، المرجع11) أو اتبع تعليماتالشركةالمصنعة في حالة استخدام مجموعة العزل التجاري(جدول المواد). وكخطوة أولى في الحالة الأخيرة، تبلغ تكلفة خلايا الطرد المركزي المتوسطة 000 3 x غرام لمدة 15 دقيقة.
  11. إضافة حل هطول الأمطار (1:5 نسبة الحجم) إلى supernatant، مزيج، وتبريد بين عشية وضحاها.
  12. الطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الـ supernatant بعد الطرد المركزي.
  13. تدور بيليه exosome المتبقية لمدة 5 دقائق أخرى في 1500 × ز. دون إزعاج بيليه، وإزالة الحل هطول الأمطار المتبقية عن طريق الطموح.
  14. إعادة تعليق بيليه في 100-500 درجة مئوية من 1X الفوسفات المخزنة العازلة المالحة (PBS) العازلة وتقسيمها إلى aliquots متعددة حسب الحاجة لتحليل المصب.
  15. المضي قدما على الفور إلى تجميد سطح exosomes معزولة لتصوير AFM. إذا لزم الأمر، تجميد aliquots في -80 درجة مئويةللاستخدام في وقت لاحق مع اتخاذ الاحتياطات لتجنب الأضرار التي لحقت العينة خلال دورة تجميد ذوبان.

2. تثبيت السطح من الحويصلات خارج الخلية

  1. استخدام شريط قوي على الوجهين، الايبوكسي، أو لاصقبديل لإرفاق بحزم قرص الميكا إلى AFM / المسح الضوئي نفق المجهر (STM) المغناطيسي الفولاذ المقاوم للصدأ عينة القرص.
  2. شق قرص الميكا باستخدام شفرة حلاقة حادة أو سكين فائدة، أو عن طريق إرفاق شريط لاصق على السطح العلوي ومن ثم pealing تشغيله لإزالة طبقة من المواد.
    ملاحظة: يجب أن تكشف أي طريقة سطح عذراء عن طريق إزالة طبقة رقيقة من الميكا التي تعرضت سابقا للبيئة. بعد الإجراء، يجب أن يبقى مرفق الميكا إلى قرص عينة معدنية AFM/STM ثابتًا.
  3. في درجة حرارة الغرفة، علاج السطح العلوي من الميكا لمدة 10 ثانية مع 100 درجة مئوية من 10 مل من 10 مل NiCl2 الحل، الذي يعدل شحنة السطح من السلبية إلى الإيجابية.
  4. محلول من اللطخة NiCl2 مع ورق مسح أو نشاف خالي من الوبر. اغسل سطح الميكا 3x بالماء منزوع الأيونات (DI) وجففه بتيار من النيتروجين الجاف.
    ملاحظة: من الممارسات الجيدة مسح السطح المعدل مع AFM للتأكد من خلوه من الملوثات.
  5. ضع قرص عينة AFM مع الميكا المرفقة المعدلة على السطح في طبق بيتري.
  6. تخفيف العينة الخارجية من الخطوة 1.14 مع PBS 1X للحصول على تركيز بين 4.0 × 109 و 4.0 ×10 10 الجسيمات لكل مل من الحل. التحقق من تركيز الجسيمات المخففة باستخدام NTA.
  7. تشكيل قطرة sessile على سطح الميكا عن طريق إفراغ 100 درجة مئوية من محلول خارجي مخفف من ماصة.
  8. ضع الغطاء على طبق بيتري وختمه مع فيلم البارافين للحد من التبخر عينة. احتضان العينة لمدة 12-18 ساعة في 4 درجةمئوية.
    ملاحظة: سوف تزيد الكثافة السطحية للاكسوسومات المعطلة مع وقت الحضانة وتركيز المركبات الكهربائية في السائل. قد يكون من الضروري وقت حضانة أطول إذا كانت exosomes موجودة في العينة بتركيزات أقل.
  9. بعد الحضانة، يستنشق 80-90٪ من العينة دون إزعاج السطح. عند هذه النقطة، سيتم تعطيل exosomes كهربائيا على الركيزة الميكا.
  10. قبل تصوير المركبات الكهربائية المرطبة، اشطف السطح بـ 1x PBS. كرر 3x. الحرص على الحفاظ على عينة رطبة طوال عملية الرين.
  11. بعد غسل سطح الميكا مع 1X PBS، وإزالة 80٪-90٪ من السائل، وماصة ~ 40 درجة مئوية من PBS 1X الطازجة لتغطية العينة.
  12. عند تصوير المركبات الكهربائية المجففة، اشطف الركيزة بالماء DI. كرر 3x.
    ملاحظة: الرينينغ مع المياه DI منع تشكيل بلورات الملح وترسب من solutes على السطح كما يجف الركيزة.
  13. قبل تصوير المركبات الكهربائية المجففة، يستنشق أكبر قدر ممكن من السائل دون لمس السطح وتجفيف الباقي مع تيار من النيتروجين الجاف.

3. AFM التصوير

  1. لتصوير المركبات الكهربائية المجففة، حدد cantilever مصممة للمسح الضوئي في الهواء في أوضاع التصوير التنصت وعدم الاتصال وتركيبها على حامل المسبار.
    ملاحظة: يمكن استخدام خصائص الكانتيلفيت المثال المدرجة في جدول المواد (طول 123 ميكرومتر، وعرض 40 ميكرومتر، و7 نانومتر دائرة نصف قطرها طرف، و37 نيوتن/م ثابت الربيع) كدليل عند اختيار مسبار متوافق مع أجهزة AFM المتاحة.
    1. ضع الإعداد من الخطوة 2.13 على مرحلة AFM. سوف المغناطيسي الفولاذ المقاوم للصدأ عينة القرص تعطيل العينة على خشبة المسرح. السماح بالوقت لإعداد والمرحلة لتحقيق التوازن حراريا.
    2. استخدم وضع النقر لمسح مساحة كبيرة بما فيه الكفايةمن سطح الميكا. على سبيل المثال، اختر مساحة 5 × 5 ميكرومتر، نقطية في 512 سطرًا بمعدل مسح يبلغ ~1 هرتز.
      ملاحظة: سوف يزيد وقت الفحص مع منطقة الصورة وعدد الأسطر المحددة لتشكيل الصورة ولكن إنقاص مع معدل المسح الضوئي المحدد كعدد الأسطر الممسوحة ضوئيًا في الثانية. قد تؤثر معدلات المسح السريع على جودة الصورة. ولذلك، فإن سرعة التنقيط ينبغي أن توازن قضائيا المفاضلة بين وقت الاقتناء وجودة الصورة.
  2. لتصوير الحويصلات المرطبة، حدد cantilever مناسبة لمسح عينات ناعمة ورطبة وجبل الكانتيلفير على حامل مسبار مصمم للمسح الضوئي في السوائل.
    ملاحظة: عند اختيار مسبار متوافق مع أجهزة AFM المتاحة، مواصفات التحقيق المدرجة في جدول المواد (الكانتيلفير الثلاثي مع 175 ميكرومتر طول اسمي، 22 ميكرومتر العرض، 20 نانومتر دائرة نصف قطرها طرف، 0.07 N / M ثابت الربيع، و يمكن استخدام الأمثل للتصوير مع تردد محرك الأقراص في النطاق بين 4 إلى 8 كيلوهرتز) كدليل.
    1. الرطب غيض من cantilever مع 1X PBS للحد من احتمال إدخال فقاعات الهواء في السائل أثناء المسح الضوئي.
    2. ضع الإعداد من الخطوة 2.11 على مرحلة AFM. سوف المغناطيسي الفولاذ المقاوم للصدأ قرص عينة تعطيل الميكا المرفقة التي تحتوي على المركبات الكهربائية المعطلة على سطحه.
    3. السماح بالوقت لإعداد ومرحلة AFM لمعادلة حراريا.
    4. صورة سطح الميكا رطب في وضع التنصت. الحصول على كل من ارتفاع ومرحلة الصور.
      ملاحظة: تتأثر جودة التصوير بالأجهزة ومعلمات الفحص المحددة والمسح الضوئي. عند تحسين ظروف المسح الضوئي، يمكن استخدام الخيارات التالية كنقطة بداية: 5 × 5 ميكرومتر منطقة ممسوحة ضوئيًا في 512 سطرًا بمعدل المسح الضوئي وتردد محرك الأقراص بسرعة 0.8-1.0 هرتز تقريبًا.

4. تحليل الصور

ملاحظة: يتم تطبيق خطوات معالجة البيانات وتحليلها التالية على صور الارتفاع المكتسبة. ويمكن تكييف إجراء مماثل لتحليل بيانات المرحلة. هذا الوصف أدناه محدد لGwyddion12،وهو برنامج حر ومفتوح المصدر متاح بموجب رخصة غنو العامة. وتتوفر قدرات مماثلة في أدوات البرمجيات البديلة.

  1. انتقل إلى عملية البيانات، أوضاع SPM، تلميح واختر تلميح النموذج (الشكل 2). حدد الهندسة وأبعاد الطرف المستخدم لمسح العينة وانقر فوق موافق.
  2. تصحيح القطع الأثرية تآكل طرف عن طريق إجراء إعادة بناء السطح. افتح الصورة. من القائمة، حدد عملية البيانات، أوضاع SPM، تلميح،ثم اختر إعادة إنشاء Surface وانقر فوق موافق (الشكل 3).
  3. محاذاة مستوى التصوير لمطابقة مستوى XY المختبر عن طريق إزالة الميل في الركيزة من بيانات المسح الضوئي. لإنجاز هذه المهمة، حدد عملية البيانات والمستوى واختر مستوى المستوى (الشكل 4).
  4. محاذاة صفوف الصورة عن طريق تحديد عملية البياناتوتصحيح البيانات ثم اختر محاذاة الصفوف. تتوفر العديد من خيارات المحاذاة(الشكل 5). على سبيل المثال، الوسيط هو خوارزمية تعثر على متوسط ارتفاع كل سطر مسح وتطرحه من البيانات.
  5. انتقل إلى عملية البيانات، وتصحيح البيانات واختر إزالة الندوب (الشكل 6) ، الذي يزيل أخطاء المسح الضوئي الشائعة المعروفة باسم الندوب.
  6. محاذاة سطح الميكا عند ارتفاع الصفر، Z = 0، عن طريق تحديد قاعدة مسطحة في القائمة المنسدلة المستوى التي يمكن الوصول إليها من عملية البيانات (الشكل 7).
  7. تحديد المركبات الكهربائية على السطح الممسوح ضوئيًا باستخدام علامة حسب العتبة في القائمة المنسدلة الحبوب (الشكل 8A). وتحدد هذه الخوارزمية الاكسوسومات المعطلة على السطح على أنها جسيمات جاحظة من الركيزة ذات السطح الصفري عند الارتفاع فوق العتبة التي يختارها المستخدم. حدد عتبة في النطاق بين 1 و 3 نانومتر، والتي سوف تقضي على معظم تداخل الخلفية. وتستخدم عتبات أصغر مع خلفية أنظف.
    ملاحظة: العتبة في الشكل 8A هي 1.767 نانومتر. وترد في الشكل 8 باءنتائج تحديد الرقم الخارجي للـ MCF-7 مع هذا الحد الأدنى. Gwyddion يقدم العديد من البدائل للعتبة كخوارزمية لتحديد تلقائيا الحويصلات في الصورة، بما في ذلك العتبات الآلية (طريقة أوتسو)، والكشف عن الحافة، وخوارزمية مستجمعات المياه.
    ملاحظة: قد تكون تجمعات الجسيمات، إذا كانت موجودة في صورة AFM، مقنعة ومستبعدة من التحليل.
  8. إجراء توصيف هندسي وأبعاد للمركبات الكهربائية المحددة باستخدام خوارزميات التوزيعات المتوفرة التي يمكن الوصول إليها من قائمة الحبوب.
    ملاحظة: Gwyddion يوفر أدوات لتقييم توزيع الخصائص ذات القيمة العددية، والواقعية، الحجمية، وغيرها من الخصائص من المركبات الكهربائية المعطلة في حالة رطبة أو dessicated. يظهر مثال لخاصية القيم العددية في الشكل 9، الذي يعطي توزيع الارتفاعات القصوى ضمن بصمة كل خارجي محدد.
  9. تصدير بيانات AFM من Gwyddion لتحليل متخصص بواسطة أدوات حسابية أخرى وبرامج كمبيوتر مخصصة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تثبيت سطح المركبات الكهربائية هو خطوة حاسمة في تسلسل التصوير. سوف يحدث تجميد السطح الكهروستاتيكي من exosomes، المعروف أن لديها إمكانات زيتا سلبية، بقوة بعد تعديل الركيزة الميكا أن يكون لها شحنة سطح إيجابية. دون العلاج مع NiCl2 لنقل التغيرات السطحية الإيجابية، تم العثور على تجميد المركبات الكهربائية على الركيزة لتكون غير فعالة. صورة الارتفاع في الشكل 10A، التي تم الحصول عليها في الهواء بعد عينة MCF-7 exosome تحتوي على 2.59 × 1010 الحويصلات لكل مل من PBS تم احتضانها لمدة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إن تجميد المركبات الكهربائية من سائل بيولوجي، ومسح سطحي، وتحليل الصور هي الخطوات الأساسية للبروتوكول المطور لتوصيف AFM للمركبات الكهربائية في السائل. عدد الحويصلات القابلة لموازين التصوير AFM مع المساحة السطحية المصورة والتركيز السطحي للحويصلات المعطلة على الركيزة. نظرا لإمكانات زيتا السلبية من المركبات الكهربائية وexosomes18،ونحن ندعو إلى تثبيت كهرباء من المركبات الكهربائية من العينات السائلة إلى الركيزة AFM. يكون تجميد الحركة فعالاً عندما يتم شحن السطح بشكل إيجابي. قبل تجميد EV، قد تحتاج إلى نقل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وينوه المؤلفون بالدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (رقم الجائزة IGERT-0903715)، وجامعة يوتا (منحة بذور الهندسة الكيميائية وجائزة زمالة بحوث الدراسات العليا)، ومعهد سكولكوفو للعلوم والتكنولوجيا (زمالة سكولتيك).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وحدة تحكم AFM/STM BrukerMultimode Nanoscope Vتدعم وحدة التحكم AFM هذه تصوير العينات البيولوجية في السائل والهواء.
أقراص عينة معدنية AFM / STM (10 مم)TedPella16207قرص عينة معدني يتم توصيل قرص الميكا عليه بشريط على الوجهين أو أي وسيلة أخرى.
أقراص الميكا AFM/STM (10 مم)TedPella50ميكا V1 عالية الجودة، بسمك 0.21 مم (0.0085 بوصة). متشابكة ، في عبوات من 10. يمكن تركيبه على أقراص AFM / STM. متوفر بأربعة أقطار مسبار
AFM للتصوير في الهواء BrukerTESP-V2مجسات سيليكون محفورة عالية الجودة لوضع التنصت ووضع عدم الاتصال للمسح في الهواء.
مسبار AFM لتصوير العينة الناعمة فيناتئ نيتريد السيليكون الناعم Bruker MLCT السائل مع أطراف نيتريد السيليكون ، وهي مناسبة تماما للتشغيل السائل. يتيح النطاق في ثوابت القوة للمستخدمين تصوير عينات ناعمة للغاية في وضع التلامس بالإضافة إلى التحليل الطيفي للحمل العالي مقابل المسافة.
شريط مزدوج الوجهينطيف360-77705يستخدم لإصلاح قرص الميكا على قرص العينة المعدنية.
ExoQuick-TCSystem BiosciencesEXOTC50A-1ExoQuick-TC عبارة عن مجموعة مملوكة تعتمد على البوليمر مصممة لعزل الإكسوسوم عن وسائط زراعة الأنسجة.
مسبار زجاجي حامل AFM للتصوير في السائلBruker  MTFML-V2تصميم حامل المسبار الزجاجي هذا للمسح الضوئي في السوائل باستخدام MultiMode AFM. يمكن استخدام الحامل في وضع التنصت على قوة الذروة ، ووضع الاتصال ، ووضع التنصت ، وتعديل القوة. يتم تشغيل المسبار صوتيا بواسطة مذبذب بيزو منفصل لتعديل سعة أكبر. يتم تزويد الحامل بمنفذين ، والتركيبات المطلوبة ، ومجموعة الملحقات لإضافة السوائل وإزالتها.
جويديونالتشيكي للمترولوجيا.الإصدار 2.52برنامج مفتوح المصدر لتصور وتحليل حقول البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق تقنيات الفحص المجهري للمسح.
ورق نشاف خال من الوبرGE Healthcare Whatman ورق النشاف من الدرجة GB003استخدم ورق النشاف هذا لإزالة NiCl2< / sub> بعد تعديل ركيزة الميكا.  
مناديل غرف الأبحاث الخالية من الوبرTexwipeAlphaWipe TX1004استخدم مناديل البوليستر هذه لتنظيف الأسطح.
كلوريد النيكل (II) (NiCl 2< / sub>) مسحوقSigma-Aldrich339350يستخدم لصنع 10 ملي مولار NiCl 2< / sub > في محلول ملحي مخزن بفوسفات الماء
DI (1x)Gibco10010023PBS ، درجة الحموضة 7.4
تم معهد

المراجع

  1. Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
  2. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
  3. Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
  4. Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
  5. Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
  6. Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001(2018).
  7. Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
  8. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  9. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
  10. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750(2019).
  11. Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
  12. Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
  13. Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  14. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
  15. Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34(2013).
  16. Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
  17. Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
  18. Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603(2015).
  19. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
  20. Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
  21. Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11(2016).
  22. Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  23. Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
  24. Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
  25. van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة