تحليل Mitochondrial مجمعات سلسلة التنفس في "الخلايا البشرية المزروعة" استخدام التفريد جل Polyacrylamide الأصلي الأزرق وإيمونوبلوتينج

ملخص

هذا البروتوكول يوضح تحليل سلسلة التنفس المتقدرية المجمعات بالتفريد زرقاء هلام polyacrylamide الأصلية. ويرد هنا طريقة تطبيقها على الخلايا البشرية المزروعة.

الملخص

ويقوم التنفس المتقدرية بالمجمعات الفسفرة (أوكسفوس) داخل الميتوكوندريا. يمكن التشويش العوامل الداخلية والبيئية في الجمعية واستقرار المجمعات أوكسفوس. يصف هذا البروتوكول تحليل سلسلة التنفس المتقدرية المجمعات بالتفريد جل polyacrylamide الأصلي الأزرق (BN-الصفحة) في التطبيق على الخلايا البشرية المزروعة. أولاً، يتم استخراج الميتوكوندريا من الخلايا باستخدام ديجيتونين، ثم استخدام مالتوسيدي دوديسيل، مجمعات أوكسفوس سليمة يتم عزل من أغشية الميتوكوندريا. ثم يتم حل مجمعات أوكسفوس بالتفريد جل التدرج حضور صبغ مشحونة سلبا، أخذ الأزرق، الذي يمنع تجميع البروتين ويضمن التنقل الغرواني الكهربي للبروتين المجمعات نحو الكاثود. وأخيراً، يتم الكشف عن مجمعات أوكسفوس قبل إيمونوبلوتينج القياسية. وهكذا، هو BN-صفحة تقنية مريحة وغير مكلفة التي يمكن استخدامها لتقييم الجمعية العامة مجمعات أوكسفوس كامل، على النقيض من الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة الأساسية يتيح دراسة فقط الفردية أوكسفوس مفارز المعقدة.

المقدمة

الميتوكوندريا هي العضيات المتعددة الوظائف التي تلعب دوراً هاما في إنتاج الطاقة، وتنظيم الأيض الخلوية، إشارات، المبرمج، الشيخوخة، إلخ^1،،من²³. يعتمد إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا على الدالة الفسفرة الأزواج التنفس مع توليف ATP. في الخلايا البشرية، يتألف نظام الفسفرة المتقدرية (أوكسفوس) من المجمعات الخمسة. إنشاء مجمعات من الأول إلى الرابع تدرج بروتون الكهروكيميائية في الفضاء intermembrane الميتوكوندريا التي تستخدمها الخامس مجمع لإنتاج ATP. كل أوكسفوس المعقدة مولتيميريك، وما عدا الثاني معقدة، تتألف من الوحدات الفرعية مرمزة بواسطة المورثات النووية سواء المتقدرية. أي عيوب في المكونات الأساسية لمجمعات أوكسفوس بسبب الطفرات أو الإجهاد البيئي يمكن التشويش على الجمعية ووظائف النظام الفسفرة. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب الجمعية المناسب الوظيفي أوكسفوس مجمعات عددا كبيرا من الجمعية العوامل^4،،من⁵⁶.

هلام polyacrylamide الأصلي الأزرق التفريد (BN-صفحة) هو أسلوب أساسي تمكين تحليل البروتين سليمة المجمعات ويمكن استخدامها لدراسة الجمعية العامة للمجمعات أوكسفوس. أولاً، الميتوكوندريا معزولة من الخلايا التي ديجيتونين، وهو خفيف منظفات التي بيرميبيليزيس غشاء البلازما للخلايا. ثم، باستخدام مالتوسيدي سولفات، يتم إطلاق سراح مجمعات أوكسفوس من أغشية الميتوكوندريا. باستخدام التفريد جل التدرج، يتم فصل مجمعات أوكسفوس حسب كتلتها. أخذ G-250 الأزرق (لا R-250) إضافة إلى المخزن المؤقت عينة والمخزن المؤقت كاثود الأزرق تنأى بالجمعيات المنظفات مجا ولكن يحافظ على سلسلة التنفس فرادى مجمعات سليمة⁸. أثناء التفريد، يتم استبدال كاثود الأزرق المخزن المؤقت الذي يحتوي على صبغ الكاثود المخزن المؤقت دون صباغة، مما يضمن كفاءة نقل مجمعات أوكسفوس ل الغشاء PVDF⁸. تصور مجمعات أوكسفوس، هو الغشاء PVDF المحتضنة تسلسلياً مع الأجسام المضادة المقابلة للوحدات الفرعية المحددة من المجمعات أوكسفوس الخمسة.

يمكن تطبيق الأسلوب الموصوفة هنا مع بعض التعديلات لأي الخلايا المستزرعة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحليل مجمعات أوكسفوس في الميتوكوندريا المعزولة من عينات الأنسجة⁹. BN-الصفحة يتطلب على الأقل 5-10 ميكروغرام من الميتوكوندريا لكل عينة في تشغيل. باستخدام الطريقة الموضحة هنا، 500,000 مثقف خلايا مثل HEK293، SH SY5Y أو يمكن أن تسفر عن الخلايا 143B حوالي 10 ميكروغرام من الميتوكوندريا. ومع ذلك، كمية كافية من الخلايا لتحليل BN يعتمد على نوع الخلية المحددة.

هو الأسلوب الأكثر شيوعاً لدراسة الميتوكوندريا أوكسفوس البروتينات الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والنشاف الغربية. بيد أن الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تتيح دراسة فقط مفارز أوكسفوس الفردية وخلافا لصفحة الجبهة الوطنية، لا يمكن استخدامها لتقييم الجمعية بأكملها أوكسفوس المجمعات. صفحة أصلي واضح يفصل البروتين المجمعات في الشروط الأصلية دون الوجود صبغ مشحونة سلبا وقد حل أقل بكثير بالمقارنة مع BN-الصفحة. بيد أن الصفحة الأصلية واضحة أكثر اعتدالا من BN-الصفحة حيث أنه يمكن الاحتفاظ بالجمعيات سوبراموليكولار مجا مجمعات البروتين مثل سوبيركومبليكسيس أوكسفوس التي يتم فصلها تحت ظروف BN-الصفحة¹⁰. في هذا البروتوكول، يتم استخدام هلام التدرج لفصل المجمعات؛ ومع ذلك، بدلاً من ذلك، فصل غير التدرج يمكن استخدامها إذا لم يكن صانع التدرج مكلفة نسبيا المتاحة¹¹.

المهم، الأسلوب الموصوفة هنا يسمح تحليل الجمعية العامة للمجمعات أوكسفوس، في حين لا يتم تقييم الأداء الوظيفي للمجمعات. صفحة BN الاستبانة تليها في جل نشاط الإنزيم¹¹ فضلا عن مقايسة النشاط الأنزيمي سبيكتروفوتوميتريك المجمعات المتقدرية¹² تقنيات فعالة للتحليل الوظيفي من المجمعات أوكسفوس. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب لا الاعتداء الجمعية العامة للمجمعات أوكسفوس.

وهكذا، BN-الصفحة هو الأسلوب الأمثل للتحقيق في الجمعية العامة مجمعات أوكسفوس الفردية. على سبيل المثال، بعض الاضطرابات الميتوكوندريا، مثل يبر وراثية الألياف البصرية الاعتلال العصبي (لون)، اعتلال الدماغ الميتوكوندريا مع الحماض اللبن والسكتة الدماغية مثل الحلقات (ميلس)، ترتبط مع الجمعية غيرت من مكون واحد أو أكثر من أوكسفوس ⁵من النظام. باستخدام الأسلوب BN-الصفحة الموصوفة هنا، يمكن دراسة الآليات الجزيئية لأمراض الميتوكوندريا.

البروتوكول

سبانوتي: هذا البروتوكول يستند منشور المقترنة بواسطة هيلاندير et al.¹³ .

1-إعداد المخازن المؤقتة والحلول

ملاحظة: جميع المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في البروتوكول ويرد في الجدول 1. أحجام المخازن المؤقتة المعطاة تكفي لإعداد وتشغيل 10 عينات. ويمكن تخزين كافة المخازن المؤقتة عند + 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.

1. إعداد 20 مل 3 س جل المخزن المؤقت الذي يحتوي على حمض أمينوكابرويك 1.5 م، 150 مم مكررا-تريس في الماء المقطر (dH₂س). ضبط الأس الهيدروجيني إلى الإصدار 7.0.
2. إعداد 10 مل حمض أمينوكابرويك م 2 في dH₂o.
3. إعداد 1 مل المتقدرية المخزن المؤقت عن طريق الجمع بين ما يلي: 0.5 مل 3 س جل المخزن المؤقت، 0.5 مل حمض أمينوكابرويك م 2 و 4 ميليلتر من 500 مم يدتا.
4. إعداد 1,000 مل من الكاثود مخزن يحتوي على 15 مم من تريس مكررا و 50 مم من تريسيني في dH₂O. ضبط الأس الهيدروجيني إلى الإصدار 7.0.
   1. إعداد 200 مل من كاثود الأزرق المخزن المؤقت عن طريق إضافة 0.04 غ G-250 أخذ الأزرق إلى 200 مل من الكاثود المخزن المؤقت.
5. إعداد 1,000 مل من اﻷنود مخزن يحتوي على 50 مم مكررا-تريس في dH₂O. ضبط الأس الهيدروجيني إلى الإصدار 7.0.
6. إعداد 2.5 مل من العينة المخزن المؤقت الذي يحتوي على حمض أمينوكابرويك 750 ملم والأزرق أخذ 5% G-250 في dH₂o.

2-إعداد ليساتيس الميتوكوندريا

1. لوحة الخلايا قبل جمع اليوم. للخلايا HEK293 أو 143B، تعديل استخدام دولبيكو المتوسطة النسر (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% ل الجلوتامين، البنسلين 100 مغ/مل وستربتوميسين 100 ملغ/مل. تنمو الخلايا في حاضنة ثقافة خلية في +37 درجة مئوية في جو هوميديفيد₂ CO 5%. التأكد من أن هناك خلايا 500,000 على الأقل لكل عينة في يوم جمع.
2. تغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني المثلج بلطف. تجنب فصل الخلايا من اللوحة. تتخلص من الخلايا وبيليه لهم في 800 x غ لمدة 10 دقائق في + 4 درجة مئوية.
3. أغسل بيليه خلية مرتين مع برنامج تلفزيوني المثلج، والطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 2، 2. قياس تركيز البروتين مع أسلوب برادفورد باستخدام مجموعة أدوات تجارية. بيليه الخلايا في 800 x ز لمدة 10 دقائق في + 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: بعد جمع الخلايا والقيام بجميع الخطوات في + 4 درجة مئوية ودوامه لا تفعل.
4. إعداد 20 مل من برنامج تلفزيوني مع مثبط البروتياز بإضافة 200 ميليلتر من مثبطات البروتياز x 100 مل 20 من برنامج تلفزيوني. الحفاظ على الجليد. ريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني مع مثبط البروتياز لتركيز بروتين نهائي من 5 ملغ/مل.
   1. لحساب حجم برنامج تلفزيوني مع مثبط البروتياز بحاجة إلى ريسوسبيند الخلايا في 5 ملغ/مل، حساب كمية البروتين في كل عينة. لهذا الحساب، استخدم تركيز البروتين يقاس في الخطوة 2، 3، وحجم برنامج تلفزيوني المستخدمة في ريسوسبيند الخلايا بعد الغسيل في الخطوة 2، 3.
5. إعداد 1 مل ديجيتونين 3.3 ملم في برنامج تلفزيوني مع مثبط البروتياز. إضافة ديجيتونين مم 3.3 إلى تركيز نهائي من 1.65 مم. يخلط جيدا واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
   1. لتحضير 1 مل ديجيتونين 3.3 ملم في برنامج تلفزيوني مع مثبطات البروتياز، حل 4 مغ ديجيتونين في 1 مل من برنامج تلفزيوني في 100 درجة مئوية حتى لا متسرعا مرئية وباردة على الجليد فورا. إضافة 10 ميليلتر من مثبطات البروتياز x 100 إلى 1 مل من محلول ديجيتونين.
      ملاحظة: استخدم فقط حلاً جديدة من ديجيتونين.
      تنبيه: ديجيتونين السامة! استخدام قناع لوجه وقفازات ومعطف معمل.
6. إضافة برنامج تلفزيوني مع مثبط البروتيناز (إعدادها في الخطوة 2، 4) بحجم 1.5 مل النهائي. الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في الساعة 10,000 x ز + 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية. في هذه الخطوة، يتم القريبون الميتوكوندريا.
7. ريسوسبيند بيليه المتقدرية mitochondrial المخزن المؤقت. حجم المخزن المؤقت المتقدرية نصف حجم برنامج تلفزيوني في الخطوة 2، 4.
8. إعداد 10% دوديسيل مالتوسيدي جديدة في برنامج تلفزيوني يحتوي على مثبط البروتياز (إعدادها في الخطوة 2، 4). 1 مل يكفي للعينات العشر. إضافة 10% دوديسيل مالتوسيدي بتركيز نهائي من 1%. احتضان بالثلج لمدة 15 دقيقة (هذه الخطوة يمكن أن تكون أطول تصل إلى بضع ساعات).
9. أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 20 دقيقة في + 4 درجة مئوية. جمع المادة طافية في أنبوب جديد. قياس تركيز البروتين بواسطة الأسلوب برادفورد باستخدام مجموعة أدوات. إضافة نموذج العازلة، وحدة تخزين نصف حجم مالتوسيدي دوديسيل المستخدمة في الخطوة 2.8. ويمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

3-إعداد التدرج جل BN-الصفحة

1. صب جل التدرج لصفحة الجبهة الوطنية في درجة حرارة الغرفة. وضع صانع التدرج في لوحة ضجة وتوصيله مع أنابيب مرنة إلى مضخة تمعجية. إرفاق تسريب تعيين مع الإبرة للأنبوب. ضع محرض مغناطيسي في الدائرة الدانية صانع التدرج. أغسل الأنبوب مع dH₂س في سرعة المضخة الحد الأقصى لمدة 10 دقائق.
2. إفراغ الأنبوب وصانع التدرج. استخدام بيبيت لإزالة أي بقايا dH₂س في القناة بين دوائر صانع التدرج. إغلاق القناة والأنابيب مع الصمام.
3. استخدام الإطار الصب والمشابك تجميع ألواح الزجاج اثنين في حامل، الذي ثقب في الجزء السفلي، ووضعه على الوقوف. تأكد من أن أكثر أو أقل على سطح مستقيم مع توازن الماء. مكان الإبرة متصلة بالانبوب بين ألواح الزجاج.
4. إعداد الحلول هلام 6 في المائة و 15 في المائة (الجدول 2). الحفاظ على الجليد. إضافة بيرسولفاتي الأمونيوم (الجزائرية) وتيتراميثيلينيدياميني (تيميد) (تبدأ البلمرة) آخر. فقاعات المزيج برفق تجنب الوقوع في الهواء.
5. تحميل الدانية نهاية الدائرة أنابيب متدرجة-جل-خلاط مع هلام 6% ونهاية القاصي مع جل 15%. ينبغي أن يكون الحجم الإجمالي للجل مساوية لحجم هلام الفاصلة بين ألواح الزجاج. وبالتالي، استخدام 2.6 مل من هلام 6% و 2.1 مل من جل 15% إلى خلاط جل التدرج لجل واحد 8.3 × 7.3 سم الحجم.
6. التبديل على محرض المغناطيسية، وفتح الأنبوب والقناة بين دوائر صانع التدرج. قم بالتبديل على مضخة تمعجية فورا إلى 5 مل/دقيقة ملء ألواح الزجاج، ولا تسمح لفقاعات لإدخال الهلام. إزالة الإبرة عندما يكون هناك لا جل في الأنبوب.
7. تراكب الهلام مع إبقاء O. الهلام في درجة حرارة الغرفة على الأقل 1 ح البلمرة dH₂بلطف.
8. فورا بعد سكب الهلام، أغسل الأنبوب بملء الدوائر التدرج مع dH₂س واستخدام مضخة تمعجية بالسرعة القصوى. عند إعداد المواد الهلامية اثنين وأكثر، دائماً تنظيف النظام بين بين.
9. إعداد 1 س جل العازلة بخلط 3 مل 3 س جل المخزن المؤقت وإضافة 6 مل من dH₂dH إزالة سين₂س من سطح الجل مع ورق الترشيح بلطف. أغسل سطح الجل مع 1 س جل المخزن المؤقت. إزالة 1 س جل المخزن المؤقت مع ورق الترشيح بلطف.
   1. تجنب الألياف من ورق الترشيح على الهلام. ولضمان ذلك، قطع الورق إلى قطع صغيرة مع مقص، ولكن لا تمزق الورقة.
10. ضع المشط بين ألواح الزجاج، ولكن لا تزج تماما ليتمكن من صب جل التراص تحت المشط. إعداد 4% التراص هلام (الجدول 2). إضافة وكالة الأنباء الجزائرية وتيميد آخر أنها تبدأ البلمرة بسهولة. المزيج بلطف تجنب فقاعات الهواء.
11. تراكب هلام التراص، تجنب فقاعات تحت المشط، وتزج المشط تماما. اسمحوا التراص هلام بلمرة لإزالة المشط على الأقل 30 دقيقة ويغسل الآبار مع 1 س جل المخزن المؤقت باستخدام بيبيت.
    1. بعد البلمرة، يمكن تخزين الجل عند + 4 درجة مئوية لبضعة أيام. لتخزين الهلام، التفاف الهلام في ورقة غارقة مع dH₂س والبلاستيك فيلم لمنع تجفيف جل.

4-التفريد جل الأصلية أزرق

ملاحظة: لمنع تدهور أوكسفوس المجمعات تشغيل التفريد عند + 4 درجة مئوية. تستخدم مخازن مبردة مسبقاً.

1. تحميل الكاسيت هلام مع المخزن المؤقت كاثود الأزرق حتى الجزء السفلي من الآبار. تحميل عينات من الأسهل عندما لم يتم ملء الكاسيت إلى الأعلى. غسل الآبار مع المخزن المؤقت كاثود الأزرق ثم قم بملء الآبار مع الكاثود الأزرق المخزن المؤقت باستخدام بيبيت.
2. تحميل العينات (5-30 ميكروغرام من البروتين) في الآبار. بلطف ملء كاسيت جل إلى الأعلى مع المخزن المؤقت كاثود الأزرق والخزان مع اﻷنود المخزن المؤقت.
3. تشغيل هلام لمدة 15 دقيقة في جهد مستمر من 40 الخامس. ثم زيادة الجهد إلى 80 الخامس (أو استخدام تيار مستمر من 6 mA)، لا تتجاوز 10 mA. تشغيل الهلام حتى الصبغ يصل إلى 2/3 طول هلام.
4. يستعاض عن المخزن المؤقت كاثود الأزرق مع المخزن المؤقت الكاثود ويستمر التفريد الجبهة صبغ قد نفد. وفي المجموع، يأخذ التفريد حوالي 3 ساعات.
5. استرداد ألواح الزجاج ونقل البروتينات إلى غشاء الفلوريد (PVDF) الفينيليدن بشبه الجاف النشاف. استخدام جهد مستمر من 25 الخامس والحالي يقتصر على 1.0 A لمدة 30 دقيقة.
   1. وبدلاً من ذلك، استخدم النشاف الرطب لنقل مجمعات أوكسفوس لغشاء PVDF.
6. تواصل مع حجب الحضانة الأغشية والأجسام المضادة وفقا لبروتوكول إيمونوبلوتينج القياسية. استخدام الأجسام المضادة الأولية ضد مفارز مجمعات أوكسفوس تسلسلياً.
   ملاحظة: على سبيل المثال، استخدام الأجسام المضادة--NDUFA9 (1:2000) للمجمع الأول، جسم مكافحة--سدهى (1:2000) لمجمع الثاني، جسم المضادة-UQCRC2 (1: 1000) لمعقدة ثالثا، مكافحة COX1 الأجسام المضادة (1:2000) لمجمع جسم رابعا ومكافحة--ATP5A (1:2000) للخامس المعقدة. وترد قائمة الأجسام المضادة في الجدول للمواد.

النتائج

استخدام صفحة الجبهة الوطنية، يمكن أن تحقق العيوب في جمعية الميتوكوندريا أوكسفوس المجمعات. الرقم 1A يظهر جمعية مجمعات سلسلة التنفس في الخلايا البشرية نيوروبلاستوما (ش-SY5Y) تعامل مع الكلورامفينيكول، الذي يمنع على وجه التحديد ترجمة ترميز متدنا مفارز أوكسفوس. الكلورامفينيكول المستنفد مجمعات أوكسفوس يحتوي على ترميز ميتوتشوندريالي مفارز (مجمع الأول والثالث، الرابع؛ الرقم 1A)، بينما كان الثاني المعقدة، التي يتم ترميز حصرا بالمورثات النووية، كومبينساتوريلي أوبريجولاتيد. المجمع الخامس لم يكن إيمونوبلوتيد هنا.

عدة دورات تجميد أذاب تدمير المجمعات أوكسفوس. الرقم 1B يوضح تدهور مجمعات أوكسفوس بدورات تجميد أذاب. المجمعات التنفسية المتقدرية في عينة 3 التي خضعت لعدة دورات تجميد أذاب خفض كثافة فرقة وهي تحول بالمقارنة مع نفس العينات، التي تم تجميدها مرة واحدة فقط. صورة uncropped لطخة غربية الشكل 1B يرد في الملحق رقم 1.

المهم نوعية الجل العصابات حادة وواضحة. الرقم ج 1 يدل إيمونوبلوت من جل أن لا بلمرة جيدا. تجريد من الغشاء يمكن أن تؤثر أيضا الكشف عن مجمعات أوكسفوس. في الشكل 1 د، المعقدة قد اكتشفت قبل أو بعد تجريد. إشارة إلى نسبة الضوضاء أقل بكثير بعد تجريد.

الرقم 1-إيمونوبلوتس BN-صفحة من التجارب الناجحة ودون المستوى الأمثل. (أ) "استنفاد أوكسفوس" المجمعات مثبط للترجمة المتقدرية. وعولج الخلايا البشرية نيوروبلاستوما (ش-SY5Y) مع الكلورامفينيكول (CAP) لمدة 48 ساعة. CTRL، خلايا المراقبة دون العلاج الكلورامفينيكول. لوحة السفلي يظهر التحديد الكمي إيمونوبلوت. قيمة عنصر التحكم هو اعتبار 1 (يظهر كخط متقطع). وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة، n = 3، * ف مزاوج < 0.0001 بالمقارنة مع التحكم باستخدام t-اختبارات الطالب. (ب) دورات تعطيل لمجمعات أوكسفوس بتجميد أذاب متعددة. وتم إعداد العينات 1-3 من الخلايا البشرية osteosarcoma (143B) في نفس الظروف. عدد العينات 1 و 2 كانت مجمدة وذاب مرة واحدة فقط، بينما عدد العينة 3 خضع لأربع دورات لتجميد أذاب. (ج) BN-الصفحة إيمونوبلوتس من مجمعات أوكسفوس المعزولة من الخلايا HEK293. تلطيخ العصابات بسبب تدني نوعية الجل. (د) أثر تجريد في الكشف عن مجمعات أوكسفوس. كشف المجمع الأول في الخلايا البشرية نيوروبلاستوما (ش-SY5Y) قبل وبعد تجريد من الغشاء نفسه. مجمعات أوكسفوس تم الكشف عن استخدام الأجسام المضادة NDUFA9 (مجمع أنا)، جسم المضادة-سدهى (مجمع الثاني) ومكافحة UQCRC2 جسم (مجمع الثالث) ومكافحة COX1 جسم (مجمع الرابع). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المخزن المؤقت أو الحل	تكوين	وصفه
3 x جل المخزن المؤقت	1.5 حمض أمينوكابرويك M	ز 3.94 من حمض أمينوكابرويك
	150 مم مكررا-تريس	ز 0.63 في تريس مكررا
	dH2س	إضافة dH2س إلى 20 مل
	درجة الحموضة 7.0	ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0
المخزن المؤقت الكاثود	مم 15 مكررا-تريس	ز 3.14 في تريس مكررا
	تريسيني 50 مم	ز 8.96 من تريسيني
	dH2س	إضافة dH2س إلى 1000 مل
	درجة الحموضة 7.0	ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0
المخزن المؤقت كاثود الأزرق	أخذ 0.02% أزرق ز	ز 0.04 جرام Serva الأزرق
	مم 15 مكررا-تريس	200 مل من المخزن المؤقت الكاثود
	تريسيني 50 مم
	dH2س
	درجة الحموضة 7.0
المخزن المؤقت اﻷنود	50 مم مكررا-تريس	ز 20.93
	dH2س	إضافة dH2س إلى 2000 مل
	درجة الحموضة 7.0	ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0
المخزن المؤقت المتقدرية	1.75 حمض أمينوكابرويك م	0.5 مل 3 س جل المخزن المؤقت
	75 مم مكررا-تريس	0.5 مل حمض أمينوكابرويك م 2
	2 مم يدتا	4 ميليلتر من 500 مم يدتا
	dH2س	-
	درجة الحموضة 7.0	-
المخزن المؤقت للعينة	حمض أمينوكابرويك 750 مم	0.94 مل حمض أمينوكابرويك م 2
	الزرقاء كوماسي 5% G	ز 0.125 غ Serva الأزرق
	dH2س	إضافة س dH2إلى 2.5 مل
حمض أمينوكابرويك م 2	حمض أمينوكابرويك م 2	ز 2.62 حمض أمينوكابرويك
	dH2س	إضافة dH2س إلى 10 مل

الجدول 1. المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة لصفحة الجبهة الوطنية.

المواد الهلامية الأصلية الزرقاء	فصل 6% هلام	فصل 15% هلام	التراص هلام 4%
3 x جل المخزن المؤقت	3.3 مل	3.3 مل	مل 1.64
37.5:1 الاكريلاميد/مكررا 40%	1.5 مل	مل 3.75	0.5 مل
dH2س	مل 5.14	مل 0.93	مل 2.77
الجلسرين	0	2 مل	0
فوق كبريتات الأمونيوم 10% *	60 ميليلتر	10 ميليلتر	60 ميليلتر
تيميد	4 ميليلتر	2 ميليلتر	ميليلتر 6
الحجم الإجمالي	10 مل	10 مل	5 مل
* جعل طازجة دائماً فوق كبريتات الأمونيوم 10% في dH2س

الجدول 2. وصفات لجل لصفحة الجبهة الوطنية.

التكميلية الرقم 1-صورة uncropped لطخة غربية الشكل 1B. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

المناقشة

واحدة من أهم أجزاء من البروتوكول هو الحفاظ على مجمعات أوكسفوس سليمة أثناء إعداد عينة، التخزين وهلام التفريد. وهكذا، ينبغي أن الميتوكوندريا المعزولة في + 4 درجة مئوية والعينات يجب أن لا تخضع لدورات تجميد أذاب. يمكن أن تتسامح مجمعات أوكسفوس سوى دورة واحدة من دورات تجميد أذاب أثناء الإجراء بأكمله. عدة دورات تجميد أذاب تدمير مجمعات أوكسفوس (الشكل 1B). وينبغي إعداد التحكم والعينات التجريبية التي يمكن مقارنتها بالتوازي لتجنب أي خلافات في ظروف التخزين، والتي قد تعطي نتائج مضللة. إذا كان من غير الممكن القيام بجميع الخطوات للبروتوكول بالتوازي مع جميع العينات، نوصي بتجميد الكريات خلية غسلها في-80 درجة مئوية (الخطوة 1، 4 في هذا البروتوكول)، وبعد القيام ببقية البروتوكول لجميع العينات معا على الأقل حتى انتخابات هلام تروفوريسيس. وينبغي إيلاء اهتمام خاص لنظافة جهاز التفريد (الدبابات، كاسيت). إذا تم استخدام نفس الجهاز للحزب الديمقراطي الصربي صفحة، تغسل جيدا قبل BN-الصفحة. يمكن أن يسبب أي المخزونات المتبقية الانفصال المجمعات أوكسفوس أثناء التفريد.

المواد الهلامية المتدرجة عالية الجودة جزء أساسي آخر من البروتوكول. المواد الهلامية الخرسانة الجاهزة للصفحة الأصلية الزرقاء متوفرة تجارياً؛ ومع ذلك، لا ينصح للاستفادة منها، ونظرا للمخازن المؤقتة المستخدمة للمواد الهلامية التجارية قد يكون تكوين، الذي يختلف عن نموذج المخازن المؤقتة. تدرج جل المستخدمة هنا (6-15 ٪) الأمثل للفصل بين الفردية أوكسفوس المجمعات. للكشف عن هياكل supramolecular مرتبة أعلى من أوكسفوس، سلسلة التنفس المعروف أيضا سوبيركومبليكسيس¹⁴، هو بعض التحسين المطلوب¹¹.

لتصور أوكسفوس المجمعات استخدام أجسام مضادة محددة التتابع، استناداً إلى خصائصها. على سبيل المثال، استخدم أولاً جسم يعطي إشارة أضعف والجسم مع أقوى إشارة آخر. وهذا أمر مهم حيث تعرية يضعف في الكشف عن (الشكل 1). يمكن أن يحقق تكوين مجمعات سلسلة التنفس إذا بعد BN-صفحة تعرض الهلام للبعد الثاني الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة¹⁵.

البروتوكول هو موضح هنا تشير إلى استخدام الأجسام المضادة ضد مجمعات أوكسفوس الفردية تسلسلياً. ومع ذلك، يمكن استخدامها جسم أوكسفوس المتاحة تجارياً كوكتيل للكشف عن جميع مجمعات أوكسفوس خمسة في وقت واحد. ومع ذلك، لتكون قادرة على كشف مجمع بشكل كامل أوكسفوس المجمعات وتحديد هويتهم، الأجسام المضادة ضد مجمعات أوكسفوس الفردية ينبغي أن تستخدم تسلسلياً. هذه الخطوة مضيعة للوقت؛ ومع ذلك، يمكن أن تكون ضرورية لاختبار شروط تجريبية جديدة ونماذج.

ينبغي أن يكون الأمثل تركيز ديجيتونين المستخدمة لعزل المتقدرية لنوع الخلية المحددة. كمطهر، بيرميبيليزيس ديجيتونين أغشية الخلية. كفاءة بيرميبيليزيس تركيز الأمثل ديجيتونين غشاء البلازما الخلايا المساس باغشية الميتوكوندريا. تركيز منخفض جداً من ديجيتونين يسبب التلوث عالية مقتطفات mitochondrial بينما التركيز العالي جداً الأضرار أغشية الميتوكوندريا ويقلل من إجمالي العائد المتقدرية. نسبة الأمثل ديجيتونين/البروتين (g/g) يختلف من 0.3 إلى 1. يمكن استخدام تحليل لطخة غربية للبروتينات المستخرجة من الكريات وسوبيرناتانتس لاختبار تركيز الأمثل ديجيتونين¹⁶.

هذا البروتوكول لا يشمل البروتين تحميل عنصر التحكم في إيمونوبلوت؛ ولذلك، تركيز البروتين المستخرج من المجمعات يجب بعناية تقاس على الأقل في تريبليكاتيس لضمان تحميل متساوية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تشغيل العينات في صفحة الجبهة الوطنية في replicates. وإذا كانت الجمعية انتقائية أوكسفوس مجمعات البصر، يمكن أن تكون مجمعات لا تتأثر تحميل عناصر التحكم.

تحدي تقدير الكتلة الجزيئية للبروتين المجمعات في الجبهة الوطنية-الصفحة¹⁸. ولا يشمل البروتوكول الحالي علامة الوزن الجزيئي؛ ولذلك، لتقدير الجمعية لمجمعات أوكسفوس، عينات التحكم تحتوي على مجمعات لا تتأثر ينبغي دائماً إدراج في التحليل. عادة ما تكون عينات مراقبة BN-صفحة الخلايا غير المعالجة أو البرية من نوع.

الطريقة المعروضة هنا هو الأمثل للكشف عن سلسلة التنفس المتقدرية المجمعات؛ ومع ذلك، يمكن تطبيقها لتقييم أوليجوميريزيشن للبروتينات المتقدرية¹⁹أيضا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة معدل الجمعية مجمعات أوكسفوس بأول المستنفدة لطبقة فرعية المتقدرية ترميز المجمعات التي تحتوي على الكلورامفينيكول وثم بعد شفائهم بعد إزالة الكلورامفينيكول¹⁰. وهكذا، يمكن استخدام BN-صفحة لتقييم مستويات مستقرة وجمعية أوكسفوس لمختلف التطبيقات بما في ذلك التشخيص الجزيئي لاضطرابات المتقدرية البشرية^9،11.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ألواح خلية 100 مم	Thermo Fisher Scientific	130182
40٪ أكريلاميد / مكرر 37.5: 1	Bio-Rad	161-0148
حمض أمينوكابرويك	Sigma	A2504
بيرسلفات الأمونيوم	Sigma	A3678
Anti-ATP5A	Abcam	14748	الوحدة الفرعية المعقدة V
المضادة ل MTCOI	Abcam	14705	الوحدة الفرعية المعقدة السادسة
المضادة ل NDUFA9	Abcam	14713	الوحدة الفرعية المعقدة الأولى
المضادة ل SDHA	Abcam	14715	الوحدة الفرعية المعقدة II
المضادة ل UQCRC2	Abcam	14745	الوحدة الفرعية المعقدة III
Bis-tris	Sigma	B7535
مجموعة فحص البروتين برادفورد	خلايا BioRad	5000006
	فيشر	11597692
كوماسي أزرق G250 (سيرفا بلو جي)	سيرفا	35050
ديجيتونين	سيجما	D141
DMEM	لونزا	12-614F / 12
EDTA	Life Technologies	15575-038
FBS	Life Technologies	10270106
مصل الأبقار الجنيني	تقنيات	10270106
الجلسرين	(صانع التدرج Sigma	G5516
	Bio-Rad	1654120
لوريل مالتوسيد (n-Dodecyl & -D-maltoside)	Sigma	D4641
L-glutamine	Life Technologies	25030024
L-glutamine	Gibco	25030
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T9281
PBS	Life Technologies	BE17-516F
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
مزود الطاقة	GE Healthcare	EPS 301
مثبطات البروتياز	Thermo Scientific	10137963
Trans-blot turbo mini PVDF	BioRad	1704156
Tricine	Sigma	T9784
Trypsin-EDTA	Gibco	15400054
جهاز الرحلان الكهربائي العمودي	BioRad	1658004