هنا نقوم بوصف طريقة لتصوير متعدد الفوتونات عالية الدقة بفاصل زمني لخلايا أورام الدماغ قبل وبعد التدخل الجراحي الغازي (على سبيل المثال، خزعة) داخل نفس الحيوان الحي. تسمح هذه الطريقة بدراسة تأثير هذه الإجراءات الجراحية الغازية على سلوك الخلايا السرطانية المهاجرة والغازية والتكاثرية على مستوى خلية واحدة.
مقالة منهجية
التصوير التحيئي الطولي لسلوك خلايا أورام الدماغ استجابة لخزعة جراحية غازية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخزعات هي معيار الرعاية لعلاج السرطان ومفيدة سريريا لأنها تسمح تشخيص الورم الصلب، والتشخيص، وتحديد العلاج شخصية. ومع ذلك، فإن اضطراب بنية الورم عن طريق خزعة وغيرها من الإجراءات الغازية قد ارتبط بالآثار غير المرغوب فيها على تطور الورم، والتي تحتاج إلى دراسة متعمقة لزيادة تحسين الفائدة السريرية لهذه الإجراءات. النهج الثابتة التقليدية، التي توفر فقط لقطة من الورم، محدودة في قدرتها على الكشف عن تأثير خزعة على سلوك الخلايا السرطانية مثل الهجرة، وهي عملية ترتبط ارتباطا وثيقا الخبيثة الورم. على وجه الخصوص، هجرة الخلايا السرطانية هي المفتاح في أورام الدماغ العدوانية للغاية، حيث نشر الورم المحلي يجعل استئصال الورم الكلي من المستحيل تقريبا. تطوير التصوير متعدد الفوتونات ونوافذ التصوير المزمن يسمح للعلماء لدراسة هذه العملية الديناميكية في الحيوانات الحية مع مرور الوقت. هنا، نقوم بوصف طريقة للتصوير الطولي عالي الدقة لخلايا أورام الدماغ قبل وبعد خزعة في نفس الحيوان الحي. هذا النهج يجعل من الممكن لدراسة تأثير هذا الإجراء على سلوك الخلايا السرطانية (الهجرة والغزو والانتشار). وعلاوة على ذلك، نناقش مزايا وقيود هذه التقنية، فضلا عن قدرة هذه المنهجية على دراسة التغييرات في سلوك الخلايا السرطانية للتدخلات الجراحية الأخرى، بما في ذلك استئصال الورم أو زرع العلاج الكيميائي رقائق.
المقدمة
معيار الرعاية لمعظم الأورام الصلبة يشمل خزعة الأنسجةللتشخيص، والتشخيص، وتحديد العلاج الشخصي 1،2. عموما، هذه الإجراءات تعطي فائدة سريرية، ولكن الأدلة الأخيرة تشير إلى أن خزعة وغيرها من الإجراءات أكثر الغازية، مثل استئصال الورم، يمكن أيضا أن تؤثر سلبا على تطور الورم3،4،5 , 6.في حين أن هذه الإجراءات لا تزال لا غنى عنها في الرعاية داخل والفوائد التي تتغلب على آثارها السلبية، فمن الضروري أن نفهم تماما الآليات الكامنة وراء هذه الآثار السلبية من أجل تحقيق أقصى قدر من سلامة المرضى و التأثيرات الإيجابية لهذه الإجراءات وجعلها أكثر فائدة سريريا.
يتم تشغيل الآثار غير المرغوب فيها بخزعة على تطور الورم عن طريق التعديلات النظامية والتغيرات في البيئة الدقيقة الورم استجابة لاضطراب الأنسجة4،5. وبالتالي، فمن الضروري لدراسة هذه العملية في الحيوانات الحية. ومع ذلك، فإن العواقب الخفية لهذه الإجراءات طفيفة التوغل يمكن في كثير من الأحيان أن تكون مقنعة من قبل اختلافات كبيرة بين الأفراد. الأساليب التقليدية القائمة على الكيمياء المناعية أو تحليل التعبير النسخي قد تغفل هذه الآثار أو تتطلب أعدادا كبيرة من الحيوانات للتعرف عليها. وعلاوة على ذلك، هذه النهج الثابتة تفتقر إلى القدرة على تحديد التغيرات في سلوك الخلايا السرطانية مثل الهجرة والغزو، والعمليات الحيوية التي ترتبط مع الورم الخبيث. هذه السمات الخلية الورم ية ذات أهمية خاصة لأورام الدماغ العدوانية للغاية، مثل الورم الأرومي الدبقي multiforme (GBM)، حيث الانتشار المحلي للخلايا السرطانية يحد من الاستئصال الجراحي ويقلل من بقاء المريض7. لفهم كامل كيف تؤثر الخزعات على سلوك خلايا GBM، هناك حاجة إلى نهج طولي يسمح بتصور هذه الخلايا في السياق الفسيولوجي للكائنات الحية.
التطور الأخير للتصوير داخل الحيوية عالية الدقة في تركيبة مع نوافذ التصوير المزمن المزروعة جراحيا يسمح للعلماء لدراسة السلوك الديناميكي للخلايا السرطانية في الفئران الحية على مدى أيام متعددة8،9. باستخدام هذا النهج القوي، يمكننا دراسة كيفية تغير السلوك التكاثري والهجرة والتسللي للخلايا السرطانية على مدى عدة أيام استجابة لخزعة في نفس الماوس. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى التي تسمح برصد متعددة الأيام من الأورام في الفئران الحية، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)10، التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي المحوسب (PET / CT)11، أو التصوير الإنارة الحيوية12، وهذا Approach يوفر بشكل فريد إمكانية دراسة سلوك الخلايا السرطانية على مستوى خلية واحدة وكشف التغيرات الدقيقة التي تحدث داخل الورم.
هنا، نقوم بوصف طريقة مفصلة لإجراء إصابة تشبه الخزعة والتصوير الطولي قبل وبعد الخزعة داخل الحيوية في الدماغ من الفئران الحاملة للورم. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة التدخلات الجراحية الأخرى، مثل استئصال الورم الجزئي أو زرع رقاقات العلاج الكيميائي.
البروتوكول
وقد أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان التابعة للأكاديمية الملكية الهولندية للفنون والعلوم، هولندا. تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية المستخدمة في هذه المخطوطة من قبل اللجنة المركزية ديربروفين (CCD) وInstantie voor Dierenwelzijn (IvD).
1. زرع الخلايا السرطانية وإعداد نافذة التصوير القحفي
- الإعداد الجراحي
- استخدام الفئران الكبار (> 6 أسابيع من العمر) من أي سلالة أو نوع الجنس. تُسْدِع الفأر عن طريق الحقن (الفلوانيزون [neuroleptic] + الفنتانيل [الأفيونية]) (0.4 مل/كغ) + البنزوديازيبين المهدئ (2 ملغ/كغ) بجرعة 1:1:2 في الماء المعقم. تقييم حالة التخدير الحيوان عن طريق قرصة اصبع القدم.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استخدام كل من الإناث والذكور C57BL/6 الفئران بسبب نفس الخلفية الوراثية لخط الخلايا السرطانية المستخدمة في هذه التجارب (GL261). سيبقى الفأر مخدرًا بالكامل لمدة 1.5 ساعة. - قم بتركيب الماوس على إطار مجسم وآمن الرأس باستخدام مشبك أنف وشريطين للأذن.
- استخدام مصباح التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. وينبغي استخدام مصباح التدفئة بحذر، وبدلا من ذلك يمكن استخدام المياه إعادة تدوير منصات التدفئة.
- تطبيق مرهم العين لحماية القرنية الماوس من التجفيف.
- استخدام مقص حاد لـ «استخدام الفراء على الجمجمة» (منطقة الظهر من عيون الفأر إلى قاعدة جمجمته) وتطهير الجلد المكشوف بالإيثانول بنسبة 70%.
- قطع الجلد بطريقة دائرية مع مقص حاد وكشط بعيدا periosteum تحت مع مسحة القطن. تطبيق قطرة من ليدوكائين 1٪ + ادرينالين 1:100،000 لمدة 5 دقائق، وإزالة الزائدة مع مسحة القطن.
- الغراء حواف الجلد إلى الجمجمة مع الغراء سيانوكريلات.
- ضع الإطار المجسم تحت مجهر ستيريو تشريح مع التكبير 4X.
- تصور الجمجمة من خلال المجهر تشريح وحفر أخدود دائري من 5 ملم في القطر على العظام الجدارية اليمنى. تنفيذ هذه الخطوة بعناية وفقط سطحية، وتجنب أي ضغط على الجمجمة.
- تطبيق قطرة من القشرة العازلة (125 مل NaCl، 5 مل ككل، 10 M الجلوكوز، 10MM HEPES العازلة، 2 MM MgSO 4، و 2 MM CaCl2 [درجة الحموضة 7.4]) ورفع رفرف العظام باستخدام ملقط رقيقة.
- للخطوات التالية، والحفاظ على سطح الدماغ مغطاة العازلة القشرة ما لم يذكر خلاف ذلك.
- تحت المجهر تشريح، تصور سطح الدماغ وإزالة الأم دورا باستخدام منحنية، مدبب، ملاقط نقطة غرامة جدا. إذا حدث نزيف في هذه المرحلة، استخدم اسفنجة الجيلاتين القابلة للامتصاص لإيقافه.
- استخدام الفئران الكبار (> 6 أسابيع من العمر) من أي سلالة أو نوع الجنس. تُسْدِع الفأر عن طريق الحقن (الفلوانيزون [neuroleptic] + الفنتانيل [الأفيونية]) (0.4 مل/كغ) + البنزوديازيبين المهدئ (2 ملغ/كغ) بجرعة 1:1:2 في الماء المعقم. تقييم حالة التخدير الحيوان عن طريق قرصة اصبع القدم.
- حقن الخلايا السرطانية
- إعادة تعليق الكمية المطلوبة من الخلايا السرطانية الفلورية في ~ 3 ميكرولتر من PBS (على سبيل المثال، للتجارب المبينة في هذا البروتوكول، تم حقن 1 × 105 GL261 الخلايا).
ملاحظة: في حين يمكن استخدام أي علامة الفلورسنت، ينصح بشدة علامة نووية، لتتبع الخلايا السرطانية الفردية أثناء التحليل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام علامة الفلورسنت المرتبطة بالهيستون، مثل H2B، لتصور تكاثف الكروموسوم، وبالتالي لمراقبة انقسام الخلايا. استخدام علامة للتبديل الصورة، مثل Dendra2، يسمح بوضع علامات على الصور وتتبع الخلايا السرطانية على مدى عدة أيام4،13. - تحميل الخلايا السرطانية في حقنة الغاز ضيق 10 درجة مئوية مع إبرة نمط نقطة 2 وإصلاحه على ذراع المتلاعب مجسمة.
- إزالة المخزن المؤقت القشرة. ضع طرف الحقنة في منتصف استئصال الجمجمة وأدخلها على عمق 0.5 مم من سطح الجمجمة. اختياريًا، قم بإنشاء مساحة صغيرة في الدماغ لاستيعاب تعليق الخلايا السرطانية. لهذا، أدخل الحقنة حتى عمق 1 مم ثم استردها حتى 0.5 مم قبل الحقن.
- تطبيق قطرة من القشرة العازلة.
- حقن ببطء تعليق الخلية باستخدام حقن مضخة حقنة مجهرية (250-400 نمل / دقيقة). إزالة الحقنة واستخدام اسفنجة الجيلاتين القابلة للامتصاص لوقف أي نزيف، إذا لزم الأمر.
- إعادة تعليق الكمية المطلوبة من الخلايا السرطانية الفلورية في ~ 3 ميكرولتر من PBS (على سبيل المثال، للتجارب المبينة في هذا البروتوكول، تم حقن 1 × 105 GL261 الخلايا).
- إعداد نافذة التصوير القحفي
- إزالة العازلة القشرة ووضع قطرة من زيت السيليكون على موقع استئصال الجمجمة لتجنب فقاعات الهواء تحت النافذة.
- ختم الدماغ المكشوفة مع غطاء 6 ملم. تطبيق الغراء سيانوكريلات بين غطاء والجمجمة. اضغط برفق على غطاء الجمجمة بمساعدة ملاقط ناعمة لضمان الحد الأدنى من المسافة بين الدماغ وغطاء الغلاف.
- تطبيق الاسمنت الاكريليك الأسنان على سطح الجمجمة، وتغطي حافة غطاء. ضع حلقة رقيقة من الفولاذ المقاوم للصدأ (1.5 مم في القطر الخارجي، 1 مم في القطر الداخلي) حول استئصال الجمجمة والسماح لأسمنت الأسنان لتجف. اختياريا، إضافة بعض الغراء على الحدود لتأمين الحلبة على الجزء العلوي من الرأس.
ملاحظة: هذا النظام تثبيت الرأس هو الأمثل للتصوير على المجهر المقلوب: المغناطيس الصغيرة جزءا لا يتجزأ من مربع التصوير تسهيل تثبيت نافذة التصوير القحفي (CIW). في التجارب المبينة في هذا البروتوكول، تم استخدام مجهر مقلوب. للمجاهر تستقيم، يمكن تحقيق التثبيت عن طريق شريط أو حلقة مع الأخاديد التي يمكن إرفاقها إلى المجهر مع مساعدة من مسامير أو لوحة التي تناسب الحلبة. - لإدارة الألم، حقن جرعة واحدة من 100 ميكروغرام / كغ البوبرينورفين تحت الجلد والسماح للحيواني للتعافي على وسادة التدفئة.
- ضع الماوس في قفص فردي مع ورقة ممزقة للإثراء. مراقبة الماوس عن كثب يوميا في الأيام القليلة الأولى و2X في الأسبوع، وبعد ذلك، للسلوك العادي، والنشاط، والمظهر.
2. التصوير داخل الحيوية
ملاحظة: الفاصل الزمني بين حقن خلية الورم وجلسة التصوير داخل الحيوية الأولى يعتمد على نوع خط الخلايا السرطانية المستخدمة. بالنسبة للتجارب الموضحة في هذا البروتوكول، تم حقن 1x 105 GL261 الخلايا وصورتها بعد 10 أيام.
- إعداد التصوير
- تُسْتِب الفأر باستخدام تخدير استنشاق الأيسوفلوران من خلال قناع الوجه (1.5%-2% isoflurane/O2 خليط).
- حقن الماوس تحت الجلد مع 100 درجة مئوية من العازلة المالحة لمنع الجفاف.
ملاحظة: للتصوير على المدى الطويل، يمكن ترطيب الماوس من خلال مضخة ضخ تحت الجلد. - ضع وجه الماوس في مربع تصوير. استخدم لوحة معدنية مع ثقب قطرها 1 مم ومغناطيس صغير مضمن حول الفتحة لتوفير تثبيت CIW إلى مربع التصوير. إدخال isoflurane من خلال قناع الوجه والتهوية من قبل منفذ على الجانب الآخر من مربع (0.8٪ -1.5٪ isoflurane / O2 خليط). بشكل اختياري، استخدم الشريط لإصلاح جسم الماوس.
ملاحظة: يمكن حقن dextran المسمى بفلورسنت لتصور الأوعية الدموية أو الأصباغ الأخرى عن طريق الوريد في هذه المرحلة. - اختياريًا، استخدم مقياس تأكسج النبض ومسبار التدفئة لمراقبة حيوية الماوس.
ملاحظة: في هذه التجربة، لم يكن من الضروري استخدام مقياس تأكسج النبض ومسبار التدفئة لأن الماوس كان مستقرًا طوال فترة التصوير الزمنية (2-3 ساعة). ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى مراقبة أكثر دقة لأوقات التصوير الأطول. - تعيين 25x (على سبيل المثال، HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 مم) هدف المياه إلى أدنى موقف ضوإضافة قطرة كبيرة من الماء.
ملاحظة: ينصح بشدة استخدام موزع صغير غمر المياه للتجارب طويلة الأجل لأنه يسمح للعلماء لإضافة المياه خلال التجربة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام هدف جاف. - نقل مربع التصوير على المجهر مجهزة غرفة المناخ الظلام أبقى في 37 درجة مئوية. جلب الهدف إلى غطاء CIW حتى قطرة الماء اللمسات عليه.
- باستخدام وضع الظهارة، لاحظ الورم من خلال العدسة وجلب الخلايا إلى التركيز.
- الحصول على صورة الفاصل الزمني
- حدد العديد من المواضع ذات الأهمية للصورة، وسجل إحداثياتها في البرنامج. تأكد من أن المواقف المحددة هي مواقف تمثيلية من مواقع مختلفة من الورم (كل ورم يمكن أن يكون مختلفا، ولكن لضمان الاتساق، حدد نفس الكمية من المواقف التي هي مركزية لجوهر الورم وإلى حواف عبر جميع الفئران).
ملاحظة: يمكن إجراء فحص تجانب لجزء من الورم أو الورم المرئي بأكمله; ومع ذلك، إذا كان الورم كبيرًا، فإن هذه الطريقة ستزيد من الفاصل الزمني بين الصور. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كانت الخلايا السرطانية تتحرك بسرعة، فإنه يمكن أن يكون من الصعب تتبع نفس الخلايا مع مرور الوقت. - التبديل إلى وضع multiphoton وضبط الليزر إلى الطول الموجي الصحيح. لاحظ أنه، لتجنب الأضرار الضوئية، المطلوب ارتفاع الأطوال الموجية.
ملاحظة: بالنسبة لتصوير Dendra2، تم استخدام طول موجة 960 نانومتر. مع الهدف المستخدم في هذه التجارب، كان التكبير من 1.3 كافية للحصول على قرار جيد من نوى الورم وتفحص منطقة تمثيلية للورم. - انتقل إلى الوضع المباشر وحدد z-stack لكل موقف من أجل الحصول على الحجم الأقصى من الخلايا السرطانية دون المساس بقرار الخلايا السرطانية. حدد حجم الخطوة بين الصور على أنه 3 ميكرومتر.
- استخدم الوضع ثنائي الاتجاه لزيادة سرعة المسح الضوئي. يجب أن تكون دقة الصورة 512 × 512 بكسل على الأقل.
- الحصول على صور لحجم الورم في مواقف مختلفة كل 20 دقيقة لمدة 2 ح. إضافة الماء إلى الهدف قبل كل اكتساب صورة.
ملاحظة: يمكن الحصول على الصور الفاصل الزمني تلقائياً عن طريق تعيين الفاصل الزمني الصحيح في البرنامج. ومع ذلك، يمكن للماوس التحرك، ويمكن أن يتحول الموضع أو z-stack مع مرور الوقت، مما يسبب فقدان البيانات. ولذلك، فمن المستحسن لتنفيذ الفاصل الزمني يدويا والتحقق من وضبط لالتحولات xyz بين عمليات الشراء. - في هذه الخطوة، اختياريا، الصورة التبديل علامة الفلورسنت Dendra2.
ملاحظة: على عكس التصوير بالفاصل الزمني (الذي يسمح بدراسة خصائص الخلايا السرطانية الفردية وكيف تتغير مع مرور الوقت)، وهذا سيسمح بدراسة منطقة تسلل الخلايا السرطانية في الدماغ على مدى عدة أيام4. ويرد شرح مفصل لهذه الخطوة من قبل غليغورييفيتش وآخرون13. - بعد الحصول على الصورة الأخيرة، قم بإزالة الماوس من المسرح والسماح له بالتعافي على لوحة التدفئة. لمنع الجفاف، يمكن إعطاء 100 ميكرولتر من المالحة تحت الجلد. ضع الماوس في قفصه حتى يتم إجراء إصابة تشبه الخزعة.
- حدد العديد من المواضع ذات الأهمية للصورة، وسجل إحداثياتها في البرنامج. تأكد من أن المواقف المحددة هي مواقف تمثيلية من مواقع مختلفة من الورم (كل ورم يمكن أن يكون مختلفا، ولكن لضمان الاتساق، حدد نفس الكمية من المواقف التي هي مركزية لجوهر الورم وإلى حواف عبر جميع الفئران).
3. إصابة تشبه خزعة واستبدال CIW
- إنشاء إصابة تشبه خزعة في موقع الورم بعد يوم واحد من جلسة التصوير الأولى.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن إجراء إجراء آخر، مثل إزالة الورم الجزئي.- قم بتخدير الماوس باستخدام تخدير استنشاق الأيسوفلوران كما سبق وصفه في الخطوة 2.1.1.
ملاحظة: في حين يمكن استخدام التخدير عن طريق الحقن، وهذا الإجراء أقصر من زرع CIW، والتخدير عن طريق الاستنشاق يجعل من الممكن للسيطرة بدقة والحد من الوقت الذي لا يزال الماوس مخدر. - ضع الماوس على إطار مجسم وتأمين رأسه مع اثنين من قضبان الأذن ومشبك الأنف. تحقق من عمق التخدير بسبب عدم وجود ردود الفعل دواسة. استخدم قناع التخدير لإجراء جراحة مجسمة للحفاظ على تخدير الماوس أثناء العملية.
- نقع مسحة القطن في الأسيتون ونشرها حول حافة غطاء لتخفيف الغراء الذي يحمل غطاء ضد الدماغ.
- الشريحة ملقط نقطة رقيقة تحت غطاء لرفعه. إذا كسر غطاء في هذه المرحلة، استخدم ملقط لإزالة قطع من الزجاج.
- تطبيق العازلة القشرة للحفاظ على الدماغ رطبة.
- تراجع إبرة 25 G في الورم إلى عمق 1 ملم.
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة تحت مجهر مجسم فلوري لتحديد منطقة الورم بشكل أكثر دقة (إذا كان الورم صغير جداً). بالإضافة إلى ذلك، يمكن حقن محلول 1 ميكرولتر من البوليسترين الفلورسنت 1 ميكرومتر الخرز أثناء ثقب لتحديد المنطقة biopsied. - ختم سطح الدماغ مع زيت السيليكون والغراء غطاء 6 ملم على الجزء العلوي.
- قم بتخدير الماوس باستخدام تخدير استنشاق الأيسوفلوران كما سبق وصفه في الخطوة 2.1.1.
4. التصوير المتكرر
- بعد يوم واحد من إلحاق إصابة تشبه الخزعة (وفي أيام متتالية إذا لزم الأمر)، كرر التصوير داخل الحيوية كما هو موضح في الخطوة 2 أعلاه لتقييم كيفية تغير سلوك خلية الورم مع مرور الوقت. حدد عدة مواضع من الورم التي من شأنها أن تكون ممثلة لمنطقة الورم بأكمله.
ملاحظة: إذا تم استخدام حبات الفلورسنت لتحديد المنطقة biopsied، توطينها لتصوير سلوك الخلايا السرطانية في المناطق biopsied مقارنة بالمناطق غير biopsied.
5. تحليل الصور
- إذا تم الحصول على الصور الفاصل الزمني يدوياً، قم بدمجها في مجلد واحد.
- افتح ملف LIF الفاصل الزمني في البرنامج التجاري المرتبط بالمجهر (على سبيل المثال، LasX أو LAS AF). حدد علامة التبويب عملية > أدوات العملية > دمج. حدد الصورة الأولى للتسلسل الزمني وانقر فوق أولاً. حدد الصورة الثانية للتسلسل الزمني وانقر فوق الثاني. في دمج الأبعاد، حدد t للوقت. انقر فوق تطبيق. سيتم إنشاء ملف جديد مع نقطتي وقت. كرر هذه العملية لكافة النقاط الزمنية باستخدام الملف الذي تم إنشاؤه حديثاً كصورة أولى للتسلسل.
- تصحيح مكدسات zالمكتسبة لأي إزاحة xyz.
ملاحظة: للتجارب الموضحة في هذا البروتوكول، تم استخدام برنامج Visual Basic مصممة خصيصًا للتصحيح. بدلا ً من ذلك، يمكن استخدام برامج متوفرة أخرى، مثل ImageJ أو Imaris.- تصدير ملفات TIFF من البرنامج بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق ملف الفاصل الزمني المدمج. حدد حفظ بيانات RAW. سيتم تصدير الملفات التي تم تصديرها إلى مجلد واحد يسمى وفقاً للقناة والوقت وz-position.
- افتح ملفات TIFF في برنامج Visual Basic المصمم خصيصًا.
- تعريف عدد النقاط الزمنية ومكدسات zوالقنوات.
- تعيين لون لكل قناة حسب ترتيب المظهر.
- في لوحة "إظهار النموذج"، لكل نقطة زمنية، قم بتصحيح التحول في z بالنقر فوق الزرين أعلى (U) أو لأسفل (D).
- في لوحة إنشاء الصور Intravital، حدد القناة المراد استخدامها لتصحيح إزاحة س ص. حدد القناة الخضراء لتصحيح، استناداً إلى إشارة من الخلايا السرطانية. انقر فوق تلقائي لتصحيح س ص.
- تصدير الصور التي تم تصحيحها كإسقاط أقصى من ثلاثة مكدسات zمتتالية. في اختيارلوحة ، وتقديم أرقام الأولى (تبدأ) والأخيرة (نهاية) ض-شرائح ليتم تصديرها. حدد الحد الأقصى. حدد مجلدات منفصلة لـ Z. انقر فوق القيام. لكل واحد منهم، سيتم تصدير ثلاثة مكدسات z، صور الفاصل الزمني إلى مجلد منفصل.
- اختياريا، الصحيح للتشوه مرونة الأنسجة.
ملاحظة: لتجارب تشوه الأنسجة المرنة، تم استخدام برنامج تعويض الحركة المباراة لتصحيح تشوه الأنسجة جامدة ومرنة14. - تتبع خلايا واحدة في كومة zكاملة في فيلم الفاصل الزمني.
ملاحظة: يمكن تعقب الخلايا السرطانية يدويا باستخدام، على سبيل المثال، البرنامج المساعد ImageJ (MTrackJ). في حين دقيقة، وهذا يقتصر على طائرة س ص وتستغرق وقتا طويلا جدا. بدلاً من ذلك، يمكن تعقب الخلايا السرطانية تلقائيًا في جميع أنحاء حجم zالكامل، وذلك باستخدام تجزئة خلايا الورم (على سبيل المثال، برنامج Imaris). ومع ذلك، في الأورام الكثيفة للغاية، تتبع الآلي هو أقل دقة ويمكن أن تؤدي إلى المزيد من أخطاء تتبع.- فتح وتتبع كل سلسلة الفاصل الزمني (لثلاثة مكدسات zمتتالية) بشكل منفصل. اسحب المجلد الذي يحتوي على صور الفاصل الزمني إلى ImageJ.
- حدد علامة التبويب الإضافات > تتبع > MtrackJ. تعقب كل خلية فردية عن طريق تحديد إضافة والنقر على كل خلية في كل نقطة زمنية.
- استخراج قياس المسارات عن طريق النقر على قياس وحفظ الملف.
النتائج
لتقييم تأثير الخزعة على سلوك خلايا ورم الدماغ، قمنا بإجراء العملية الموضحة في هذا البروتوكول. تم حقن الورم الدبقي - خلايا GL261 - التي تعبر عن بروتين فلوري نووي (H2B-Dendra2) في دماغ الفئران C57BL/6، وتم زرع CIW مزمن. تم إجراء التصوير داخل المدة الزمنية على نفس الحيوان قبل وبعد خزعة مثل إصابة الورم (الشكل1A،B). تم تحديد هجرة الخلايا السرطانية الفردية عن طريق تتبع مسار الهجرة مع مرور الوقت في طائرات س ص مختلفة من z-stack (الشكل1C)وتآمر كنسبة مئوية من الخلايا المهاجرة قبل وبعد خزعة (الشكل1F). تم تحديد معدل انتشار الخلايا السرطانية كمياً على أساس تكثيف Dendra2 ذو العلامات H2B عند التميس (الشكل1D)وتم رسمه كنسبة مئوية من الخلايا المقسمة قبل الخزعة وما بعدها (الشكل1E). قارنا توزيع سرعة الهجرة قبل وبعد الخزعة في نفس الورم ووجدنا أن عدد الخلايا المهاجرة (السرعة > 4 ميكرومتر/ ساعة) زاد بعد التدخل، مع انخفاض مرتبط في عدد الخلايا البطيئة/غير المهاجرة ( السرعة < 4 ميكرومتر / ساعة ) (الشكل2A). في المتوسط لكل ورم، لاحظنا زيادة 1.75 (SD = 0.16) أضعاف في النسبة المئوية للخلايا المهاجرة عند إجراء إصابة تشبه خزعة، مقارنة مع الفئران السيطرة التي لم تكن biopsied (الشكل2B). رصدنا سلوك الخلايا السرطانية لمدة أسبوع آخر ووجدنا أنه على الرغم من أن النسبة المئوية للخلايا السرطانية المهاجرة انخفضت في نهاية المطاف في كل من السيطرة والفئران biopsied، والفئران biopsied لا تزال تظهر قدرة الهجرة أعلى من الفئران السيطرة ( الشكل 2جيم). أظهر تحليل السلوك التكاثري للخلايا السرطانية مع مرور الوقت زيادة 1.52 (SD = 0.26) أضعاف في عدد الأحداث الميتوتيكية عند الخزعة، بالنسبة لفئران التحكم غير البيولوجية (الشكل2D).
لاختبار ما إذا كانت الآثار الملاحظة للخزعة على سلوك الخلايا السرطانية التكاثرية والمهاجرة هي قطعة أثرية بسبب جراحة استبدال CIW (المطلوبة لإجراء إصابة تشبه الخزعة)، رصدنا سلوك الخلايا السرطانية في مجموعة من الفئران التي خضعت لـ CIW استبدال دون خزعة. في هذه المجموعة، لم نلاحظ أي تحريض للهجرة أو انتشار الخلايا السرطانية، مما يشير إلى أن الزيادة في انتشار الخلايا السرطانية ومعدلات الهجرة كانت ناجمة على وجه التحديد عن إصابة تشبه خزعة (الشكل3A، B).
مستقرة الصورة تحويل البروتين الفلورسنت Dendra2 يسمح لدراسة تسلل الخلايا السرطانية على مدى عدة أيام. عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية / الضوء الأزرق، يتم تبديل Dendra2 بشكل لا رجعة فيه من الأخضر إلى الأحمر. باستخدام هذه الخاصية، تم إضاءة منطقة مربعة من الورم و ~ 200 Dendra2-التعبير عن الخلايا السرطانية تم وضع علامة على الصورة قبل خزعة (الشكل4). بعد يوم واحد من الخزعة، قمنا بإعادة توطين المنطقة التي تحولت إلى الصور وقمنا بقياس حجم الخلايا السرطانية التي تسللت إلى أنسجة الورم المحيطة. وجدنا أن منطقة التسلل كانت 1.72 (SD = 0.41) أكبر في الأورام بعد إصابة تشبه خزعة مقارنة مع أورام التحكم غير biopsied (الشكل4). على الرغم من أن هذا النهج يوفر فقط معلومات عن سلوك الخلايا السرطانية التسللية السائبة وليس على مستوى خلية واحدة، فإنه أقل استهلاكا للوقت من نهج التصوير الفاصل الزمني ويمكن أن يكون الأسلوب المفضل للأسئلة البحثية التي تركز حصرا على دراسة السلوك المتسلل.
الشكل 1: الإعداد التجريبي للتصوير الطولي داخل الحيوية لتأثير خزعة على سلوك الخلايا السرطانية. (أ) رسم بياني يبين تصميم الحلقة والحامل المغناطيسي. (B) التمثيل التخطيطي لسير العمل التجريبي. يتم حقن الخلايا السرطانية في أدمغة الفئران ويتم إنشاء CIW. عند تطور الورم، يتم إجراء أول جلسة تصوير بفاصل زمني (قبل الخزعة). في اليوم التالي، يتم تنفيذ خزعة واستبدال CIW. في اليوم التالي للتصوير (الخزعة اللاحقة)، يتم إجراء جلسة تصوير ثانية بفاصل زمني. بالنسبة للتأثيرات طويلة الأجل، يمكن القيام بجلسات التصوير اللاحقة. (C) تظهر الصور لقطات تمثيلية لفيلم الفاصل الزمني حيث تم تعقب الخلايا السرطانية GL261 H2B-Dendra2. الخطوط الحمراء تصور مسارات الخلايا السرطانية الفردية. شريط مقياس = 50 درجةمئوية (D) ممثل في الصور الحية الفاصلالزمني عرض الخلايا المقسمة في الأورام GL261 H2B-Dendra2. يشار إلى مراحل مختلفة من الميتوسة: المرحلة التمهيدية (P)، البروميتافيس (Pm)، المرحلة الفوقية (M)، anaphase (A)، وtelophase (T). شريط المقياس = 50 درجة مئوية. وتشير كل نقطة إلى النسبة المئوية للخلايا المهاجرة في جميع المراكز التي تقاس في الحيوان الفردي. وتظهر البيانات على أنها متوسط ± S.E.M. من ستة فئران (**P < 0.01, المقترنة t-اختبار). وقد تم تعديل هذا الرقم من Alieva وآخرون4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية التي تبين تأثير الخزعة على هجرة الخلايا السرطانية ومعدلات الانتشار. (أ) قطع الشلال التي تظهر التغير في توزيع سرعة الخلية بالنسبة للهجرة القاعدية في الفئران الفردية. وتظهر البيانات على أنها يعني ± S.E.M. من خمسة فئران. (ب) عدد الخلايا المهاجرة التي تسيطر عليها (الأزرق) والحيوانات biopsied (الأحمر) تطبيع إلى عدد الخلايا المهاجرة قبل التدخل (ن = 6 الفئران، ***P < 0.0001، الطالب t-اختبار). (C) تم تتبع سلوك الخلايا السرطانية على مدى عدة أيام. يظهر العدد الطبيعي (نسبة إلى التدخل المسبق) من الخلايا المهاجرة في الفئران الفردية مع مرور الوقت (n > 4 فئران لكل حالة، ***P < 0.0001، ANOVA ثنائيالاتجاه). (د) العدد الطبيعي للخلايا المقسمة في السيطرة (الأزرق) والحيوانات biopsied (الأحمر). لكل الحيوان الفردي، تم تطبيع قيم ما بعد التدخل إلى القيم قبل التدخل (n = 5 الفئران، **P < 0.01، الطالب t-test). وقد تم تعديل هذا الرقم من Alieva وآخرون4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: استبدال CIW ليس له أي تأثير على سلوك الخلايا السرطانية. يُظهر التصوير الطولي داخل الفيتال أن استبدال CIW بدون خزعة ليس له أي تأثير على معدلات الهجرة والانتشار. (أ) الزيادة في عدد الخلايا المهاجرة للظروف المشار إليها. كل رمز يمثل متوسط الماوس الفردية، ون ≥ 4 الفئران. (ب) الزيادة في عدد الخلايا المتكاثرة للظروف المشار إليها. كل رمز يمثل متوسط الماوسالفردية (ن ≥ 4 الفئران، **P < 0.01،***P < 0.001، ns = غير مهم، في اتجاه واحد ANOVA مع نيومان-Keuls اختبار آخر مخصص). وقد تم تعديل هذا الرقم من Alieva وآخرون4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المناقشة
هنا نقوم بوصف طريقة لدراسة التغيرات في سلوك الخلايا السرطانية على مستوى خلية واحدة استجابة للإجراءات الجراحية الغازية، مثل خزعة، في دماغ الحيوان الحي. الجمع بين التصوير متعدد الفوتونات الطولية مع الزرع الجراحي لCIW المزمنة تمكن من التحديد الكمي لهجرة الخلايا السرطانية، والغزو، والانتشار قبل وبعد خزعة في نفس الحيوان4. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المستخدمة لرصد الورم متعدد الأيام، مثل التصوير الإنارة الحيوية12، التصوير بالرنين المغناطيسي10، أو PET / CT11، تصور هذه الطريقة بشكل فريد الأورام على مستوى خلية واحدة ، وبالتالي ، يوفر نظرة ثاقبة في السلوك الخلوي تطور الورم الأساسي.
لتنفيذ هذا الأسلوب بنجاح، يجب إتقان العديد من الإجراءات. الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي زرع CIW واستبدالها. ويتطلب التعقيد التقني لهذه الخطوات الدقة والمهارات الجراحية التي يمكن اكتسابها من خلال التدريب المستمر. قد تكون المضاعفات أثناء جراحة CIW، مثل النزيف الذي قد يغطي سطح الدماغ، صعبة بالنسبة للتصوير اللاحق. عدم وجود أدوات معقمة أو بيئة، فضلا عن الفشل في ختم تماما سطح الدماغ، قد يسبب عدوى على سطح الدماغ (السائل الأبيض تحت غطاء)، مما سيجعل التصوير إشكالية ويضر بشدة الناتجة تفسير. وثمة مسألة شائعة أخرى في هذا البروتوكول هي الحركة الحيوانية أثناء التصوير بالفاصل الزمني. في حين يمكن تصحيح أي تحول xyz بعد التجربة، فمن المستحسن لتصحيح إحداثيات كل موقف قبل كل نقطة زمنية لمنع أي فقدان للمعلومات. تشوه الأنسجة هو مشكلة إضافية وجدت عند التصوير على المجهر المقلوب. تعاني أنسجة الدماغ من الضغط عندما يتم وضع الماوس في وضع السوبين. اعتمادا على درجة تشوه الأنسجة، تتبع الخلايا السرطانية قد يؤدي إلى تحديد كمية خاطئة من إزاحة الخلايا. لمنع ذلك، يمكن استخدام برنامج للتشوه جامدة ومرنة14.
في حين أن هذا الإجراء يقدم تطبيق واسع لدراسة التغييرات في سلوك الورم، ينبغي النظر في بعض القيود. تسمح هذه الطريقة للعلماء بتصوير ما يصل إلى عمق 1.6 مم (باستخدام مذبذب بارامتري بصري)؛ ومع ذلك، وهذا يعني أن التصوير يقتصر على مناطق قشرة الدماغ السطحية15. وهكذا، لا يمكن دراسة بعض أورام الدماغ الموجودة في هياكل الدماغ العميقة العميقة العميقة، بما في ذلك الأورام الدبقية البنوتين ية المنتشرة الموجودة في منطقة جذع الدماغ، في بيئة الدماغ الأصلية مع هذا البروتوكول. وثمة قيد آخر لهذا البروتوكول هو حجم الورم الذي يمكن صورته. على الرغم من أن المسح الكلي لحجم الورم مطلوب للحصول على المعلومات القصوى، في كثير من الأحيان، يمكن أن يكون حجم الورم وسرعة الخلايا المهاجرة عوامل مقيدة. لكل نوع من أنواع الورم، يجب النظر في الفاصل الزمني الأمثل للتصوير. إذا كان الإطار الزمني بين الصور طويلًا جدًا، فقد يكون من الصعب تتبع الخلايا السرطانية. استخدام الماسح الضوئي الرنانة يمكن أن تقلل إلى حد كبير من وقت المسح الضوئي، مما يسمح بتصوير ورم أكبر16. وأخيرا، يمكن أن يكون تحليل الصورة اليدوي لهذا البروتوكول تستغرق وقتا طويلا جدا، لذلك بدلا من ذلك، يمكن استخدام برامج لتتبع 3D الآلي. ومع ذلك، ينبغي دائما أن تكون نتيجة تتبع تحت إشراف بصريا لأن خوارزميات لتتبع الخلايا الآلي نادرا ما تكون مصممة لتلخيص بالضبط هجرة الخلايا ذات الأهمية.
ويمكن للتعديلات الطفيفة على البروتوكول الموصوف هنا أن تمكن طائفة أوسع من التطبيقات. بدلاً من إجراء الخزعات، يمكن تنفيذ تدخلات (جراحية) أخرى، مثل استئصال الورم الجزئي أو تسليم رقاقات العلاج الكيميائي. إضافة المركبات من خلال أنبوب صغير مزروع جراحيا يمكن الجمع بين هذا البروتوكول لاستهداف الجزيئات المحددة ذات الأهمية الدوائية. ونحن نتوقع أن هذا النموذج سوف تكون مفيدة في الدراسات التي تهدف إلى تحليل تأثير تدخل معين على سلوك الخلايا السرطانية. إمكانية تنفيذ تدابير متكررة في نفس الحيوان ليس فقط يوفر بيانات أكثر دقة عن التغيرات التي تحدث في الورم ولكن أيضا يقلل إلى حد كبير من عدد الحيوانات التجريبية اللازمة لكل دراسة.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون أنكو دي غراف ومركز هوبريشت للتصوير على دعمهما في التصوير، وإلين ويهرينس وهانا جونسون على التدقيق والتحرير للمخطوطة.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 25 جرام × 16 مم إبر تحت الجلد | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10UL SYR W / O NEEDLE | HAMILTON | 7635-01 | |
| إسفنجة جيلاتين قابلة للامتصاص | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips مستديرة 6 مم | VWR الدولية | 631-0168 | |
| غراء سيانواكريليت | Pattex | Ultra جل | |
| الأسنان مثقاب المعالجة الذاتي من الأسمنت | Vertex Dental | Vertex | |
| Dremel | Dremel 3000 (قد يكون مثقاب الأسنان أكثر ملاءمة) + 105 قاطع | ||
| ملاقط منحنية دقيقة | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (سترات الفنتانيل 0،315 مجم / مل + فلوانيسون 10 مجم / مل) | |
| ميدازولام | أكتافيس | ميدازولام أكتافيس 5 مجم / مل | |
| مرهم بصري | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| حاقن تجسيمي جوهري (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| زيت السيليكون | Sigma Aldrich | 181838 | |
| إطار تجسيمي | Stoelting | Lab قياسي التجسيم، الفئران والفأر | |
| مجهر ستيريو جراحي | أوليمبوس | ||
| Temgesic (0.3 مجم / مل) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas T & uuml; مقص الربيع bingen | هارفارد | 72-8508 | |
| زيلوكائين (ليدوكائين 1٪ + إبينفرين 1: 100،000) مخدر موضعي | Astrazeneca | Xylocaine (ليدوكائين 1٪ + أدرينالين 1: 100،000) |
المراجع
- Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
- van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
- Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
- Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529(2017).
- Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
- Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
- Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145(2012).
- Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759(2016).
- Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).
- Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148(2012).
- Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278(2009).
- Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014(2011).
- Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
