مقالة منهجية

دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة

DOI:

10.3791/59290

⸱

أبريل 19, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يحدد أسلوب رواية الدهن الحبرية العزل وتنقية من كبد الفأر، استخدام عدة عزلة هيولى راسخة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قطرات الدهن (LDs) هي النشطة بيولوجيا العضيات الموجودة داخل سيتوسول الأكثر حقيقية النواة وبعض الخلايا بدائية. قديسي الأيام الأخيرة تتكون من الدهون محايدة المغطى باحادي الطبقة فوسفوليبيدات والبروتينات. الكبد LD الدهون، مثل سيراميد، والبروتينات، ومتورطة في العديد من الأمراض التي تسبب ذلك الكبد. على الرغم من أن الأساليب السابقة أقيمت لعزل LD، أنها تتطلب تحضير تستغرق وقتاً طويلاً من الكواشف وليست مصممة لعزل المقصورات سوبسيلولار متعددة. سعينا إلى وضع بروتوكول جديد لتمكين عزل LDs، هيولى (ER)، وليسوسوميس من كبد واحدة بماوس.

علاوة على ذلك، جميع الكواشف المستخدمة في البروتوكول المعروضة هنا متوفرة تجارياً وتتطلب إعداد كاشف الحد الأدنى دون التضحية بنقاء LD. هنا نقدم بيانات مقارنة هذا البروتوكول الجديد لبروتوكول تدرج سكروز قياسية، مما يدل على نقاء قابلة للمقارنة، ومورفولوجيا والغلة. بالإضافة إلى ذلك، ونحن عزل ER وليسوسوميس باستخدام نفس العينة، توفير تفاصيل أعمق لتشكيل والتمويه داخل الخلايا للدهون والبروتينات المرتبطة بهم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قديسي الأيام الأخيرة هي النشطة بيولوجيا العضيات الموجودة في سيتوسول الخلايا حقيقية النواة أكثر وبعض الخلايا بدائية1،،من23. الأساسية LD يتكون من الدهون محايدة مثل استرات الكولسترول والدهون الثلاثية (TG). كما أنها تحتوي على سيراميد، الدهون النشطة بيولوجيا المتورطين في إرسال الإشارات الخلوية مسارات4،5. دس محاطة أحادي الطبقة فسفوليبيد ومغلفة بالبروتينات، بما في ذلك بيريليبين البروتينات بيريليبين 2 (PLIN2) و 35،1،(PLIN3)6. كما حضر من الإنزيمات ليبوجينيك وليباسيس وبروتينات الغشاء الاتجار غير المشروع التي تم ربطها إلى عدة أمراض الكبد ستيتوتيك، بما في ذلك الدهنية أمراض الكبد وأمراض الكبد الكحولية والالتهاب الكبدي ج3،5 ،،من67،،من89،10.

ويعتقد قديسي الأيام الأخيرة تشكل من الغشاء الخارجي للائحة، وتتضمن المركبة حديثا تيراغرام مصدرها الأحماض الدهنية الحرة المستمدة من أية11. بيد أنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت الدهون المجمعة برعم، تظل متصلاً، أو هي اقتطعت من ER6،11، مما يجعل عزل LDs خالية من أية صعوبة من الناحية التقنية. الأحماض الدهنية الحرة يمكن أن يتحرر من LDs العمل الذي قامت به ليباسيس السطحية لتوفير إنتاج الطاقة أو تركيب الغشاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتحلل LDs عبر ليبوفاجي كآلية تنظيمية وإنتاج الأحماض الدهنية الحرة12.

هناك جانب ER و lysosomes، العضيات الأخرى – مثل الميتوكوندريا، اندوسوميس، بيروكسيسوميس، وغشاء البلازما – التي توجد ضمن الارتباط الوثيق لقديسي الأيام الأخيرة11. هذا تعدد الزوجات ضيق يجعل من الصعب القيام استخراج LD نقية. ومع ذلك، يمكن اتخاذها الفطرية ذات الكثافة السكانية المنخفضة الدهون محايدة ميزة عن طريق الطرد المركزي5.

تقليديا، وقد تم دس عزل استخدام سكروز كثافة متدرجة1،،من513. بيد أن هذه الأساليب قد لا صممت لعزل العضيات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تتطلب إعداد الكواشف تستغرق وقتاً طويلاً. يتكيف هذا البروتوكول عزلة ER متاحة تجارياً كيت (انظر الجدول للمواد) للسماح لعزل دينار. ونحن نستخدم استخراج المخزن المؤقت المقدمة من هذه المجموعة، إضافة خطوة عزلة LD. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدام البروتوكول ER وعزل الليزوزومية استخدام العينات نفسها، مما يتيح الحصول على صورة أكثر شمولاً لدورة الحياة لقديسي الأيام الأخيرة. للتحقق من صحة هذا الأسلوب الجديد، ونحن الاعتداء الغلة LD ومورفولوجيا والحجم والنقاء. قارنا النتائج المعروضة هنا لتلك التي تم الحصول عليها مع بروتوكول مستخدمة على نطاق واسع باستخدام تدرج سكروز لعزل LD.

كنا 10 إلى 12 أسبوع-عمرها، الماوس C57BL/6 الإناث 20 غ صام ح 16 (إزالة المواد الغذائية في 05:00 م لمدة عزل LD 09:00 ص) مع حرية الوصول إلى المياه. العائد نموذجية تيراغرام الكبد 0.6 مغ/ز، وهو للبروتين LD، الكبد 0.25 مغ/ز. وهذا يوفر ما يكفي من المواد إيمونوبلوتس ~ 10 بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي. البروتوكول أدناه تفاصيل والكواشف المستخدمة وبروتوكول مناسب لكبد واحد ز 1. البروتوكول العزلة التدرج السكروز هو مقتبس من ساتو14 و15من وو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب على مقاعد البدلاء مختبر بمعدات الحماية الشخصية الملائمة للمستوى الأول، بما في ذلك معطف مختبر، والقفازات، ونظارات واقية والسلامة الأحيائية. وأجريت التجارب وفقا للبروتوكولات المعتمدة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة بنسلفانيا. قد بذلت جميع الجهود للتقليل من عدم الراحة الحيوان، والحيوانات تعامل مع الرعاية الإنسانية.

1-LD عزلة باستخدام مجموعة مواد عزل ER

  1. إعداد
    ملاحظة: المبالغ المدرجة في القائمة مناسبة لكبد الفأر ز 1 واحد.
    1. إعداد 10 مل من 1 x المخزن المؤقت (أي المخزن المؤقت، ومن عدة عزل ER) استخراج متساوي التوتر بتمييع مل 2 x 5 IE المخزن المؤقت مع 8 مل من الماء عالي النقاوة. بارد المخزن المؤقت بوضعه على الجليد.
    2. تحضير 100 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) بإذابة 10 مل من برنامج تلفزيوني x 10 في 90 مل من الماء عالي النقاوة. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    3. إعداد 10 مل من 5% البولي إثيلين غليكول ف-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)--فينيل البروم ثنائي الفينيل (بجبي) بتمييع ميليلتر 500 من بجبي في مل 9.5 من الماء عالي النقاوة. استخدم حقنه 1 مل لقياس بجبي كما لزج. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    4. كول جميع الأنابيب بوضعها على الجليد: 13 مل ultracentrifuge أنابيب وأنابيب الطرد المركزي عالية السرعة 50 مل، 1.7 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب وأنابيب الطرد المركزي 15 مل.
    5. بارد كل ما يلزم من أجهزة الطرد المركزي إلى 4 ° c: ميكروسينتريفوجي، الطرد مركزي ذات قدرة عالية لمل 15 أنابيب، الطرد مركزي عالية السرعة لأنابيب 50 مل، وأولتراسينتريفوجي.
    6. تعقيم مقص ملقط والتشريح بالتعقيم.
  2. إعداد الأنسجة
    1. Euthanize الماوس بوضعه في غرفة مليئة 100% CO2 ل 10 دقيقة القتل الرحيم تأكيد قبل تنفيذ التفكك عنق الرحم.
    2. استخدام الملقط العقيمة ومقص التشريح، قطع في طبقات الجلد والعضلات البطن على المحور الأمامي/الخلفي لفضح الكبد.
    3. قص الأربطة الاتصال الكبد بالحجاب الحاجز والأمعاء. استخدام الملقط لسحب الأمعاء بعيداً عن الكبد، واتجاه الخلفي، لفضح الأربطة.
    4. قطع بين الكبد وفي القفص الصدري الظهرية، الانتقال من عرفت الخلفي حتى تتحرر الكبد.
    5. نقل الكبد إلى 5 سم باردة طبق بيتري مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة x 1.
    6. تغسل الكبد 2 x على منصة هزاز في 10 مل من برنامج تلفزيوني x 1 البارد لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في سم 5 طبق بيتري. من أجل إيقاف برنامج تلفزيوني 1 x بعد الغسيل النهائي.
    7. استخدام شفرة جراحية معقمة الحجم 10 (انظر الجدول للمواد) للنرد الكبد إلى قطع 3 – 5 مم في الطول 5 طبق بتري (الشكل 1A).
    8. تغسل الكبد مكعبات 2 x مع 10 مل من برنامج تلفزيوني x 1 البارد لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في سم 5 طبق بيتري.
      ملاحظة: لعزل يحلول، نقل 0.5 غ كبد إلى الخالطون نظيفة 45 مل واتبع الإرشادات المقدمة من استخراج يحلول كيت (انظر الجدول للمواد).
    9. صب 1 x برنامج تلفزيوني ونقل القطع مكعبات الكبد الباردة 45 مل الخالطون دونس. ضمان جميع القطع الذهاب إلى أسفل الخالطون.
    10. إضافة 7 مل من المخزن المؤقت IE x 1 الباردة (من عدة عزل ER) ومجانسة على الجليد بتحريك مدقة صعودا وهبوطاً 20 x. ضمان أن المدقة يذهب إلى أسفل الخالطون خلال كل السكتة الدماغية.
    11. نقل هوموجيناتي (الشكل 1B) إلى أنبوب الطرد مركزي باردة 15 مل.
    12. شطف الخالطون مع 1 مل من البرد 1 × المخزن المؤقت IE (من عدة عزل ER) وهذا إضافة إلى بقية هوموجيناتي.
  3. عزل LD
    1. إزالة الأنوية من سينتريفوجينج هوموجيناتي في قدرة عالية أجهزة الطرد مركزي في 1,000 س ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية (الشكل 1).
    2. نقل المادة طافية بوستنوكليار (السندات الإذنية) إلى أنبوب الطرد مركزي الجديد، الباردة 50 مل. لمنع فقدان LD، ضمان أن الدهن أي تجمع في الجزء العلوي من الأنبوبة 15 مل هو حراكه قبل تحويل السندات الإذنية.
    3. تتخذ من 100 ميليلتر الكوة من السندات الإذنية لتحليل النقاء ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 باردة. وضعه جانبا على الجليد.
    4. لإزالة الميتوكوندريا، الطرد المركزي عينة السندات الإذنية، لا قاسمة في الطرد مركزي عالية السرعة مبردة في س 12,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      1. اختياري: للنفط الخام يعزل LD (CLD) (مع تلوث سيتوسول وغشاء الخلية)، جمع طبقة الدهن أعلى باستخدام ماصة زجاجية وتحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.7 مل. يواصل قسم 1.4.
    5. نقل المادة طافية بوستميتوتشوندريال (PMS) إلى أنبوب أولتراسينتريفوجي. لمنع فقدان LD، ضمان أن الدهن أي تجمع في الجزء العلوي من حراكه قبل نقل الدورة الشهرية.
    6. تتخذ من 100 ميليلتر اليكووت من مس لتحليل النقاء ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 باردة. وضعه جانبا على الجليد.
    7. ملء أنبوب ultracentrifuge حتى أسنانها مع الباردة 1 × IE العازلة لمنع الأنبوب الانهيار خلال تنبيذ فائق.
    8. تحقيق التوازن بين العينات والطرد المركزي لهم في أولتراسينتريفوجي في س 100,000 ز لمدة 60 دقيقة عند 4 درجة مئوية (الشكل 1).
    9. لإزالة طبقة LD، إمالة الأنبوبة بزاوية 45 درجة واستخدم ماصة زجاجية لنضح. نقل بيليه إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 باردة.
      ملاحظة: يتضمن بيليه ER معزولة. استخدام كسر هذا المصب لعزل ER.
    10. جمع 100 ميليلتر من المادة طافية بوست-ER (في) تحت طبقة الدهن لتحليل النقاء.
  4. الغسيل LD
    1. إضافة 1 x برنامج تلفزيوني للكسر LD جمعت في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.7، إلى وحدة تخزين إجمالي 1.3 مل.
    2. الدوامة العينة.
    3. الطرد المركزي في ميكروسينتريفوجي في السرعة القصوى لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه أي حطام خلية. الحارة الأنبوب بلطف بيديه لمساعدة ريسوسبيند على طبقة دينار. نقل المادة طافية، بما في ذلك طبقة الدهن، لأنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 جديدة.
    4. كرر الخطوات 1.4.1–1.4.3 2 x x-3، حتى بيليه لم يعد مرئية.
    5. إضافة 1 x PBS LD خالية بيليه طاف بحجم 1.5 مل نهائي. المياه والصرف الصحي كسر الدهون بالطرد المركزي في ميكروسينتريفوجي في السرعة القصوى لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. إزالة 1 مل من 1 x PBS (تحت طبقة الدهن) مع ماصة زجاجية دون إزعاج في طبقة الدهن.
    7. كرر الخطوات من 1.4.5 و 1.4.6 x x-5 4، حتى برنامج تلفزيوني 1 x شفاف بصريا مع لا تعكر.
    8. قم بإزالة كافة 1 x برنامج تلفزيوني تحت طبقة الدهن، استخدام ماصة زجاجية (الشكل 1E).
    9. استخدام النتيجة، كسر LD الصرفة، لتحليل المتلقين للمعلومات.
  5. دينار كوانتيتيشن البروتين بتحليل حمض بيسينتشونينيك
    ملاحظة: لا تستخدم مقايسة حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) إذا كانت مورفولوجيا LD إلى تقييم.
    1. ريسوسبيند دينار في 500 ميكروليتر من بجبي 5%.
    2. يغلي عينات لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية، دوامة لهم، واحتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتبرد.
    3. كرر الخطوة 1.5.2 x 2 إضافية.
    4. Sonicate العينات لمدة 5 دقائق مع 30 s/إيقاف دورة، بكثافة متوسطة.
    5. تطبيع العينات بقياس تركيز البروتين في جميع عينات التحليل النقاء والكسر LD بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي.

2-LD عزل استخدام السكروز الكثافة المتدرجة

  1. إعداد
    1. جعل 200 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl [الأس الهيدروجيني 7.4]، 1 مم يدتا [pH 8.0]). بارد عليه بوضعه على الجليد.
    2. جعل 100 مل محلول السكروز 60% (w/v) في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات بتذويب ز 60 من السكروز في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، يصل الحجم النهائي إلى 100 مل. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    3. جعل 6 مل محلول السكروز 40% (w/v) بإضافة 4 مل من محلول السكروز 60 في المائة إلى 2 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    4. جعل 6 مل محلول السكروز 25% (w/v) عن طريق إضافة 2.5 مل من محلول السكروز 60% إلى 3.5 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    5. جعل 4 مل محلول السكروز 10% (w/v) عن طريق إضافة 0.7 مل من محلول السكروز 60 في المائة إلى 3.3 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    6. جعل 10 مل حل مثبط البروتياز والفوسفاتيز بإضافة حبة واحدة من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز إلى 10 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات.
    7. إعداد المخزن المؤقت هوموجيناتي الأنسجة بإضافة 4 مل حل مثبط البروتياز والفوسفاتيز إلى 50 مل محلول الأسهم السكروز 60%. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    8. إعداد تراكب المخزن المؤقت عن طريق إضافة 2 مل حل مثبط البروتياز والفوسفاتيز إلى 50 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    9. تحضير 100 مل من 1 x PBS بتمييع 10 مل من برنامج تلفزيوني x 10 في 90 مل من الماء عالي النقاوة. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    10. إعداد 10 مل من 5% بجبي بتمييع ميليلتر 500 من بجبي في مل 9.5 من الماء عالي النقاوة. استخدم حقنه 1 مل لقياس بجبي كما لزج. بارد عليه بوضعه على الجليد.
    11. بارد أنابيب الطرد المركزي التالية عن طريق وضعها على الجليد: 13 مل ultracentrifuge أنابيب وأنابيب الطرد المركزي عالية السرعة 50 مل، 1.7 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب وأنابيب الطرد المركزي 15 مل.
    12. تبريد أجهزة الطرد المركزي اللازمة إلى 4 ° c: ميكروسينتريفوجي الطرد مركزي ذات قدرة عالية (بالنسبة لأنابيب 15 مل)، الطرد مركزي عالية السرعة (بالنسبة لأنابيب 50 مل) وأولتراسينتريفوجي.
  2. إعداد الأنسجة
    1. استخدم الخطوات 1.2.1–1.2.9 لإعداد الأنسجة للتجانس.
    2. إضافة 7 مل من الأنسجة الباردة هوموجيناتي المخزن المؤقت ومجانسة على الجليد بتحريك مدقة صعودا وهبوطاً 20 x. خلال السكتات الدماغية الخمسة الأولى، ضمان المدقة يذهب إلى أسفل الخالطون.
    3. نقل هوموجيناتي إلى أنبوب الطرد مركزي باردة 15 مل.
    4. شطف الخالطون مع 1 مل من الأنسجة الباردة هوموجيناتي المخزن المؤقت وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي المستخدمة سابقا 15 مل.
    5. إحضار وحدة التخزين هوموجيناتي يصل إلى 10 مل مع الأنسجة هوموجيناتي المخزن المؤقت.
    6. الطرد المركزي العينة في سعة عالية أجهزة الطرد مركزي في 1,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    7. نقل 8 مل من المادة طافية على أنبوب الطرد مركزي 50 مل.
    8. نقل 100 ميليلتر من المادة طافية المتبقية كعينة السندات الإذنية لتحليل النقاء.
  3. التدرج السكروز
    1. إمالة أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على 8 مل من السندات الإذنية بزاوية 45 درجة. إضافة 6 مل محلول السكروز 40 ٪، ضمان البقاء المرحلتين منفصلتين بعناية.
    2. بطريقة مماثلة، ببطء إضافة 6 مل محلول السكروز 25%؛ ثم قم بإضافة 4 مل محلول السكروز 10%؛ وأخيراً، إضافة 8 مل من تراكب المخزن المؤقت.
    3. الطرد المركزي العينة في أجهزة الطرد مركزي عالية السرعة في 30,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. نقل الطبقة العليا تحتوي على دس لأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.7 مل.
    5. للغسيل LD، اتبع الخطوات المذكورة في الفرع 1-4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدينا إجراء عزل LD مع عدة ER على الفئران حوالي 30 ومقارنة النتائج مع تلك التي يتبع البروتوكول عزل السكروز على ما يقرب من 40 الفئران. النتائج المبلغ عنها نموذجية لكل من البروتوكولين. وقد صام الفئران بين عشية وضحاها مع حرية الوصول إلى المياه، وزيادة غلة LD. تم تشغيل عزل LD استخدام تدرج سكروز بالتوازي مع عدة ER LD العزلة البروتوكول. عينات من السندات الإذنية، الدورة الشهرية، جمعت في، كلدس، ودس طوال الطقم ER LD العزلة البروتوكول. بسبب تقييد سير عمل البروتوكول عزل السكروز، جمعت فقط عزل السندات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويجري يتزايد الاعتراف كبدي LD البيولوجيا كمنظم حرجة لفسيولوجيا سرطانه الخلية في الصحة والمرض. العضيات حسنة النية، LDs ديناميكية، تتفاعل مع غيرها من الهياكل الخلوية، وتحتوي على داخل المكونات النشطة بيولوجيا لهم المشاركة في التوازن في الدهون والسكر. تستخدم بشكل روتيني لعزل LD التدرج السكروز وتمكن المحققون على دراسة هيكل LD، لكنه يتطلب منهم بذل العديد من المخازن المؤقتة. وقد أثبتنا أن استخدام مجموعة العزلة ER المتاحة تجارياً هو أداة أخرى يمكن استخدامها لعزل LD ليس فقط ولكن لعزل ER ويحلول، جنبا إلى جنب مما يتيح الحصول على عر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدكتور كار يتلقى دعم البحوث من "اعتراض المستحضرات الصيدلانية".

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر معهد بحوث السرطان الأسرة ابرامسون. يتم دعم هذا العمل بالمنح التالية: المعاهد الوطنية للصحة/نياا R01 AA026302-01، والمعاهد الوطنية للصحة/نياا K08-AA021424، مؤسسة روبرت وود جونسون، هارولد آموس الطبية كلية التنمية جائزة، 7158، إيدوم جمهورية الكونغو الديمقراطية الطيار جائزة P30 DK019525 (R.M.C.)؛ المعاهد الوطنية للصحة/نياا F32-AA024347 (كيركراده). وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة P30-DK050306 ومرافقها الأساسية (الباثولوجيا الجزيئية والتصوير، والبيولوجيا الجزيئية/الجينات التعبير الأساسية، خلية الثقافة الأساسية و) وقائدها منح البرنامج. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BioExpress Vortex MixerGeneMateS-3200-1Vortex Mixer
الطرد المركزي 54242 REppendorf54242 Rالطرد المركزي الدقيقة المبردة
الدوار: FA-45-24-11
جهاز طرد مركزي Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6 +جهاز طرد مركزي عالي السرعة
الدوار: F21S-8x50y
طرد مركزي Sorvall Legend RT +Thermo ScientificLegend RT +أجهزة الطرد المركزي المبردة عالية السعة
الدوار: 75006445 دلو: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor كوكتيلSigma Aldrich04 693 116 001أقراص مثبطات الإنزيم
البروتيني Diagenode Bioruptur UCD-200DiagenodeUCD-200نظام صوتنة
Dounce Tissue Grinder (45 مل)Wheaton357546استخدم مدقة
فضفاضةطقم عزل الشبكة الإندوبلازمية من Dulbecco (1x)Corning21-031-CM
Sigma AldrichER0100لاستخراج مجموعة ER: يحتوي
على:
مخزن مؤقت للاستخراج متساوي التوتر 5X 100 مل
مخزن استخلاص منخفض التوتر 10 مل
كلوريد الكالسيوم ، محلول 2.5 متر 5 مل
OptiPrep كثافة التدرج متوسط 100 مل
إبرة أنف حادة 1 ea.
مصدر الضوء الخارجي للإثارة الفلوريةLeica LeicaEL6000
حمض الهيدروكلوريكSigma AldrichH1758حمض الهيدروكلوريك
ImageJبرنامج تحليل الصور
مقلوب تعديل مجهرالتباين LeicaLeica DM IRB
طقم تخصيب الجسيم الليزومي للأنسجة والخلايا المستزرعةThermo Fisher Scientific89839لكاميرا مجهر عزل اللايزوسوم
QimagingQICAM سريع 1394
Optima XL-100K جهاز طرد مركزيفائق Beckman-CoulterXL-100Kجهاز طرد مركزي فائق
دوار: SW41Ti
ماصات باستورفيشر Scientific22-042817
طبق بتري 5 سمفيشر FB0875713A
بيرس BCA فحص البروتين كيتثيرمو فيشر العلمي23225
PhosSTOPسيجما ألدريتش04 906 845 001أقراص مثبطات الفوسفاتيز
شفرة جراحية معقمة # 10بايونيرS2646
السكروزفيشر العلميS5-500كريستال / معتمد ACS
ثلاثي الجليسريد Liquicolor KitStanbio  2200-225طقم الدهون الثلاثية الملونة
Tris BaseFisher ScientificBP152-1للمخزن المؤقت
TE Triton X-100Fisher BioReactorsBP151-1005٪ ، البولي إيثيلين جلايكول p- (1،1،3،3-tetramethylbutyl) -phenyl ether ، كاشف تحلل البروتين
UltraPure EDTA (0.5 م ، درجة الحموضة 8.0)Thermo Fisher Scientific15575-038للمخزن المؤقت TE
أجهزة جهاز العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118(2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Endoplasmic Reticulum IsolationLysosome IsolationLiver Tissue PreparationDifferential CentrifugationUltracentrifugation ProtocolLipid Droplet Purity AnalysisPLIN2 Marker DetectionSEC61A Protein Assay

مقالات ذات صلة