يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نمو وتوصيف العضوية المشعة من الغدد الثديية

7.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59293

⸱

مايو 3, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

تم المشعة التي وضعت من الغدد الثديية الماوس وتتميز لتقييم الصفات الظهاريه والتفاعلات مع الخلايا المناعية. يمكن استخدام العضوية المشعة لتحسين تقييم تفاعلات خلايا الخلايا التي قد تؤدي إلى تجنيد الخلايا السرطانية في الانسجه الطبيعية المشعة.

الملخص

العضوية المشتقة من الانسجه المهضومة هي بني متعددة الخلايا ثلاثية الابعاد (3D) التي تلخص أفضل في ظروف الجسم الخلوي من أحاديه الخلية. علي الرغم من انها لا يمكن ان نموذج تماما في تعقيد المجرية ، فانها تحتفظ ببعض وظائف الجهاز الأصلي. في نماذج السرطان ، وتستخدم عاده organoids لدراسة الورم الخلية الغزو. يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير وتوصيف الخلايا العضوية من انسجه الغدد الثديية العادية والمشعة للماوس لتقييم الاستجابة الاشعاعيه في الانسجه الطبيعية. هذه العضوية يمكن تطبيقها علي دراسات السرطان في المستقبل في المختبر لتقييم تفاعلات الخلايا السرطانية مع العضوي المشع. تم تقسيم الغدد الثديية ، المشع إلى 20 غراي وهضمها في محلول الثامن كولاجيناز. تم فصل العضوية الظهاريه عن طريق التمايز الطرد المركزي ، ووضعت العضوية الثلاثية الابعاد في الصفائح الدقيقة المنخفضة التصاق 96-حسنا. وأعرب organoids علامة ظهاري مميزه سيتوكيراتين 14. لوحظ تفاعل الضامة مع الهيكل العضوي في التجارب المشتركة في الثقافة. قد يكون هذا النموذج مفيدا لدراسة التفاعلات بين الأورام ، وتسلل الخلايا المناعية ، والاستقطاب الضام داخل بيئة مجهريه مشعة.

المقدمة

حوالي 60 ٪ من المرضي سرطان الثدي الثلاثي السلبية (TNBC) اختيار العلاج الحفاظ علي الثدي (BCT) كشكل من اشكال العلاج1. في هذه الطريقة العلاج ، يتم أزاله الورم الذي يحتوي علي جزء من انسجه الثدي ، ويتعرض الانسجه الطبيعية المحيطة للإشعاع المؤين لقتل اي خلايا الورم المتبقية. العلاج يقلل من تكرار في الكثير من السكان سرطان الثدي. ومع ذلك ، ما يقرب من 13.5 ٪ من المرضي المعالجين مع TNBC تجربه التكرارات الاقليميه2. ولذلك ، فان دراسة كيفيه توظيف الإشعاع الخلايا السرطانية المتداولة (ctcs) سوف يؤدي إلى رؤى هامه في تكرار المحلية3،4.

وقد أظهرت الاعمال السابقة ان الإشعاع من الانسجه الطبيعية يزيد من توظيف أنواع مختلفه من الخلايا5. في نماذج ما قبل السريرية من TNBC ، والتشعيع من الانسجه الطبيعية زيادة الضامة وبعد ذلك الورم الخلايا التوظيف إلى الانسجه الطبيعية5. وقد أثرت حاله المناعة علي تجنيد الخلايا السرطانية في المواقع المشعة ، مع ملاحظه هجره الخلايا السرطانية في المواد المناعية. تلخيص هذه التفاعلات باستخدام organoids المستمدة من الغدد الثديية سوف تسمح بمراقبه هجره الخلايا والتفاعلات الخلوية في الوقت الحقيقي مع المجهر والتصوير الخلوي الحي لتحديد دور الضرر الإشعاعي في تغيير سلوك الخلايا السرطانية.

ساعدت الغدد الثديية الماوس توضيح الخطوات الرئيسية في تطوير الغدة الثديية. و organoid الثديية هي متعددة الخلايا ، وبناء ثلاثي الابعاد من ظهاره الثديية المعزولة التي هي أكبر من 50 μm6، 7،8،9،10. باستخدام العضوية الظهاريه الاوليه ، Simian وآخرون تقييم العوامل اللازمة لتفريع في الغدة الثديية7. اكتشف شامير وآخرون ان النشر يمكن ان يحدث دون ظهاره للانتقال المستوي ، وتوفير نظره ثاقبه علي تتالي المنتشر8. طرق لتوليد وتوصيف العضوية من انسجه الغدد الثديية راسخة6,11,12,13. ومع ذلك ، علي حد علمنا ، لم يتم الإبلاغ عن أساليب لزراعه العضوية المشعة من الغدد الثديية. ومن شان وضع بروتوكول لزراعه وتوصيف الخلايا العضوية المشعة ان يكون خطوه حاسمه في تلخيص المناعة المستحثة بالإشعاع والتجنيد في الخلية السرطانية.

في هذه الورقة ، ونحن الإبلاغ عن طريقه لزراعه وتوصيف المشعة الثديية الظهاريه العضوية في الصفائح الدقيقة التصاق منخفضه المغلفة مع البوليمر ماء التي تدعم تشكيل خزان. وكانت هذه العضوية المستزرعة مع الضامة لفحص حركيه تسلل الخلايا المناعية. ويمكن توسيع هذا العمل لتشمل المشاركة في زراعه العضوية مع الخلايا الدهنية لتلخيص الخصائص الثديية, خلايا سرطان الثدي لتصور تجنيد الخلايا السرطانية, وخلايا CD8 + T لدراسة التفاعلات الخلايا المناعية الورم. ويمكن استخدام البروتوكولات المنشاة سابقا لتقييم العضوية المشعة. وقد سلطت النماذج السابقة المشاركة في التشكيل العضوي الثديي والخلايا المناعية الضوء علي أليات الانبثاث والنشر. وقد وجدت DeNardo وآخرون ان التنظيم الخلية الخلايا التائية + T من الضامة المرتبطة الورم تعزيز النمط الظاهري المنتشر من الأورام اللحمية الثديية14. كما استخدمت نماذج الثقافة المشتركة لتوضيح أليات التنمية البيولوجية. Plaks et al. أوضح دور الخلايا التائية + T كما أسفل المنظمين من العضوي الثديية15. ومع ذلك ، فان مجموعتنا هي أول من يؤسس اجراء لتصور كيف يؤثر تشعيع الانسجه الطبيعية علي سلوك الخلايا المناعية. لأنه قد ثبت تشعيع الانسجه العادية لتعزيز تجنيد الخلايا السرطانية5، يمكن تطوير هذا البروتوكول لتحليل كيفيه تغيير سلوك الخلايا السرطانية عن طريق تشعيع الانسجه الطبيعية والخلايا ، مما يؤدي إلى فهم أكبر تكرار السرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجريت الدراسات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات المؤسسية التي وافقت عليها لجنه الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات في جامعه فانديربيلت.

1-اعداد الفئران وحيازة الخلايا (المقتبسة من نغوين-نغوك وآخرون11)

  1. التضحية الفئران Nu/Nu (8-10 أسابيع من العمر) باستخدام CO2 اختناق تليها خلع عنق الرحم. تنظيف الجلد باستخدام الايثانول 70 ٪.
  2. Resect الغدد الثديية البطن والثدي الاربيه من الفئران باستخدام مقص قبل تعقيمها وملقط. أزاله الغدد الليمفاوية قبل استئصالها. شطف في العقيمة 1x الفوسفات مخزنه المالحة (الشكل 1X).
  3. وضعه في أنابيب 15 مل مع 10 مل من دولبيكو النسر تعديل وسائل الاعلام/المغذيات المخلوط F12 (DMEM/F12) للنقل. يمكن ان تبقي عينات بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية أو معالجتها علي الفور. ابقي علي الثلج
  4. العينات المشعة في 20 غراي باستخدام مصدر السيزيوم (الشكل 1B).
  5. 45 دقيقه بعد التشعيع ، مكان الغدد الثديية في لوحه الخلايا المعقمة 35 مم واللحم المفروم مع المشرط (الشكل 1c ، D). اللحم المفروم مع ما يقرب من 40 السكتات الدماغية حتى يرتاح الانسجه ويتم الحصول علي القطع التي ليست أكبر من حوالي 1 مم2 في المنطقة.
  6. نقل إلى محلول كولاجيناز في أنبوب الطرد المركزي 50 mL. حل كولاجيناز يتكون من 2 ملغ/مل كولاجيناز (انظر جدول المواد) ، 2 ملغ/مل التربسين ، 5 ٪ v/v الجنين البقري المصل (ار) ، 5 ميكروغرام/مل الانسولين ، و 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين في الاعلام Dmem/F12. استخدام محلول كولاجيناز 10 مل لكل ماوس.
  7. مكان في حمام مياه في 37 درجه مئوية ، vortexing كل 10 دقيقه ل 30-60 دقيقه. اكتمال الهضم عندما حل كولاجيناز هو غائم (الشكل 1E ، F).
  8. أدر المحلول المهضوم عند 450 × g لمده 10 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT). سيتم ملاحظه ثلاث طبقات. ويتكون ماده طافي من الدهون ، والطبقة الوسطي هو محلول مائي ، والجزء السفلي هو بيليه. وسوف تظهر بيليه الأحمر كما هو خليط من الخلايا الظهاريه ، الخلايا اللحمية الفردية ، وخلايا الدم الحمراء (الشكل 1G).
  9. ما قبل الشوفان جميع الماصات ، ونصائح ماصه ، وأنابيب الطرد المركزي مع الزلال مصل الدم (بوسنيا) الحل قبل الاتصال. ويتالف حل جيش صرب الجمهورية من 2.5 في المائة من الصرب في الفوسفات المخزن في المحلول الملحي في دولبيكو (DPBS). لطلاء ما قبل ، ببساطه أضافه ثم أزاله الحل جيش صرب البوسنيين إلى الداخل من طرف ماصه وأنابيب. يمكن أعاده استخدامها حل جيش صرب البوسنيين ، علي الرغم من انه ينبغي ان تكون معقمه تصفيتها قبل كل تجربه.
  10. لمزيد من الانتعاش ، ونقل ماده طافي إلى الطازجة جيش صرب البوسنيين المغلفة أنبوب 15 مل. ماصه صعودا وهبوطا بقوة لتفريق طبقه الدهون. أجهزه الطرد المركزي في 450 x g لمده 10 دقيقه في RT. يستنشق supernatant ، تاركا كميه صغيره من وسائل الاعلام في أنبوب لتجنب شفط بيليه الخلية.
  11. يستنشق الطبقة المائية من الأنبوب مع بيليه الأصلي.
  12. أضافه 10 مل من DMEM/F12 إلى أنبوب مع بيليه الأصلي ونقل إلى الأنبوب الثاني. ماصه بقوة للجمع بين وأعاده تعليق الكريات اثنين.
  13. جهاز الطرد المركزي في 450 x g لمده 10 دقيقه في RT. يستنشق ماده طافي وأضافه 4 مل من dmem/F12 إلى الأنبوب.
  14. أضافه 40 μL من deoxyribonase (DNase) إلى تعليق ويهز بلطف باليد ل 2-5 دقيقه في RT. DNase الحل يتكون من 4 ش/مل DNase في DMEM/F12.
  15. أضافه 6 مل من DMEM/F12 وماصه تماما. الطرد المركزي أنبوب في 450 x g لمده 10 دقيقه في RT.
  16. يستنشق ماده طافي إلى علامة 0.5 mL. أعاده التعليق في 10 مل من DMEM/F12 وماصه تماما.
  17. نبض إلى 450 x g وتوقف 4 s بعد الوصول إلى تلك السرعة.
  18. كرر الخطوات 1.16-1.17 ثلاث مرات أخرى لتنقيه الهيكل العضوي عبر التفريق الطرد المركزي. يجب ان يكون بيليه الآن لون خارج البيضاء تتكون من العضوية الظهاريه فقط (الشكل 1H).
    ملاحظه: يمكن أيضا ان تتم تصفيه Organoids باستخدام مرشحات شبكه معقمه 40 μm. بعد الخطوة 1.16 ، الوسائط الماصة التي تحتوي علي organoids من خلال فلتر في أنبوب الطرد المركزي ، ومن ثم شطف مع 5 إلى 10 مل من الوسائط DMEM/F12. اقلب الفلتر علي أنبوب الطرد المركزي 50 mL الجديد. تمرير 10 مل من وسائل الاعلام DMEM/F12 من خلال ، والذهاب في الطريق المعاكس لشطف اي retentate. يجب ان تتكون المصفاة من organoids ، وينبغي ان تتكون الترشيح أساسا من الخلايا اللحمية ، والتي يمكن التخلص منها أو الاحتفاظ بها إذا رغبت في ذلك.

2. تحديد الكثافة والطلاء organoids

  1. أعاده التعليق بيليه في 10 مل من DMEM/F12. ماصه جيدا لخلق حل متجانس.
  2. نقل 50 μL إلى صحن بيتري 30 ملم ، وعرض تحت المجهر النقيض المرحلة في 20x. احسب عدد العضو العضوي مع عداد العد.
    ملاحظه: هنا تم استخدام نصائح ماصه باستمرار مع الحد الأدنى من قطر 457 μm ، وهو 5-10 مره قطر الهيكل التنظيمي التي يتم المصنفة. لنقل وحدات التخزين من 2 مل أو أكبر (علي سبيل المثال ، الخطوات 1.16 و 2.1) ، استخدم الماصات المصلية بأقطار الأطراف الزائدة من 1,500 μm.
  3. حساب كثافة organoid باستخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-1
    الكثافة المطلوبة هي 1,000 organoids/مل لتبسيط مزيد من التخفيف. إذا كانت الكثافة منخفضه جدا ، الطرد المركزي في 450 x g لمده 5 دقائق والشفط وسائل الاعلام. أضافه وسائل الاعلام اللازمة للوصول إلى 1,000 organoids/مل ، وماصه تماما لخلق خليط متجانس.
    1. لزراعه العضوية في مصفوفة البروتين ، والبذور العضوية في تركيز 1 organoids/لتر في نوع الكولاجين 1 المخفف إلى 87 ٪ أو في غشاء الطابق السفلي المستخرجة من انجلبريث-هولم-سرب ساركوما الماوس. اثناء العمل مع العينات ، والحفاظ علي الجليد.
    2. لتجميد العضو العضوي ، انقل الحجم المطلوب إلى أنبوب طرد مركزي منفصل. تدور في 450 x g لمده 5 دقائق الوسائط التي يستنشق ، ومن ثم أضافه نفس الحجم من 90 ٪/10 ٪ dmso. أعاده التعليق العضوي ، ومن ثم قسامه إلى كريتويبس. نقل إلى-80 درجه مئوية ، ومن ثم إلى النيتروجين السائل في غضون أسبوع واحد.
    3. لذوبان الجليد ، دافئه في 37 درجه مئوية حمام المياه لمده دقيقه واحده. أجهزه الطرد المركزي في 450 x g لمده 5 دقائق ، ثم يستنشق وسائل الاعلام تجميد. شطف مع DPBS معقمه ، ومن ثم أجهزه الطرد المركزي مره أخرى. الشفط DPBS وأضافه وسائل الاعلام الorganoid.
  4. ماصه 50 μL (50 organoids) في كل بئر من لوحه التصاق منخفضه (الشكل 1I).
  5. أضافه 150 μL من وسائل الاعلام organoid لتحقيق حجم العمل الإجمالي إلى 200 μL. تتكون وسائل الاعلام العضوية من 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين و 1 ٪ الانسولين ترانسفيرين-السيلينيوم (لها) في DMEM/F12 وسائل الاعلام.
  6. كل 2 أيام استبدال وسائل الاعلام بعناية.
    ملاحظه: لوحات التصاق منخفضه ليست ثقافة الانسجه المعالجة ؛ لذلك ، يمكن فصل الخلايا بسهوله. يستنشق وسائل الاعلام ببطء عن طريق أماله لوحه وادراج غيض ماصه علي حافه كل بئر. ترك كميه صغيره من وسائل الاعلام في الجزء السفلي من البئر. أضف وسائل الاعلام الجديدة ببطء لتجنب تطبيق قوي القص غير الضرورية علي الهيكل العضوي.

3. شارك في الخياطة مع الضامة

  1. الحفاظ علي GFP أو dTomato الموسومة الخام 264.7 الضامة في DMEM وسائل الاعلام تستكمل مع 10 ٪ من الطراز الأول و 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين. البذور 1 × 104، 5 × 104، أو 1 × 105 خلايا/مل في وسائل الاعلام organoid.
  2. استخدم التباين في مرحله الخلية الحية والتصوير الفلوري لمراقبه تسلل الضامة مع مرور الوقت.

4. تلطيخ المناعي من organoids

ملاحظه: يمكن ان يكون الملونة Organoids في الآبار التصاق منخفضه أو يمكن نقلها إلى الشرائح الغرفة. للانتقال ، قم بالماصة برفق صعودا وهبوطا حتى تنفصل الصفائح العضوية. نقل إلى الشرائح الغرفة واحتضان ل 4-8 h للسماح organoids للانضمام إلى سطح اللوحة.

  1. أزاله المتوسطة organoid من الآبار عن طريق الشفط بعناية. إصلاح عينات مع 10 ٪ محايده الفورمالين مؤقت لمده 15 دقيقه في RT.
  2. غسل 3x 5 دقيقه في 1x تلفزيوني. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تخزين عينات ثابته في 4 درجه مئوية لمده أسبوع واحد لمزيد من تلطيخ.
  3. بيركابايز مع 0.1 ٪ 4-(1 ، 1 ، 3 ، 3-Tetramايثيل بوتيل) فينيل-البولي إيثيلين جلايكول لمده 5 دقائق.
    ملاحظه: إلى وصمه عار ل F-actin ، احتضان عينات مع phسبائك المخفف 1:1000 و 1.67 nM الصبغة النووية bisbenzimide في 1 ٪ تلفزيوني/بوسنيا لمده 1 ساعة في RT. ثم انتقل إلى الخطوة 4.8.
  4. [برميكابيز] مع 0.5 [ببس]. يمكن تخزين العينات في صور 4opy والصور المناعية. أليات التي تسهم في rlock CTC مع 5 ٪ مصل الماعز العادي في 0.1 ٪ من البلاستيك/البولي إيثيلين جلايكول سوربيتان monolaurate (PBST) لمده 1 ساعة في RT. غسل 3x 5 دقيقه مع تلفزيوني.
  5. احتضان مع المضادة للسيتوكيراتين 14 المخفف 1:1000 ، البريد--Cملتصقون المخفف 1:200 ، أو ضيق مفرق البروتين واحد المخفف 1:100 في 1 ٪ خ ع في PBST لمده 1 ساعة في RT. غسل 3x 5 دقيقه في PBST.
  6. احتضان مع الماعز المضادة للأرنب الثانوية المخفف 1:200 مع 1 ٪ خ ع/PBST ل 1 ح في RT. تغطيه مع إحباط لتجنب التعرض للضوء.
  7. غسل 3x 5 دقيقه في الاذاعه التلفزيونية. استخدام الصبغة النووية (انظر جدول المواد) إلى نوى وصمه عار.
  8. غسل 3x 5 دقيقه في الاذاعه التلفزيونية. إذا كنت تستخدم شريحة الغرفة ، وجبل مع الشفة. تخزين ملفوفه في رقائق في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 أسابيع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم الحصول بنجاح المشعة الظهاريه الثديية الثدي من الغدد الثديية الماوس ، معالجتها ، ومثقف علي لوحات التصاق منخفضه (الشكل 1). تم اختبار الغلة organoid من قبل البذر في بيئات النمو المختلفة (الشكل 2A-G). خلايا البذر مباشره علي ثقافة الانسجه تعامل 10 سم لوحات الخلية أسفرت عن فرط نمو الخلايا الليفية. تم التعرف علي الخلايا الليفية تحت المجهر علي النقيض من المرحلة في أو بالقرب من نفس المستوي من التركيز كما organoids ، وانها سرعان ما نشات من organoids مطلي في غضون أيام قليله. ولوحظ أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول ، قمنا بتطوير طريقه لنمو وتوصيف الغدد الثديية المشعة التي يمكن استنساخها (الشكل 1). تم تطبيق جرعه التشعيع من 20 غراي لتعكس السابقة في نماذج الجسم الخارجي من الخلايا السرطانية التوظيف5. تشعيع الغدد الثديية السابقة الجسم العضوي قبل تشكيل organoid يسمح للعزل من اثار الضرر الإشعاعي دون تسلل المقابلة من الخلايا المناعية. تطوير نموذج الانسجه الطبيعية المشعة في المختبر يتيح العرض في الوقت الحقيقي من التفاعلات الخلوية التي قد تسهم في الإشعاع المستحثة CTC الت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتورة لورا ل. Bronsart لتوفير GFP و dTomato-المسمي RAW 264.7 الضامة. تم دعم هذا البحث ماليا من قبل منحه المعاهد القومية للصحة #R00CA201304.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ فورمالين محايدVWR16004-128
مضاد للسيتوكيراتين 14abcamab181595القطعة: GR3200524-3
ألبومين مصل البقرSigmaA1933-25G
الكولاجين من النوع الأولكورنينج354236
كولاجيناز من المطثية هيستوليتيكوم ، النوع الثامنسيجماC2139
كولاجيناز IGibco17018029
DMEM / F12Thermofisher11320-033
DNAseRoche10104159001
DPBSFisher14190250
E-CadherinCell Signaling24E10Lot: 13
FBSSigmaF0926
GentamicinGibco15750
الماعز المضادة للأرانب الثانويةabcamab150077أخضر
القطعة: GR3203000-1
الماعز المضادة للأرانب أبكام الثانويةab150080أحمر
القطعة: GR3192711-1
Hoechst 33342Fisher62249Lot: TG2611041
الأنسولين (10 مجم / مل)SigmaI9278
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم ، 100xGibco51500-056
غشاء القاعدي Matrigel (غشاء القاعدي المستخرج من ساركوما الفأر Engelbreth-Holm-Swarm)مختبرات Corning356237
Normal Serum SerumVector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 ألواح بئرThermo174927
PBSVWR10128-856
Pen / StrepFisher15140122
Phalloidinabcamab176757Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1NovusNBP1-85047Lot: C115428
Triton X-100 (4- (1،1،3،3-Tetramethylbutyl) فينيل بولي إيثيلين جلايكول)SigmaX100-100ML
TrypsinGibco27250-018
Tween-20 (البولي إيثيلين جلايكول سوربيتان مونولورات)سيجماP1379-100ML
مخزن

المراجع

  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
  3. Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  4. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  5. Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
  6. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  7. Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
  8. Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
  9. Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
  10. Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
  11. Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
  12. Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
  13. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
  14. DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
  15. Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
  16. Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
  17. Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
  18. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  19. Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
  20. Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
  21. Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
  22. Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  23. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  24. Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
  25. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
  26. Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
  27. Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
  28. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  29. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  30. Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
  31. Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
  32. Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
  33. Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

14
نمو وتوصيف العضوية المشعة من الغدد الثديية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.