وتعرض هذه الورقة طريقة جراحية لتشريح المورفولوجية شبكية العين الخوادر جنبا إلى جنب مع بروتوكولات لمعالجة الأنسجة إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، واستخراج الحمض النووي الريبي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الشبكية الخوادر المورفولوجية يوفر نظام نموذجا ممتازا لدراسة العمليات morphogenetic أثناء التطوير. في هذه الورقة، نقدم بروتوكول موثوقة لتشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية الدقيقة. نهجنا الجراحية يستخدم أدوات ميكروديسيكشن--متاحة بسهولة لفتح الخوادر ودقة استخراج مجمعات العين والدماغ. هذه يمكن ثابتة، ويتعرضون إيمونوهيستوتشيميستري، وشبكية العين ثم شنت على شرائح المجهر وتصويرها إذا كان الهدف الكشف عن الهياكل الخلوية أو سوبسيلولار. بدلاً من ذلك، يمكن تكون معزولة عن أنسجة المخ شبكية العين غير المثبتة وتفكيك في المخازن المؤقتة المناسبة وتستخدم لاستخراج التفريد أو مرناً هلام بروتين (لتقييم تعبير البروتين أو الجينات، على التوالي). ممارسة هامة والصبر قد يكون مطلوباً للماجستير في بروتوكول ميكروديسيكشن ووصف، ولكن حالما يتقن، البروتوكول يمكن عزلة سريعة نسبيا من شبكية العين أساسا غير التالفة.
المقدمة
المورفولوجية الشبكية تتكون من حوالي 750 ommatidia محاطة بالخلايا الصبغية مرتبة في قرص العسل شعرية1،2،،من34. كل أوماتيديوم يحتوي على ثمانية من الخلايا العصبية مستقبله وأربع خلايا المخروط إفراز عدسة خليتين الصباغ الأولية. المحيطة بكل أوماتيديوم هي الخلايا المنتجة لصبغة شعرية ومجموعات شعيرات حسية. نظراً للطبيعة الانقسامية بعد وترتيب سداسية النمطية، يوفر الشبكية الخوادر المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة العمليات مورفوجينيتيك بما في ذلك خلية التصاق5،6، <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد الأنسجة
- إعداد المورفولوجية الصلبان (كما تم وصفه سابقا20) أو ثقافة معينة سلالات المورفولوجية للحصول على الخوادر للنمط الوراثي المطلوب. للتأكد من أن ظهور عدد كبير من الخوادر بالصدفة، تنشئ هذه الثقافات يطير في مكررة على الأغذية الغنية بالمغذيات وسائط أو وسائل الإعلام الغذاء القياسية سخاء وتستكمل مع الخميرة ولصق.
- الحفاظ على الثقافات المورفولوجية عند 25 درجة مئوية. لاستخدام نظام UAS GAL4 الصلبان، هو تقرير الرصد العالمي--GAL4 برنامج تشغيل مثالية المعرب عنها في العين اليرقات القرص الخلايا الخلفي ثلم morphogenetic وفي جميع أنحاء تطوير الخوادر21،،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
العين الخوادر هو أنسجة يسهل الوصول إليها بمثابة نموذج ممتاز للتحقيق في العمليات الإنمائية morphogenesis محرك الأقراص هذا. هنا، نحن قد تشريح شبكية العين واستخدمت الفلورة للكشف عن الوصلات أدهيرينس قمي (الشكل 3 ألف، جيم) أو caspase Dcp-1 (الشكل 3D) التي يتم تفعيلها أثناء [ابوبتوسس] (الشكل 3)25. تسمح هذه النهج بوضوح مراقبة الخلايا أثناء العمليات morphogenetic الرئيسية بما في ذلك التوظيف و morphog.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
طريقة تشريح العين الخوادر المورفولوجية الموصوفة هنا يسمح للعزلة من 6 إلى 10 مجمعات العين في الدماغ خلال 10 إلى 15 دقيقة. ومع ذلك، الصبر والممارسة ضرورية بغية إتقان تقنية تشريح وتحسين نوعية وسرعة من تشريح. يضمن هذا الوقت القصير تشريح كل عين تقريبا المرحلة الإنمائية ذاتها، الحد من تقلب في تعبير النمط الظاهري أو الجينات لشبكية العين في مجموعة البيانات. في حين قد تتطلب بروتوكولات بديلة أقل ممارسة لإتقان، لدينا بروتوكول يهدف إلى عزل نسيج الشبكية الحساسة منهجي مع تقليل خطر تمزق أو القص، نظراً للأضرار التي لحقت العين ي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن نشكر طبل زاك ولدينا المراجعين لتعليقات مفيدة على المخطوطة. وأيد هذا العمل R15GM114729.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أدوبي فوتوشوب | أدوبي | صورة تجهيز البرمجيات | |
| الجبائر الخيزران, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| بيتا جلسرين فوسفات | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| طبق | بتري زجاجي مملوء بالحافة مع SYLG170 أو SYLG184 (ملون أسود مع مسحوق فحم مطحون ناعما). اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 24-48 ساعة حتى يتبلمر. | ||
| حامل الشفرة | أدوات العلوم الدقيقة | 10053 | |
| ألبومين مصل الأبقار | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete ، أقراص كوكتيل مثبطة للبروتياز خالية من EDTA | Roche | ||
| متحد البؤر (Zeiss LSM 501) Carl | Zeiss | أو مجهر مشابه | |
| ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) Sigma-Aldrich | 40718 | ||
| شريط على الوجهين | 3M | 665 | |
| ذبابة الفاكهة وسائط الغذاء, غنية بالمغذيات | 7.5٪ سكروز ، 15٪ جلوكوز ، 2.5٪ أجار ، 20٪ خميرة البيرة ، 5٪ بيبتون ، 0.125٪ MgSO4< / sub>.7H2< / sub>O ، 0.125٪ CaCl 2< / sub>.2H2< / sub>0 | ||
| ذبابة الفاكهة< / em> وسائط الغذاء ، وصفة دقيق الذرة القياسية | Bloomington Tذبابة الفاكهة مركز الأسهم. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك | سيجما ألدريتش | E6758 | |
| محلول | 4٪ فورماديهايد في PBS ، درجة الحموضة 7.4. | ||
| المجهر الفلوري (TCS SP5 DM المجهر) | Leica Microsystems | أو مجهر | |
| مماثل ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 91150-20 | ملقط بشكل متكرر. |
| الفورمالديهايد | ثيرمو سيانتيفيك | 28908 | |
| أطباق زجاجية 9 آبار | كورنينج | 7220-85 | المعروف أيضا باسم أطباق 9 آبار |
| أغطية زجاجية (22 × 22 مم) | من فيشر ساينتفيك | 12-542-B | |
| (25 × 75 × 1 مم) | ساينتفيك | 12-550-413 | |
| بتري زجاجي | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| إصدار برنامج Image Studio 5.2.5 | LI-COR Biosciences | برنامج معالجة الصور لقياس كمية البقع الغربية. | |
| عازلة عينة Laemmli | Bio-Rad | 161-0737 | 2X مخزن عينة البروتين المركز ، مكمل مع بيتا ميركابتو إيثانول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. |
| علامة حارة تقليل المخزن المؤقت للعينة | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X عازلة عينة البروتين المركزة. |
| أنابيب Microcentrigure | مقص التشريح المجهري Axygen | MCT-175-C | |
| أدوات العلوم | الدقيقة 15000-03 | ||
| صواني Microwell (72 × 10 & micro; L wells) | Nunc | 438733 | |
| وسائط | 0.5٪ N-propylgallate و 80٪ جلسرين في PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS في 0.1٪ DEPC ، درجة الحموضة 7.4) | أضف حجما مناسبا من DEPC إلى PBS ، واخلطه جيدا واحتضنه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع التحريك المستمر. الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة على الأقل. تخزين في 4 درجات; C | ||
| PBS (درجة الحموضة المالحة المخزنة بالفوسفات 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | التحضير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة |
| PBS + pi (PBS بالإضافة إلى مثبطات البروتياز والفوستايز) 10 | ملي مولار NaF و 1 ملي مولار فوسفات بيتا جلسرين و 1 ملي مولار Na 3< / sub>VO4< / sub> في PBS ، درجة الحموضة 7.4. | ||
| PBT | 0.15٪ TritonX و 0.5٪ ألبومين مصل بقري في PBS ، درجة الحموضة 7.4 | ||
| حامل دبوس | أدوات العلوم الدقيقة | 26016-12 | |
| الجسم المضاد الأساسي: الماعز المضاد ل GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | للنشاف الغربي. يستخدم في 1: 3000 |
| الجسم المضاد الأساسي: إشارات خلية Dcp-1 للأرانب المضادة للشق | 9578S | للتألق المناعي. يستخدم في 1: 100 | |
| الجسم المضاد الأساسي: الفئران المضادة ل DEcad | الدراسات التنموية بنك الورم الهجين | DCAD2 | للتألق المناعي. تستخدم في 1:20 |
| الجسم المضاد الأساسي: الفئران المضادة ل DEcad | DOI: 10.1006 / dbio.1994.1287 | DCAD1 | ؛ هدية من تاداشي أويمورا. تستخدم في الساعة 1:100. |
| مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي: مجموعة Relia Prep RNA tissue Miniprep | Promega | Z6110 | |
| Rnase (RNase Away) | المنتجات الحيوية الجزيئية | 7002 | |
| شفرات مشرط | أدوات العلوم الدقيقة | 10050 | اقطع قطعة صغيرة من شفرة الصلب وثبتها في حامل الشفرة. |
| الجسم المضاد الثانوي: 488-مترافق الحمار المضاد للفئران IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | للتألق المناعي. يستخدم في 1: 200 |
| الجسم المضاد الثانوي: cy3 الماعز المترافق المضاد للأرانب IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | للتألق المناعي. تستخدم في 1: 100 |
| الجسم المضاد الثانوي: تقنية إشارات الخلية IgG (H + L) المترافقة HRP المضادة للفئران IgG (H + L) | 7077 | للنشاف الغربي. يستخدم في 1: 3000 | |
| الجسم المضاد الثانوي: أرنب مترافق HRP مضاد للماعز IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | للنشاف الغربي. تستخدم في 1: 3000 |
| كلوريد الصوديوم | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| فلوريد الصوديوم | سيجما-ألدريتش | 215309 | |
| فانادات الصوديوم | سيجما-ألدريتش | 50860 | |
| مقياس الطيف الضوئي (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c & nbsp ؛ | |
| مجهر تشريح ستيريو (M60 أو M80) | Leica Microsystems | أو مجهر مشابه | |
| سيلجارد (أسود) | داو كورنينج | SYLG170 | |
| سيلجارد (شفاف) | داو كورنينج | SYLG184 | اللون أسود مع مسحوق شاركول مطحون ناعما |
| الأنسجة: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| إبرة التنغستن ، أدوات | العلوم الدقيقة | الدقيقة 10130-10 | أدخل في حامل الدبوس |
| إبرة التنغستن ، | أدوات العلوم الدقيقة | 10130-20 | أدخل في حامل الدبوس |
| WTLB (عازلة تحلل الأنسجة الغربية) | 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.5٪ تريتون X-100 ، 1 ملي EDTA ، 20٪ جلسرين ، 10 ملي مولار NaF ، 1 ملي فوسفات بيتا جلسرين و 1 ملي مولار Na3< / sub>VO4< / sub> في 50 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5). مكمل مع طاولة كوكتيل بروتياز واحدة لكل محلول 10 مل. | ||
| معجون الخميرة | (سوبر ماركت محلي) | ما يقرب من 2 ملاعق كبيرة من خميرة فليشمان النشطة الجافة (أو ما شابهها) مذابة في ~ 20 مل H2< / sub>O |
المراجع
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
