Method Article

دراسة آثار إشعاع الأنسجة الطبيعية باستخدام هيدروجيلات مصفوفة خارج الخلية

DOI:

10.3791/59304

⸱

July 24th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Radiation Oncology, Stanford University, 3Depattment of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 4Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طريقة لإزالة الخلايا وتشكيل هيدروجيل لاحق من منصات الدهون الثديية المورين بعد التشعيع خارج الجسم الحي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإشعاع هو علاج للمرضى الذين يعانون من سرطان الثدي السلبي الثلاثي. تأثير الإشعاع على المصفوفة خارج الخلية (ECM) من أنسجة الثدي السليمة ودورها في تكرار المحلية في موقع الورم الرئيسي غير معروف. هنا نقدم طريقة لإزالة الخلايا، التحلل، وتصنيع هيدروجيلات ECM المستمدة من منصات الدهون الثديية المورين. وتُعرض النتائج المتعلقة بفعالية عملية إزالة الخلايا، وجرى تقييم بارامترات الريولوجية. أظهرت خلايا سرطان الثدي التي تحمل اسم GFP وluciferase والمغلفة في الهيدروجيلات زيادة في الانتشار في المواد المائية المشععة. وأخيرا، تم استخدام تلطيخ المترافق phalloidin لتصور تنظيم الهيكل الخلوي للخلايا السرطانية المغلفة. هدفنا هو تقديم طريقة لتلفيق هيدروجيلات للدراسة في المختبر التي تحاكي في بيئة أنسجة الثدي في الجسم الحي واستجابتها للإشعاع من أجل دراسة سلوك الخلايا السرطانية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتميز السرطان بالانتشار الزائد للخلايا التي يمكن أن تهرب من المبرمج وأيضا تنتشر إلى مواقع بعيدة1. سرطان الثدي هو واحد من الأشكال الأكثر شيوعا بين الإناث في الولايات المتحدة، مع ما يقدر ب266،000 حالة جديدة و 40،000 حالة وفاة في عام 20182. وهناك عدوانية بشكل خاص وصعبة لعلاج النوع الفرعي هو سرطان الثدي السلبي الثلاثي (TNBC)، الذي يفتقر إلى مستقبلات الإستروجين (ER)، مستقبلات البروجسترون (PR)، وعامل نمو البشرة البشرية (HER2). يستخدم العلاج الإشعاعي عادة في سرطان الثدي للقضاء على الخلايا السرطانية المتبقية بعد استئصال الورم، ولكن أكثر من 13٪ من مرضى TNBC لا تزال تواجه تكرار في موقع الورم الأولي3.

ومن المعروف أن العلاج الإشعاعي فعال في التخفيف من الانبثاث والتكرار لأن الجمع بين استئصال الورم والإشعاع يؤدي إلى نفس البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل مثل استئصال الثدي4. ومع ذلك، فقد ثبت مؤخرا أن العلاج الإشعاعي يرتبط مع تكرار المحلية إلى موقع الورم الأولي في إعدادات المناعة5،6. أيضا، فمن المعروف جيدا أن الإشعاع يغير المصفوفة خارج الخلية (ECM) من الأنسجة الطبيعية عن طريق تحفيز التليف7. لذلك، من المهم فهم دور التغيرات التي يسببها الإشعاع ECM في إملاء سلوك الخلايا السرطانية.

وقد استخدمت الأنسجة منزوعة الخلايا كما في نماذج المختبر لدراسة المرض8،9. هذه الأنسجة منزوعة الخلايا الحفاظ على تكوين ECM وتلخيص المجمع في الجسم الحي ECM. هذه الأنسجة منزوعة الخلايا ECM يمكن معالجتها وهضمها لتشكيل هيدروجيلات ECM المعاد تشكيلها التي يمكن استخدامها لدراسة نمو الخلايا والوظيفة10،11. على سبيل المثال، تم استخدام هيدروجيل اتّممكن مشتق ة من يبأال بشري منزوع الخلايا ومن أنسجة عضلة القلب كأساليب غير غازية لهندسة الأنسجة، كما تم استخدام هيدروجيل مشتق من أنسجة الرئة البورسينية كطريقة اختبار في المختبر [mesenchymal] [سستم سلّ] ملحق وجدوى12,13,14. ومع ذلك، لم يتم التحقيق في تأثير الضرر الإشعاعي للأنسجة الطبيعية على خصائص ECM.

هيدروجيلات مشتقة من ECM لديها أكبر الإمكانات للدراسة في المختبر من الظواهر في الجسم الحي. وقد درست العديد من المواد الأخرى، بما في ذلك الكولاجين، الفيبرين، وmatrigel، ولكن من الصعب تلخيص تركيبة ECM13صناعيا. ميزة استخدام هيدروجيلات مشتقة من ECM هو أن ECM يحتوي على البروتينات اللازمة وعوامل النمو لأنسجة معينة14،15. يؤدي تشعيع الأنسجة الطبيعية أثناء استئصال الورم إلى تغييرات كبيرة في إدارة المحتوى في المؤسسة، ويمكن استخدام المواد المائية المشتقة من ECM لدراسة هذا التأثير في المختبر. هذا الأسلوب يمكن أن يؤدي إلى نماذج أكثر تعقيدا وأكثر دقة في المختبر من المرض.

في هذه الدراسة، أخضعنا منصات الدهون الثديية المورين (MFPs) للإشعاع السابق في الجسم الحي. تم إزالة الخلايا من الـ MFPs وتحويلها إلى حل ما قبل الجل. تم تشكيل هيدروجيلز مع الخلايا 4T1 جزءا لا يتجزأ، خط خلية Murine TNBC. تم فحص الخصائص الريولوجية لمادة هيدروجيل، وتم تقييم ديناميات الخلايا السرطانية داخل هيدروجيلز. هيدروجيلز ملفقة من الملوثات المتعددة الجنسيات المشعة تعزيز انتشار الخلايا السرطانية. وستتضمن الدراسات المستقبلية أنواع خلايا أخرى لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية في سياق تكرار السرطان بعد العلاج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت دراسات حيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات المؤسسية التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فاندربيلت.

1- إعداد الملوثات المتعددة الجنسيات وتشعيعها من الجسم الحي

  1. التضحية بالفئران Nu/Nu (8-10 أسابيع) باستخدام الاختناق ثاني أكسيد الكربون متبوعاً بخلع عنق الرحم.
  2. تنظيف الجلد باستخدام الإيثانول 70٪.
  3. جمع منصات الدهون الثديية (MFPs) من الفئران التي تم التضحية بها باستخدام مقص ملقط قبل تعقيمها في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على وسائل الإعلام RPMI كاملة (RPMI تستكمل مع 1٪ البنسلين-العقديات و 10٪ مصل البقر الجنيني) (انظر جدول المواد ).
  4. عينات تشعيع إلى 20 غراي باستخدام مصدر السيزيوم.
  5. جلب الـ MFPs المشعّة ووسائط RPMI الكاملة إلى خزانة السلامة البيولوجية. وسوف تعتمد وسائل الإعلام على خط الخلية التي سيتم زراعتها في هيدروجيل النهائي. املأ أطباق 6 سم أو 10 سم بما يكفي من الوسائط لغمر الـ MFPs. لأطباق 6 سم، استخدم 8 مل من وسائل الإعلام، وللأطباق 10 سم، استخدم 20 مل من وسائل الإعلام.
  6. حضانة في حاضنة CO2 37 درجة مئوية / 5٪ لمدة يومين. ويمكن تعديل طول الوقت في الحاضنة.
  7. شطف الأنسجة في المالحة المخزنة الفوسفات (PBS)، وصمة عار الرطوبة الزائدة، ووضع MFPs في أنابيب مخروطية 15 مل للتخزين في -80 درجة مئوية حتى إزالة الخلايا. تساعد هذه الخطوة تجميد خطوة إزالة الخلايا وينبغي تجميد العينة حتى لو كانت الخطوات التالية جاهزة خلاف ذلك.

2. إلغاء الخلايا (مقتبسة من المراجع12و16و17)

ملاحظة: تم تكييف هذا الإجراء من الأساليب المنشورة سابقا التي تركز على إزالة الخلايا الدهنية، والتي شملت المنظفات الأيونية ديوكسيتشوليت الصوديوم بدلا من كبريتات دوسيديسيل الصوديوم لإزالة الحمض النووي بكفاءة12،16 , 17.

  1. في اليوم1، إزالة MFPs المجمدة من -80 درجة مئوية وذوبان في درجة حرارة الغرفة.
  2. مرة واحدة إذابة، MFPs الجافة لفترة وجيزة على مسح مهمة حساسة. وزن الـ MFPs باستخدام مقياس تحليلي.
  3. باستخدام زوج من الملقط مع مقص أو مشرط، تقسيم الأنسجة إلى 3 مم × 3 مم × 3 مم عينات لدراسة ECM سليمة والأنسجة المتبقية لإنتاج هيدروجيل.
    ملاحظة: يعتمد عدد العينات على عدد أساليب الاختبار، على سبيل المثال، يرد وصف لجمع عينتين أدناه: واحدة لتضمين البارافين (الخطوة 2.5) وواحدة للتجميد في وسيط ة تضمين بالتبريد، إذا رغبت في ذلك (انظر جدول المواد والخطوة 2.6).
  4. وزن الأنسجة. إذا تم تضمين في البارافين للتقسيم، تابع إلى الخطوة 2.5. إذا تجميد في وسيط تضمين cryostat للتقسيم، تابع إلى الخطوة 2.6.
  5. في غطاء محرك السيارة الكيميائية، غمر الأنسجة في 10٪ محايدة العازلة فورمالين (NBF) (انظر جدولالمواد) لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية. اغسل 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. غمر الأنسجة في السكروز 30٪ لمدة 48 ساعة عند 4 درجة مئوية.
    1. وزن الأنسجة الآن بعد إزالة هذه القطعة. تابع إلى الخطوة 2.6.
  6. في غطاء محرك السيارة الكيميائية، وضع قطع MFP في كاسيت المسمى جاهزة مع التبريد تضمين المتوسطة. إضافة المزيد من تضمين cryostat المتوسطة لتغطية الأنسجة.
    1. ضع الكاسيت في كوب من 2-ميثيلبوتان (انظر جدولالمواد) التي يتم تبريدها مسبقا مع النيتروجين السائل. يجب أن يكون الكأس ما يكفي 2-ميثيلبوتان لتغطية الجزء السفلي ولكن ليس بما فيه الكفاية لغمر الكاسيت لأن وسيطة تضمين cryostat لا ينبغي أن تلمس 2-ميثيلبوتان. دع الكاسيت الجلوس في 2-ميثيلبوتان حتى يتجمد تضمين cryostat المتوسطة ويصبح مبهمة.
    2. التفاف كاسيت (ق) في احباط، تسمية، وترك في -80 درجة مئوية حتى تستخدم للتقسيم.
      ملاحظة: تم تقسيم الأنسجة الموضوعة على الفور في وسيط تضمين cryostat في 5 ميكرومتر في حين تم تقسيم الأنسجة الحاضنة في السكروز في 30 ميكرومتر للاحتفاظ مورفولوجيا adipocyte.
  7. استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة المتبقية.
    ملاحظة: يمكن أيضا وضع قطع الأنسجة في 10٪ NBF لمدة 24-48 ساعة، شطففي PBS، وترك في الإيثانول 70٪ حتى التضمين في البارافين. بعد التضمين، يمكن استخدام 5 أقسام ميكرومتر لتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوسين (H & E) (انظر القسم 7 أدناه).
  8. ضع الـ MFPs في أطباق 6 سم مع 5 مل 0.02% تريبسين/0.05% EDTA الحل. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ح. رش ومسح الأطباق مع الإيثانول 70٪ قبل وضعها في الحاضنة.
  9. استخدم المصافي سعة 0.7 مم لغسل الـ MFPs بالماء منزوع الأيونات (DI) عن طريق سكب الماء على الأنسجة ثلاث مرات. استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة في ما بين الأنسجة.
  10. الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح وتزن. ضع الأنسجة في كوب ما قبل الأوتوكلاف الذي يحتوي على شريط تحريك بحجم مناسب. تغطية الأنسجة مع 60 مل من 3٪ تي-أوكتيلفينوكسيبوليثوييثانول (انظر جدولالمواد) لكل 1 غرام من الأنسجة ويحرك لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ما لا يقل عن 20 مل.
  11. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة. شطف الكأس بالماء DI وتصب على الأنسجة. كرر مرتين أخرى. استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة في ما بين يشطف.
  12. الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح وتزن. ضع الأنسجة وحرّك القضبان مرة أخرى في نفس الأكواب، وغطيها بـ 60 مل من حمض الديوكسيكوليك بنسبة 4% لكل 1 غرام من الأنسجة. يُحرّك المزيج لمدّة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ما لا يقل عن 20 مل.
  13. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة شبكة. شطف الكأس بالماء DI وتصب على الأنسجة. كرر مرتين أخرى. استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة في ما بين يشطف.
  14. الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح وتزن.
  15. ضع الأنسجة في نفس الكأس مع مياه DI الطازجة المكمّلة بـ 1% بنسلين-ستربيساميسين. تغطية بإحكام مع فيلم البارافين. يُترك بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  16. غسل المصافي والأكواب للاستخدام في اليوم التالي.
  17. في اليوم 2، استنزاف محتويات الكأس في مصفاة. الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح وتزن.
  18. ضع الـ MFPs في نفس الكأس مع قضيب تحريك بحجم مناسب. تغطية مع 60 مل 4٪ الإيثانول / 0.1٪ محلول حمض الخليك لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدام ما لا يقل عن 20 مل. يُحرّك المزيج لمدّة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  19. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 ملم. استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة. ضع المحتويات مرة أخرى في الكأس. غسل الأنسجة عن طريق تغطيتها مع 60 مل من 1X PBS لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدام ما لا يقل عن 20 مل. يُحرّك المزيج لمدّة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر مرة واحدة.
  20. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 ملم. استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة. ضع المحتويات مرة أخرى في الكأس. غسل الأنسجة عن طريق تغطيتها مع 60 مل DI المياه لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدام ما لا يقل عن 20 مل. يُحرّك المزيج لمدّة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر مرة واحدة.
  21. الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح وتزن. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة. استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة.
  22. ضع المحتويات مرة أخرى في الكأس. تغطية الأنسجة مع 60 مل من 100٪ ن بروبانول لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدام ما لا يقل عن 20 مل. يُحرّك المزيج لمدّة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  23. الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح وتزن. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 ملم. استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة.
  24. ضع المحتويات مرة أخرى في الكأس. غسل الأنسجة عن طريق تغطيتها مع 60 مل من المياه DI لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدام ما لا يقل عن 20 مل. يُحرّك المزيج لمدّة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر ثلاث مرات.
  25. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة. كرر الخطوات 2.3-2.6 لجمع قطع من الأنسجة لحضانة السكروز والتجميد في وسيط تضمين cryostat.
  26. الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح وتزن. مكان في أنبوب المسمى 15 مل. تجميد عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

3- التكلى

  1. إزالة أنابيب 15 مل من -80 درجة مئوية ووضعها على الجليد الجاف. إبقاء عينات المجمدة على الجليد الجاف حتى على الليوفيليزر.
  2. إزالة القبعات. استخدام شريط مطاطي لإرفاق مهمة حساسة مسح إلى الأعلى لتغطية الافتتاح. وضع عينات على الليوفيل لمدة يومين على الأقل.
  3. إزالة عينات من الليوفيليزر ووضع أنابيب على الجليد الجاف. إزالة مناديل المهام الحساسة تزن كل عينة على مقياس تحليلي. إرفاق قبعات ووضع في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

4. طحن

  1. ملء حاوية ضحلة مع النيتروجين السائل. إزالة عينات من -80 درجة مئوية الفريزر. وزن كل MFP lyophilized.
  2. ضع عينة واحدة في هاون. استخدام قفاز المبردة لعقد هاون في النيتروجين السائل.
  3. استخدام مدقة تعلق على الحفر المحمولة لمطحنة العينة. مطحنة في 1 دقيقة فترات للتحقق من التقدم وإزالة اليد القفاز من النيتروجين السائل. مطحنة لمدة لا تقل عن 5 دقائق.
  4. كرر لجميع العينات. رش ومسح هاون وpestle مع الإيثانول بين كل عينة.
  5. تخزين عينات مسحوق في أنابيب 15 مل في -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: يمكن استخدام العينات على الفور أو تخزينها بين عشية وضحاها.

5. تشكيل هيدروجيل

  1. إذا تم تخزينها في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها، وإزالة وذوبان في درجة حرارة الغرفة. أثناء الذوبان، حساب الوزن اللازم من البيبسين (انظر جدولالمواد) وحجم حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) اللازمة لكل عينة التي تؤدي إلى حل مع 1٪ ث / الخامس مسحوق عينة و 0.1٪ ث / الخامس pepsin في 0.01 M حمض الهيدروكلوريك. حل البيبسين-حمض الهيدروكلوريك.
  2. إضافة عينة مسحوق وpepsin-حمض الهيدروكلوريك إلى أنبوب 15 مل. يُضاف بار صغير، ويُحرّك المزيج لمدّة 48 ساعة.
  3. ضع الأنابيب على الجليد لمدة 5 دقائق. إضافة الحجم المناسب من PBS 10X إلى كل أنبوب.
  4. إضافة 10٪ v / v 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل حل للوصول إلى الحموضة 7.4. استخدم ورقة الحموضة لاختبارها بشكل فردي.
    ملاحظة: قد يتم تخزين محلول الجل عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.

6. تغليف الخلايا في هيدروجيلات

  1. استخدام الخلايا التي تحمل علامة GFP وluciferase
    1. باستخدام محلول الجل pH 7.4، إعادة تعليق خلايا GFP- وluciferase المسمى 4T1 إلى تركيز 500،000 أو 1،000،000 خلية / مل من محلول هلام. إضافة 16 درجة مئوية من هلام خلية الحل إلى كل بئر من شريحة غرفة 16 جيدا. حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 100 ميكرولتر من وسائل RPMI كاملة إلى كل بئر. استمر في الحضانة لمدة 48 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. يمكن تصور الخلايا التي تحمل اسم GFP وluciferase باستخدام الفحص المجهري الفلوري في الساعة 0 و24 ساعة و48 ساعة بعد الجلج.
      ملاحظة: يمكن قياس انتشار الخلايا لخلايا 4T1 التي تحمل علامة GFP وluciferase المستخدمة هنا عن طريق إضافة (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt (انظر جدولالمواد) إلى الآبار لمدة 10 دقائق وأداء التصوير بالإنارة الحيوية باستخدام نظام التصوير بالإنارة الحيوية (انظر جدولالمواد). بعد التصوير بالإنارة الحيوية، يمكن تصور الهيكل الخلوي (انظر القسم 10).
  2. استخدام الخلايا غير المسماة
    1. باستخدام محلول الجل pH 7.4، إعادة تعليق خلايا 4T1 غير المسماة بالكريات بتركيز 500,000 أو 1,000,000 خلية/مل من محلول الجل. إضافة 16 درجة مئوية من هلام خلية الحل إلى كل بئر من شريحة غرفة 16 جيدا ولوحة 96 جيدا. حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 100 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى كل بئر. استمر في الحضانة لمدة 48 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن قياس صلاحية الخلية (انظر القسم 11). يمكن استخدام شريحة الغرفة ذات الـ 16 بئرًا للتصوير، ويمكن استخدام اللوحة ذات الـ 96 بئرًا للقياس الكمي.

7. H & E تلطيخ

  1. بالنسبة للأنسجة المموّقة بالبارافين، تغمر الشرائح التي تحتوي على 5 ميكرومتر اتّصل تُقسم مرتين في الزيلين بنسبة 100% (5-10 دقائق) لإزالة البارافين. إعادة الهيدرات عن طريق الغمر في 100٪، 95٪، 85٪، و 70٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منها تليها مياه DI لمدة 5 دقائق.
  2. لأقسام الأنسجة المجمدة، تأخذ أقسام على الفور من الفريزر وغمرها في 10٪ NBF لمدة 10 دقيقة. شطف في الماء لمدة 5 دقائق.
  3. نوى وصمة عار مع هيماتوإكسلين لمدة 3 دقائق شطف في مياه الصنبور الجارية.
  4. التمييز عن طريق غمس 1-2 مرات في 0.3٪ الكحول الحمضي (0.3٪ حمض الهيدروكلوريك في 70٪ الإيثانول). شطف في مياه الصنبور الجارية لمدة 5 دقائق.
  5. إضافة عامل التبلل لمدة 30 ق. شطف في مياه الصنبور الجارية لمدة 5 دقائق.
  6. احتضان مع eosin لمدة 90 s في درجة حرارة الغرفة. تجفيف في 3 تغييرات من الإيثانول 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  7. يُغمر مرتين في 100% من الزيلين لمدة 5 دقائق لكل منهما. إضافة الديستيريون-البلاستيك-إكسيلين (DPX0 تصاعد وسائل الإعلام إلى الشريحة وإضافة غطاء. دعه يشفى بين عشية وضحاها قبل التصوير.

8. 1---4-(Xylylazo)إكسيليل]azo)-2-naphthol تلطيخ

  1. إعداد 1-([4-)(Xylylazo)إكسيليل]azo)-2-naphthol الحل.
    1. إضافة 0.5 غرام من 1---4-(Xylylazo)إكسيليل]azo)-2-مسحوق النافثول إلى كوب مع 100 مل البروبيلين غليكول. الحرارة إلى 95-100 درجة مئوية مع التحريك لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    2. يُرفع الكوب عن النار ويُترك ليبرد قليلاً. صب الحل من خلال الصف 4 ورقة فلتر نوعي لإزالة أي الجسيمات المتبقية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة ويجب تصفيتها من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر مباشرة قبل تلطيخ.
  2. وصمة عار أقسام الأنسجة المجمدة.
    1. إزالة الشرائح من -80 درجة مئوية الفريزر والهواء الجاف لمدة 30 دقيقة. إصلاح الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    2. إزالة المياه الزائدة باستخدام مهمة دقيقة مسح قبل غمر في البروبيلين غليكول 2 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. إزالة الشرائح من البروبيلين غليكول. لا تشطف.
    3. ضع الشرائح في حقنة تصفية النفط الأحمر يا تلطيخ الحل لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. التفريق من خلال وضع الشرائح في 85٪ البروبيلين غليكول لمدة 5 دقائق شطف العينات في PBS مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    5. عينات وصمة عار مع هيماتوإكسلين لمدة 30 ق. غسل في مياه الصنبور الجارية لمدة 5 دقائق ثم وضع الشرائح في المياه DI.
    6. قم بتركيب العينات باستخدام وسيلة التركيب المائية والسماح للوسائط بالجفاف بين عشية وضحاها قبل التصوير.

9. علم الأنسجة

  1. جلب حلول ما قبل هلام من الخطوة 5.4 إلى مقياس الرطوبة على الجليد.
  2. إرفاق ذراع 25 مم ولوحة إلى مقياس الرطوبة. افتح برنامج علم الرهاة على الكمبيوتر المتصل بمقياس الرهامتر.
  3. قم بإجراء تعيين بالتناوب وتحديد الفجوة الصفرية. ارفع الذراع عند اكتماله.
  4. ماصة 500 درجة مئوية من قبل هلام على لوحة. خفض الذراع حتى الحل قبل هلام تحتل تماما الفجوة بين لوحة والذراع. كن محافظا لأن خفض الذراع الماضي هذه النقطة سوف يؤدي إلى حل ما قبل هلام تسرب من الجانب.
  5. إجراء مسح تردد على حل ما قبل هلام من 0.1-100 هرتز بعد أن ظلت عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. رفع ذراع مقياس الرطوبة عند اكتمالها. مسح السائل مع مسح مهمة حساسة. شطف مع الماء DI ومسح مع مسح مهمة حساسة. كرر الخطوات 9.4-9.6 مع عينات إضافية.

10. الفيلويدين تلطخ متقارن من F-أكتين

  1. جلب phalloidin حل مترافق إلى درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة بسرعة منخفضة قبل الافتتاح. Aliquot ما يكفي من الحل للحصول على وكالة الحاجة، وتخزين بقية في -20 درجة مئوية.
  2. تخفيف 1000x phalloidin حل الأسهم المترافقة إلى حل العمل 1X عن طريق إضافة 1 € L حل الأسهم إلى 1 مل 1X PBS + 1٪ المصل البقري الزلال (BSA). وهذا يجعل ما يكفي ل10 آبار (100 درجة مئوية / جيدا).
    ملاحظة: يمكن للمرء أن يستخدم عادي 1X PBS، ولكن 1X PBS + BSA يفضل لمنع الفيلويدين المتقارن من التمسك الأنبوب. لا تقم بتخزين هذا الحل بعد التساي. 1 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت الزرقاء (انظر جدولالمواد) يمكن إضافة حل العمل إلى وصمة عار للنوى. يمكن إجراء حل العمل عن طريق خلط 1 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت الزرقاء 20 مل مع 11.3 ميكرولتر 1x PBS.
  3. يستنشق أوساط من آبار (الخطوة 6.1). شطف الآبار مع 1X PBS.
  4. إضافة 10٪ NBF. الآبار الحضانة مع 10٪ NBF لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant. اغسل 3 مرات مع PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  5. إضافة 0.1٪ ر-Octylphenoxypolyethoxyethanol في PBS لمدة 5 دقائق.
  6. إضافة 100 درجة مئوية من حل العمل من الخطوة 10.2 إلى كل بئر. الحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يستنشق ويغسل 3 مرات مع PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة. ترك في PBS في 4 °C.
  7. يستنشق وإزالة الآبار من طوقا على الشريحة الغرفة. استخدام ملاقط الأنف إبرة لإزالة طوقا من الشريحة. جبل وعينات غطاء باستخدام المائية القائمة على تصاعد المتوسطة. السماح لعلاج (5 دقائق).
  8. مراقبة الخلايا تحت المجهر الفلوري في الإثارة / الانبعاثات من 590/618 نانومتر.

11. اختبار الصلاحية

  1. شطف الخلايا مع PBS دولبيكو (DPBS). إضافة 100 ميكرولتر من DPBS تحتوي على 1 μM calcein AM و 2 μM ethidium homodimer إلى كل بئر. الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. صورة الشريحة غرفة 16 جيدا عن طريق مجهريال الفلورية. يمكن ملاحظة الكالسين الأسيتوإكسميثيل (كالسين AM) عند الإثارة/الانبعاثات = 494/517 نانومتر. ويمكن ملاحظة الإيثيديوم هوموديمر عند الإثارة/الانبعاثات = 528/645 نانومتر.
  3. قراءة لوحة 96 جيدا على قارئ لوحة باستخدام نفس الأطوال الموجية في الخطوة 11.2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إزالة الخلايا من الـ MFPs بعد التشعيع باستخدام الإجراء الموضح في الشكل 1A. وتظهر الملوثات الصغرى قبل إزالة الخلايا (الشكل1B)وما بعد إزالة الخلايا (الشكل1C). تم تأكيد إزالة الخلايا باستخدام هيماتوكسيلين ويوسين (H & E) تلطيخ، و 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol تلطيخ تم استخدامها لتقييم محتوى الدهون (الشكل 2). كما تم تقييم الخصائص الريولوجية للهيدروجيلات ECM عند 37 درجة مئوية (الشكل3). وكان معامل ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الطريقة لتشكيل هيدروجيل تعتمد إلى حد كبير على كمية الأنسجة البداية. الملوثات المتوسطة المتوسطة Murine صغيرة، وعملية إزالة الخلايا يؤديإلى انخفاض كبير في المواد (الجدول 1). ويمكن تكرار هذه العملية مع المزيد من الملوثات الصغرى لزيادة الغلة النهائية. الطحن هو خطوة هامة أخرى قد تؤدي إلى فقدان المواد. وقد أظهرت أخرى النجاح مع مطحنة المبردة، ولكن هذا البروتوكول يقوم على طحن عنطريق هاون المحمولة والحفر الكهربائية مع مرفق الآفات 8،17. وينطوي ذلك على ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر المؤلفون الدكتورة لورا ل. برونسارت على توفير خلايا GFP- وluciferase-4T1، والدكتور إدوارد ل. لاغوري للحصول على المشورة بشأن 1---(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol تلطيخ، والدكتور كريغ ل. دوفال لIVIS واستخدام الليوفيليس، والدكتور سكوت أ. غيلشر لrheometer استخدام. وقد حظي هذا البحث بدعم مالي من #R00CA201304 منحة المعهد الوطني للصحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10٪ فورمالين محايد مخزن ، مكعب مع حنفيةVWR16004-128-2-ميثيل
بوتانألفا إيسار19387-AR
2000ex مقياس الريومترTA الأدوات10D4335مقياس الريومتر
الأبقار الألبومينسيجما-ألدريتشA1933-25G-كالسيين
أسيتوكسي ميثيل (الكالسيين AM)المجسات الجزيئية، Inc.C1430-D-Luciferin
Firefly ، ملح البوتاسيومBiosynth الكيمياء & علم الأحياءL-8820(S) -4،5-Dihydro-2- (6-hydroxy-2-benzothiazolyl) -4-thiazolecarboxylic حمض ملح البوتاسيوم
DPX Mountant للأنسجةSigma-Aldrich06522-500ML-Dulbecco
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتGibco
14040133-Eosin-Y مع الفلوكسينريتشارد آلان Scientific71304هوموديمر
إيوزين إيثيديومالمجسات الجزيئية ، Inc.E1169إيثيديوم متجانس -1 (EthD-1)
مصل الأبقار الجنينيسيجما-ألدريتشF0926-500ML-فيشر
للرعاية الصحية الأنسجة بالإضافة إلى OCT مركبفيشر ساینتفيك23-730-571ناظم البرد التضمين المتوسط
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01تركيب مائي
المنطقة الحرة 4.5Labconco7751020محلول التجفيد
بالليوهيست 33342 (20 ملم)Thermo Scientific62249صبغة الفلورسنت الزرقاء
حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتش258148-500ML-IVIS
Lumina IIIPerkinElmerCLS136334نظام تصوير التلألؤ البيولوجي
Kimtech Science KimwipesKimberly Clarkمناديل
مهمة دقيقةn-Propanol (خالي من البيروكسيد / التسلسل) ، Fisher BioReactorsFisher ScientificBP1130-500-Oil
Red OSigma-AldrichO0625-25G1- ([4- (Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinderOPS Diagnostics، LLCCG-08-02-PBS
(10X) ، درجة الحموضة 7.4Quality Biological، Inc.119-069-151محلول ملحي مخزن بالفوسفات
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140-122-بيبسين
من الغشاء المخاطي للمعدة الخنازيرسيجما ألدريتشP6887-5Gبيبسين
حمض البيراسيتيكسيجما ألدريتش77240-100
مل-فالويدين-iفلور 594 كاشف (ab176757)abcamab176757مترافق
فالودينبروبيلين جلايكولسيجما ألدريتشW294004-1KG-K-Richard-Allan
Scientific Signature Series كاشف أزرقريتشارد آلان Scientific7301Lعامل زرقاء
ريتشارد آلان سيجنتشر سينتساينت سيريز هيماتوكسيلين 7211ريتشارد آلان Scientific7211-RPMI
متوسط 1640جيبكو11875-093-ديوكسي
كولات الصوديوم ، 98٪فرونتير ساينتفيكJK559522حمض الديوكسيكوليك
السكروزسيجما ألدريتشS5016-Triton
x-100سيجما ألدريتشX100-100MLem>t< / em>-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمرGibco25200-056-Whatman
ورق ترشيح نوعي ، الصف 4Whatman1004-110ورق ترشيح نوعي من الدرجة 4
زيلين (معتمد من ACS) ، فيشر كيميكالفيشر ساينتفيكX5-4-
زلزال متوسط <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
  4. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
  5. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  6. Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
  7. Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
  8. Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
  9. Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
  12. Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
  13. Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
  14. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
  15. Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
  16. Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
  17. Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
  18. Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
  19. Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
  20. Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Matrix HydrogelsRadiation EffectsDecellularization ProcessMurine Mammary Fat PadHydrogel FabricationRheological PropertiesCell Proliferation AssayPhalloidin Conjugate StainingFluorescence MicroscopyScanning Electron Microscopy

Related Articles