Method Article

دراسة آثار إشعاع الأنسجة الطبيعية باستخدام هيدروجيلات مصفوفة خارج الخلية

DOI:

10.3791/59304

⸱

July 24th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Radiation Oncology, Stanford University, 3Depattment of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 4Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طريقة لإزالة الخلايا وتشكيل هيدروجيل لاحق من منصات الدهون الثديية المورين بعد التشعيع خارج الجسم الحي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإشعاع هو علاج للمرضى الذين يعانون من سرطان الثدي السلبي الثلاثي. تأثير الإشعاع على المصفوفة خارج الخلية (ECM) من أنسجة الثدي السليمة ودورها في تكرار المحلية في موقع الورم الرئيسي غير معروف. هنا نقدم طريقة لإزالة الخلايا، التحلل، وتصنيع هيدروجيلات ECM المستمدة من منصات الدهون الثديية المورين. وتُعرض النتائج المتعلقة بفعالية عملية إزالة الخلايا، وجرى تقييم بارامترات الريولوجية. أظهرت خلايا سرطان الثدي التي تحمل اسم GFP وluciferase والمغلفة في الهيدروجيلات زيادة في الانتشار في المواد المائية المشععة. وأخيرا، تم استخدام تلطيخ المترافق phalloidin لتصور تنظيم الهيكل الخلوي للخلايا السرطانية المغلفة. هدفنا هو تقديم طريقة لتلفيق هيدروجيلات للدراسة في المختبر التي تحاكي في بيئة أنسجة الثدي في الجسم الحي واستجابتها للإشعاع من أجل دراسة سلوك الخلايا السرطانية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتميز السرطان بالانتشار الزائد للخلايا التي يمكن أن تهرب من المبرمج وأيضا تنتشر إلى مواقع بعيدة1. سرطان الثدي هو واحد من الأشكال الأكثر شيوعا بين الإناث في الولايات المتحدة، مع ما يقدر ب266،000 حالة جديدة و 40،000 حالة وفاة في عام 20182. وهناك عدوانية بشكل خاص وصعبة لعلاج النوع الفرعي هو سرطان الثدي السلبي الثلاثي (TNBC)، الذي يفتقر إلى مستقبلات الإستروجين (ER)، مستقبلات البروجسترون (PR)، وعامل نمو البشرة البشرية (HER2). يستخدم العلاج الإشعاعي عادة في سرطان الثدي للقضاء على الخلايا السرطانية المتبقية بعد استئصال الورم، ولكن أكثر من 13٪ من مرضى TNBC لا تزال تواجه تكرار في موقع الورم الأولي3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت دراسات حيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات المؤسسية التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فاندربيلت.

1- إعداد الملوثات المتعددة الجنسيات وتشعيعها من الجسم الحي

  1. التضحية بالفئران Nu/Nu (8-10 أسابيع) باستخدام الاختناق ثاني أكسيد الكربون متبوعاً بخلع عنق الرحم.
  2. تنظيف الجلد باستخدام الإيثانول 70٪.
  3. جمع منصات الدهون الثديية (MFPs) من الفئران التي تم التضحية بها باستخدام مقص ملقط قبل تعقيمها في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على وسائل الإعلام RPMI كاملة (RPMI تستكمل مع 1٪ البنسلين-العقديات و 10٪ مصل البقر الجنيني) (انظر جدول المواد ).
  4. عينات....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إزالة الخلايا من الـ MFPs بعد التشعيع باستخدام الإجراء الموضح في الشكل 1A. وتظهر الملوثات الصغرى قبل إزالة الخلايا (الشكل1B)وما بعد إزالة الخلايا (الشكل1C). تم تأكيد إزالة الخلايا باستخدام هيماتوكسيلين ويوسين (H & E) تلطيخ، و 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol تلطيخ تم استخدامها لتقييم محتوى الدهون (الشكل 2). كما تم تقييم الخصائص الريولوجية للهيدروجيلات ECM عند 37 درجة مئوية (الشكل3). وكان معامل ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الطريقة لتشكيل هيدروجيل تعتمد إلى حد كبير على كمية الأنسجة البداية. الملوثات المتوسطة المتوسطة Murine صغيرة، وعملية إزالة الخلايا يؤديإلى انخفاض كبير في المواد (الجدول 1). ويمكن تكرار هذه العملية مع المزيد من الملوثات الصغرى لزيادة الغلة النهائية. الطحن هو خطوة هامة أخرى قد تؤدي إلى فقدان المواد. وقد أظهرت أخرى النجاح مع مطحنة المبردة، ولكن هذا البروتوكول يقوم على طحن عنطريق هاون المحمولة والحفر الكهربائية مع مرفق الآفات 8،17. وينطوي ذلك على .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر المؤلفون الدكتورة لورا ل. برونسارت على توفير خلايا GFP- وluciferase-4T1، والدكتور إدوارد ل. لاغوري للحصول على المشورة بشأن 1---(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol تلطيخ، والدكتور كريغ ل. دوفال لIVIS واستخدام الليوفيليس، والدكتور سكوت أ. غيلشر لrheometer استخدام. وقد حظي هذا البحث بدعم مالي من #R00CA201304 منحة المعهد الوطني للصحة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10٪ فورمالين محايد مخزن ، مكعب مع حنفيةVWR16004-128-2-ميثيل
بوتانألفا إيسار19387-AR
2000ex مقياس الريومترTA الأدوات10D4335مقياس الريومتر
الأبقار الألبومينسيجما-ألدريتشA1933-25G-كالسيين
أسيتوكسي ميثيل (الكالسيين AM)المجسات الجزيئية، Inc.C1430-D-Luciferin
Firefly ، ملح البوتاسيومBiosynth الكيمياء & علم الأحياءL-8820(S) -4،5-Dihydro-2- (6-hydroxy-2-benzothiazolyl) -4-thiazolecarboxylic حمض ملح البوتاسيوم
DPX Mountant للأنسجةSigma-Aldrich06522-500ML-Dulbecco
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتGibco
14040133-Eosin-Y مع الفلوكسينريتشارد آلان Scientific71304هوموديمر
إيوزين إيثيديومالمجسات الجزيئية ، Inc.E1169إيثيديوم متجانس -1 (EthD-1)
مصل الأبقار الجنينيسيجما-ألدريتشF0926-500ML-فيشر
للرعاية الصحية الأنسجة بالإضافة إلى OCT مركبفيشر ساینتفيك23-730-571ناظم البرد التضمين المتوسط
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01تركيب مائي
المنطقة الحرة 4.5Labconco7751020محلول التجفيد
بالليوهيست 33342 (20 ملم)Thermo Scientific62249صبغة الفلورسنت الزرقاء
حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتش258148-500ML-IVIS
Lumina IIIPerkinElmerCLS136334نظام تصوير التلألؤ البيولوجي
Kimtech Science KimwipesKimberly Clarkمناديل
مهمة دقيقةn-Propanol (خالي من البيروكسيد / التسلسل) ، Fisher BioReactorsFisher ScientificBP1130-500-Oil
Red OSigma-AldrichO0625-25G1- ([4- (Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinderOPS Diagnostics، LLCCG-08-02-PBS
(10X) ، درجة الحموضة 7.4Quality Biological، Inc.119-069-151محلول ملحي مخزن بالفوسفات
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140-122-بيبسين
من الغشاء المخاطي للمعدة الخنازيرسيجما ألدريتشP6887-5Gبيبسين
حمض البيراسيتيكسيجما ألدريتش77240-100
مل-فالويدين-iفلور 594 كاشف (ab176757)abcamab176757مترافق
فالودينبروبيلين جلايكولسيجما ألدريتشW294004-1KG-K-Richard-Allan
Scientific Signature Series كاشف أزرقريتشارد آلان Scientific7301Lعامل زرقاء
ريتشارد آلان سيجنتشر سينتساينت سيريز هيماتوكسيلين 7211ريتشارد آلان Scientific7211-RPMI
متوسط 1640جيبكو11875-093-ديوكسي
كولات الصوديوم ، 98٪فرونتير ساينتفيكJK559522حمض الديوكسيكوليك
السكروزسيجما ألدريتشS5016-Triton
x-100سيجما ألدريتشX100-100MLem>t< / em>-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمرGibco25200-056-Whatman
ورق ترشيح نوعي ، الصف 4Whatman1004-110ورق ترشيح نوعي من الدرجة 4
زيلين (معتمد من ACS) ، فيشر كيميكالفيشر ساينتفيكX5-4-
زلزال متوسط <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Matrix HydrogelsRadiation EffectsDecellularization ProcessMurine Mammary Fat PadHydrogel FabricationRheological PropertiesCell Proliferation AssayPhalloidin Conjugate StainingFluorescence MicroscopyScanning Electron Microscopy

Related Articles