Method Article

إعادة طلاء الخلايا العصبية البشرية المتعددة القوى المستمدة من الخلايا الجذعية من أجل فحص المحتوى العالي من تكوين النيونيتوجينيووووووين ونضج المشبك

DOI:

10.3791/59305

⸱

August 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of California, San Diego, 2Sanford Consortium for Regenerative Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إجراء مفصل لإعادة تعليق وزراعة الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا العصبية التي كانت تختلف سابقا عن الذرية العصبية في المختبر لعدة أسابيع. يسهل هذا الإجراء الاختبارات المستندة إلى التصوير للنيوريت، ونقاط الاشتباك العصبي، وعلامات الخلايا العصبية التي يتم التعبير عنها في وقت متأخر في شكل متوافق مع الفحص المجهري الخفيف وفحص المحتوى العالي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل الخلايا العصبية المتمايزة في الثقافة ثنائية الأبعاد من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى خلايا السلف العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية (NPCs) نظام نموذج قوي لاستكشاف آليات المرض وإجراء فحص المحتوى العالي (HCS) لاستجواب المركب المكتبات أو تحديد الأنماط الظاهرية للطفرة الجينية. ومع ذلك، مع الخلايا البشرية الانتقال من المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني إلى وظيفية، الخلايا العصبية الناضجة يتطلب عدة أسابيع. عادة ما تبدأ نقاط الاشتباك العصبي في تشكيل بعد 3 أسابيع من التمايز في ثقافة الطبقة الأحادية، والعديد من البروتينات الخاصة بالخلايا العصبية، على سبيل المثال في وقت لاحق التعبير عن علامة عموم الخلايا العصبية NeuN، أو طبقة 5/6 الدماغ علامة الخلايا العصبية القشرية CTIP2، تبدأ في التعبير عن حوالي 4-5 أسابيع بعد التمايز. يمكن أن يكون هذا الوقت التمايز طويلة غير متوافقة مع ظروف الثقافة المثلى المستخدمة لأحجام صغيرة، منصات HCS متعددة الآبار. ومن بين التحديات العديدة الحاجة إلى خلايا مُتقيدة بشكل جيد وموزعة بشكل موحد مع الحد الأدنى من تجميع الخلايا، والإجراءات الثقافية التي تعزز القدرة على البقاء على المدى الطويل والنضج الوظيفي للمشبك. نهج واحد هو التمييز بين الخلايا العصبية في شكل حجم كبير، ثم لوحة لهم في وقت لاحق نقطة في سداسي كلورو البنزين متوافقة مع الآبار المتعددة. بعض التحديات الرئيسية عند استخدام هذا النهج replating تتعلق استنساخ وجدوى الخلية، وذلك بسبب تعطيل المجهدة للشبكة التقشرية وaxonal. هنا نقوم بتوضيح إجراء مفصل وموثوق به لإعادة تعليق الخلايا العصبية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان (hiPSC) بعد تمايزها لمدة 4-8 أسابيع في شكل كبير الحجم، ونقلها إلى ميكروتيدر 384-well لوحات ، وزراعة لهم لمدة 1-3 أسابيع أخرى مع بقاء الخلية ممتازة. هذا replating من الخلايا العصبية البشرية لا يسمح فقط دراسة التجميع متشابك والنضج في غضون أسبوعين من replating، ولكن أيضا تمكن دراسات تجديد النيورايت وخصائص مخروط النمو. نحن نقدم أمثلة على الاختبارات القابلة للتحجيم لنشأة النُشَع ومتشابك باستخدام منصة 384-well.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hiPSC) الخلايا العصبية المشتقة من أهمية متزايدة في مجالات البحوث الأساسية، وتطوير المخدرات، والطب التجديدي. سير العمل والإجراءات لتحسين ثقافتهم وصيانتها، وتحسين كفاءة التمايز في أنواع فرعية عصبية محددة، تتطور بسرعة1،2. لتحسين فائدة وفعالية التكلفة للخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية كأنظمة نموذجية قابلة للتحليلات عالية المحتوى في اكتشاف المخدرات والتحقق من الهدف، فمن المفيد تقليل الوقت التركيب اللازم لتوليد ناضجة، وظيفية الخلايا العصبية، مع الحفاظ على أقصى قدر من المتانة، واستنساخ، وأهمية النمط الظاهري. على الرغم من أن الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد تقود اختراقات في أبحاث تطوير الأعصاب3،إلا أن الثقافات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد متوافقة بشكل خاص مع التطبيقات الآلية القائمة على التصوير بسبب الحد الأدنى من سمك الأنسجة.

ومع ذلك، فإن تكييف أساليب الفحص القائم على التصوير مع نماذج الأمراض العصبية والعصبية والتنموية البشرية يواجه تحدياً كبيراً. الإطار الزمني المطول الذي ينضج الجهاز العصبي البشري في الجسم الحي يتطلب وقتا طويلا في الثقافة لاستيعاب البرامج الطبيعية للتعبير الجيني وتحقيق النضج العصبي.

إحدى النتائج العملية لبرنامج التمايز العصبي الطويل هو أن الحفاظ على الثقافات أحادية الطبقة المشتقة من hiPSC يجب أن تستمر لعدة أسابيع لتحقيق النضج متشابك كافية. خلال هذا الوقت، لا تزال الذرية العصبية التي لا تزال غير متمايزة الانقسام. هذه يمكن أن تزيد بسرعة من الثقافة واغتصاب المحتوى الغذائي المطلوب للحفاظ على الخلايا العصبية ما بعد الولادة قابلة للحياة. تقسيم بقوة الخلايا السلف العصبية (NPCs) يمكن أيضا أن تتنافس مع الخلايا العصبية لالركيزة النمو. وهذا يمكن أن يجعل هذه الثقافات عرضة لمشاكل التصاق ضعيف، وهو شرط غير مناسب للفحص القائم على التصوير. وعلاوة على ذلك، يجد العديد من المحققين أنه كلما كان حجم الثقافة أصغر، كلما زادت صعوبة الحفاظ على السكان الأصحاء من الخلايا العصبية المتمايزة لفترة كافية لمراقبة المراحل المتأخرة من التمايز العصبي. وبعبارة أخرى، يمكن أن تكون الاختبارات من نضج متشابك باستخدام نهج فحص المحتوى العالي (HCS) تحديا كبيرا للخلايا العصبية المستمدة من الإنسان.

للتحايل على بعض هذه المشاكل، تم استخدام إجراء لإعادة تعليق وإعادة طلاء الخلايا العصبية المستمدة من hiPSC المتمايزة سابقا. أولا، فإنه يسمح بدراسة نمو نيورايت (أو، على نحو أكثر دقة، تجديد النيورايت) في مجموعة من الخلايا العصبية ملتزمة تماما. ثانيا، إعادة طلاء الخلايا العصبية المتمايزة سابقا من شكل حجم كبير (مثل لوحات 10 سم أو أكبر)، وصولا إلى تنسيقات حجم صغيرة (مثل لوحات متوافقة مع HCS 96- أو 384 جيدا microtiter) تمكن من انخفاض كبير في مجموع وقت الزراعة في حالة حجم صغير. وهذا يسهل دراسة تجميع المشبك والنضج على مدى الأسابيع اللاحقة في المختبر.

ومع ذلك، فإن إعادة طلاء الخلايا العصبية الناضجة التي أنشأت بالفعل النيوريتات الطويلة وشبكة اتصال معقدة يطرح العديد من التحديات، واحدة منها هو معدل عالية ومتغيرة في بعض الأحيان من موت الخلايا. هنا، ونحن نصف إجراء replating التي تؤدي إلى البقاء على قيد الحياة الخلية ممتازة واستنساخ. عادة، تتعرض الخلايا العصبية للإنزيمات البروتيوليتيك لفترات حضانة قصيرة (عادة ~ 3-10 دقيقة) من أجل فصل الخلايا عن الركيزة قبل الثلاثية. يتم استخدام هذا الوقت البروتيوليسي وجيزة عادة لإعادة تعليق وتمرير العديد من أنواع الخلايا القسمة، بما في ذلك الخلايا غير العصبية والprogenitors غير متمايزة4،5،6. ومع ذلك، بالنسبة للخلايا العصبية المتمايزة التي تحمل النيوريتيات طويلة ومترابطة، فمن الضروري ليس فقط لفصل الخلايا عن الركيزة ولكن أيضا لتعطيل الشبكة الجذعية والإبطية من أجل عزل الخلايا الفردية مع تقليل الضرر. في الواقع، شبكة سميكة من الخلايا العصبية عادة ما يميل إلى فصل من الركيزة كورقة واحدة، بدلا من الخلايا الفردية. إذا لم يتم اتخاذ العناية لتخفيف شبكة سميكة من النيورايتات، الخلايا العصبية لا تصبح فقط تضررت لا رجعة فيه أثناء trituration، ولكن العديد منهم تفشل في تمرير من خلال مرشح المستخدمة لإزالة كتل، مما أدى إلى ضعف العائد الخلوي. فيما يلي وصف تعديل بسيط لإجراء حضانة البروتياز المستخدمة على نطاق واسع لمواجهة هذه الصعوبات.

في البروتوكول الموضح أدناه، يتم احتضان الخلايا العصبية لمدة 40-45 دقيقة مع البروتياز خفيفة، مثل الإنزيم البروتيوليتيك (على سبيل المثال، Accutase). خلال أول 5-10 دقيقة بعد إضافة الإنزيم، والشبكة العصبية يرفع قبالة من الركيزة كورقة. الحضانة مع البروتياز يستمر لمدة 30-40 دقيقة إضافية قبل المضي قدما مع trituration لطيف وتصفية. يساعد هذا الوقت الإضافي للحضانة على ضمان أن هضم المادة يرتاح الشبكة بين الخلايا، مما يضمن أن التتثّة اللاحقة تنتج تعليق الخلايا الفردية. هذا الإجراء يزيد من توحيد توزيع الخلايا عند إعادة الطلاء مع تقليل موت الخلايا. لقد طبقنا بنجاح هذه الطريقة replating إلى الثقافات العصبية المستمدة hiPSC التي تم إنشاؤها بواسطة بروتوكولات التمايز المختلفة7و8 ومن خطوط مختلفة من hiPSCs. الإجراء هو مناسبة اسميا للاستخدام مع معظم أو كل خطوط الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية. وقد لاحظنا أن تمديد فترة حضانة البروتياز ليس ضروريا ً تماماً لإعادة طلاء الثقافات من لوحات صغيرة الشكل (على سبيل المثال، قطر 35 مم)؛ ومع ذلك، كما نعرض هنا، فإنه يوفر فائدة كبيرة عند replating من لوحات قطرها كبير (على سبيل المثال، 10 سم قطرها أو أكبر)، ربما لأن neurites في مثل هذه اللوحات يمكن أن تمتد عمليات طويلة جدا وتشكل مجموعة مترابطة بشكل كثيف.

هنا نقوم بتوضيح هذه الطريقة ونوضح بإيجاز تطبيقها في الاختبارات لتكوين النيوريتوجينيس المبكر ونضج المشبك، والذي ينطوي على تجميع البروتينات قبل وpostsynaptic على طول dendrites وaxons، تليها في وقت لاحق التعريب المشترك في مواقع متشابك. وتبرز الأمثلة المزايا التي يوفرها هذا البروتوكول في الحفاظ على صلاحية الخلايا وإمكانية استنساخها. أولا، فإنه يسمح للمحققين لدراسة الخطوات المبكرة في تكوين النييوريات البشرية. يشبه الإعداد التجريبي الثقافات الأولية الشائعة الاستخدام للخلايا العصبية القشرية أو فرس النهر، حيث يتم استخراج الخلايا من الدماغ الجنيني المتأخر أو في وقت مبكر بعد الولادة، وينفصل عن طريق التريتوريشن بعد العلاج البروتياز لطيف، ويسمح ل بدء النيوريت أو لتجديد النيوريت اتى في الإجراء9،10. على غرار هذه الخلايا العصبية الأولية القوارض، الخلايا العصبية المستمدة من hiPSC تبدأ في تشكيل أو تجديد النيورايتات في غضون ساعات بعد إعادة الطلاء، مما يسمح بتصوير المخاريط النمو ومورفولوجيا النيورايت في بيئة الأمثل للتصوير الفناءي عالية مع أقل المحيطة الخلايا غير المتمايزة. وقد لاحظنا أن نمو نيورايت هو أكثر تزامنا بالمقارنة مع التأخيرات المتغيرة ومعدلات النمو المختلفة التي ينظر إليها عندما تبدأ الخلايا العصبية لأول مرة في التمييز بين السكان السلف. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح replating اختبار الخلايا العصبية التي تعبر عن علامات النوع الفرعي العصبي التي تظهر عادة في وقت لاحق في التطور العصبي، مثل طبقة القشرية 5/6 عامل النسخ CTIP2 (الدجاج ovalbumin النسخ المروج المنبع عامل التفاعل البروتين 2)، أو علامة عموم الخلايا العصبية NeuN11. ومن السمات المفيدة بشكل خاص لنهج إعادة الطلاء أن عملية تكوين المشبك تمضي ضمن إطار زمني متوافق مع HCS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. فترة التمايز قبل إعادة الطلاء

  1. تمييز الخلايا العصبية على أطباق 10 سم، وذلك باستخدام بروتوكول من اختيار7،8 حتى شكلت الخلايا العصبية شبكة سميكة مع عملياتها والتعبير ليس فقط علامات الخلايا العصبية في وقت مبكر مثل MAP2 أو TuJ1، ولكن أيضا علامات في وقت متأخر مثل NeuN.
  2. تغيير نصف وسيلة الاختيار كل 4 أيام خلال عملية التمايز العصبية.
    ملاحظة:     تغييرات متوسطة أكثر اتساعاأو تواترا تضعف العوامل الغذائية الأساسية، ويمكن أن لا تفضل النضج.
    1. بالنسبة للخلايا العصبية WT126 المشتقة من iPSC، استخدم وسائط الزراعة التالية بعد التمايز: 5 مل 100x N2 الملحق، 10 نانوغرام/مل BDNF، 10 نانوغرام/مل GDNF، 1 ميكروغرام/مل لامينين، 200 ميكرو متر حمض الاسكوربيك، 1 ميكرو متر ديبوتيريل-cAMP و 10 مل SM1 ل500 مل دولبكو تعديل النسر المتوسط/ خليط المغذيات F-12 (DMEM /F12). تدريجيا، وذلك باستخدام التغيرات نصف وسائلالإعلام، واستبدال مع المتوسطة القاعدية العصبية (جدول المواد) ونفس المكملات الغذائية.
    2. للخلايا العصبية CVB WT المشتقة من iPSC، استخدم المتوسط التالي بعد التمايز: 500 مل الأساسية العصبية A المتوسطة (جدولالمواد)و 500 مل DMEM /F12 المتوسطة مع 2 ميكروغرام / مل لامينين، 10 مل الجلوتامين الملحق (جدولالمواد)، 0.75 ملغم/مل بيكربونات الصوديوم، 5 مل الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية (MEM)، 0.2 م حمض الاسكوربيك، 10 نانوغرام /مل BDNF، 20 مل 50X B27، و 10 مل 100X N2 الملحق.

2. طلاء الآبار المتعددة

  1. في اليوم السابق لإعادة الطلاء، معطف مع بولي-L-ornithine (منظمة التحرير الفلسطينية). إذابة منظمة التحرير الفلسطينية في الماء المعقم لجعل محلول الأوراق المالية (10 ملغ / مل). تخزين هذا المخزون في -20 درجة مئوية. تخفيف PLO 1:100 في الماء لإنتاج تركيز 50 درجة مئوية / مل عند طلاء الزجاج ونسبة 1:1000 (10 ميكروغرام / مل) عند طلاء البلاستيك.
  2. تطبيق الطلاء مباشرة على لوحات الهدف. استخدام حجم الطلاء المناسب لحجم لوحة (أي، للوحة 24 جيدا تطبيق 500 درجة مئوية من حل منظمة التحرير الفلسطينية في بئر).
  3. السماح لوحات للجلوس في الظلام بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  4. استرداد لوحات المغلفة في يوم إعادة الطلاء ونقلها إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية العقيمة.
  5. يستنشق حل منظمة التحرير الفلسطينية ويشطف مرتين بالماء المعقم.
  6. تمييع اللامينين (1.15 ملغم/مل) في محلول ملحي مُسَنَّق بالفوسفات (PBS) في 1:400 تخفيف.
    ملاحظة: ذوبان اللامينين في 4 درجة مئوية وإضافة بسرعة إلى PBS لتجنب تجميع اللامينين وطلاء متفاوتة.
  7. يستنشق الماء المعقم ويطبق 500 لتر من طلاء اللامينين على الآبار المغلفة سابقا مع منظمة التحرير الفلسطينية.
  8. ضع لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4-6 ح. استخدام الحضانة أطول، تصل إلى 16 ساعة، للأسطح الزجاجية. استخدام أوقات الحضانة متسقة.

3. إعادة طلاء الخلايا العصبية المتمايزة

  1. شطف لوحة من الخلايا العصبية المتمايزة مع PBS مرة واحدة بلطف. تفريق PBS بلطف أسفل جدار اللوحة، وليس مباشرة على الخلايا، لتجنب تعطيلها.
  2. يستنشق بلطف PBS، والحرص على تجنب لمس الخلايا مباشرة ولكن لاستنشاق من حافة الطبق في حين يميل نحو الباحث.
  3. تطبيق على الأقل 1 مل من الإنزيمبروتيوليتيك (جدول المواد) لكل لوحة 10 سم وإعادة الخلايا إلى الحاضنة. إضافة أحجام أعلى قليلا إذا كانت غرفة زراعة الأنسجة يعرض معدل تبخر عالية بسبب انخفاض الرطوبة.
  4. حضانة الخلايا مع إنزيم بروتيوليتيك لمدة 40-45 دقيقة من أجل فصلها عن لوحة وفصلها عن الخلايا العصبية الأخرى داخل شبكة الخلايا العصبية.
    ملاحظة: التوقيت في هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية. يمكن أن يؤدي تبريد البروتياز في وقت مبكر جداً إلى زيادة موت الخلايا بعد إعادة الطلاء. توصي الشركة المصنعة للإنزيم البروتيوليتيك باستخدام درجات حرارة أقل بكثير من 37 درجة مئوية مع فترات حضانة أطول لخطوط الخلايا التمرير (على سبيل المثال، بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية). ومع ذلك, التعامل مع الخلايا العصبية في 4 °C ينبغي تجنب, كما أنها غالباً ما تظهر ضعف البقاء على قيد الحياة بعد التعرض البارد. وتقول الشركة المصنعة أيضا أن حضانة 60 دقيقة مع الإنزيم في 37 درجة مئوية يؤدي إلى تعطيل الأنزيمية. ومع ذلك، في تجربة المؤلفين، و40-45 دقيقة حضانة من الثقافات العصبية المستمدة hiPSC في 37 درجة مئوية يكفي للانفصال فعالة والبقاء على قيد الحياة الخلايا العصبية ممتازة عند إعادة الطلاء.
  5. تحقق من الخلايا العصبية على مجهر على النقيض من المرحلة خلال وقت الحضانة والسماح لعلاج البروتياز لمواصلة حتى الشبكة العصبية ينفصل تماما عن لوحة ويبدأ في كسر في أوراق أصغر عند هز لفترة وجيزة لوحة تحت المجهر.
  6. تبريد نشاط البروتياز باستخدام 5 مل من وسائل الإعلام DMEM الطازجة لكل 1 مل من البروتياز في لوحة 10 سم لوقف الهضم. تُطوّر الخلايا بلطف ضد ّ اللوحة 5-8 مرات لتعطيل الشبكة، وذلك باستخدام الماصات المصلية. يجب الحرص على عدم تطبيق الكثير من الضغط عند triturating، كما الخلايا العصبية المتمايزة هشة. لا تستخدم طرف P1000، كما نهاية حادة جدا وضيقة، وبالتالي يمكن أن محض أو تلف الخلايا العصبية.
  7. تطبيق الحل مع الخلايا من خلال مصفاة الخلية مع شبكة قطرها 100 ميكرومتر في انخفاض أنبوب مخروطي جديد 50 مل قطرة قطرة.
  8. شطف مصفاة مع 5 مل إضافية من وسائل الإعلام DMEM الطازجة، بعد الخلايا قد تمت تصفيتها من خلال.
  9. تدور الخلايا في جهاز الطرد المركزي benchtop في 1000 × ز لمدة 5 دقائق.
  10. العودة أنبوب مخروطي إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية واستنشاق معظم وسائل الإعلام، وترك حوالي 250 درجة مئوية لضمان الخلايا الاحتفاظ بالرطوبة.
  11. إعادة تعليق الخلايا بلطف في 2 مل من وسائل الإعلام DMEM الطازجة. لا ماصة بيليه ضد جانب الأنبوب. بدلا من ذلك، عكس بلطف مخروطي 2-3 مرات وتمرير الخلايا من خلال نهاية الأنابيب المصلية 5 مل لخلعها.
  12. تطبيق 10 ميكرولتر من الخلايا العصبية التي تم تعليقها على حافة مقياس الهيموكيتوماتومتر.
  13. إضافة 8-10 درجة مئوية من التريبان الأزرق لإسقاط الخلايا لتقييم صلاحية الخلية خلال هذه الخطوة إعادة تعليق. تطبيق 10 ميكرولتر من هذا الخليط على مقياس الهيموكيتومات أو غيرها من عدادات الخلايا التلقائية. تقييم قابلة للحياة تلك الخلايا التي هي مرحلة مشرقو واستبعاد صبغة الأزرق trypan.
  14. تحديد كمية الخلايا القابلة للحياة / مل، والاستعداد لتخفيف محتويات الأنبوب المخروطي وفقا لكثافة الخلية المطلوبة.
  15. لوحة ~ 10،000 خلية في بئر للوحة 384 جيدا؛ لوحة ~ 150،000-200،000 خلية في بئر للوحة 24 جيدا.
  16. إضافة DMEM جديدة إلى أنبوب مخروطي من الخلايا المعاد تعليقها لتحقيق التخفيف المناسب وإضافة ملاحق مناسبة إضافية مثل B27 و / أو BDNF, اعتمادا على متطلبات خط الخلية محددة.
  17. إمالة بلطف أنبوب مخروطي لخلط 2-3 مرات.
  18. قم بتسطي طلاء اللامينين من لوحة 24 بئر، أو من لوحة multiwell 384-well باستخدام أنبوب 16 قناة وشطف مرة واحدة مع PBS.
  19. قم بإستعصاق PBS باستخدام P1000 للوحة 24 بئر، أو ماصة 16 قناة للوحات 384 جيدا.
  20. تطبيق حل الخلية على كل بئر في حركة الشكل 8 لتجنب تكتل. ويمكن أيضا تحسين التوحيد الطلاء باستخدام أجهزة المناولة السائلة الآلي.
    ملاحظة: إضافة اللامينين إلى وسائل الإعلام بدءا من 2-4 أيام بعد replating يساعد أيضا على الحفاظ على توزيع متجانسة من الخلايا.
  21. كرر الخطوتين 3.19 و 3.20 لكل بئر.
  22. العودة لوحة إلى حاضنة تعيين في 37درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  23. بعد يومين، ابدأ في تغيير نصف المتوسط كل 4 أيام باستخدام وسائط ما بعد التمايز الموصوفة في القسم 1.2. بعد وقت النضج المطلوب، إصلاح الثقافات باستخدام 3.7٪ الفورمالديهايد في 37 درجة مئوية وخلايا وصمة عار وفقا لمتطلبات التجريبية.

4. خلية الصلاحية اختبار ما بعد replating

  1. إضافة مراسل الموت الخلية في وقت مبكر (VivaFix: 0.5 € L من محلول الأسهم 50 درجة مئوية لكل 500 μL وسائل الإعلام الثقافة في بئر) بعد دوامة لفترة وجيزة حل الأسهم.
  2. صورة الخلايا الحية والميتة المستزرعة على multiwells الزجاج القاع، بعد 20 دقيقة، دون أي خطوة الغسيل، منذ الفلوروسيس صبغ مرة واحدة فقط داخل الخلايا، أو إصلاح ووصمة عار مشتركة مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) و / أو الأجسام المضادة الأخرى قبل التصوير باستخدام مجهر بؤري.

5. تلطيخ المناعة

  1. إصلاح الثقافات مع 3.7٪ الفورمالديهايد في PBS بالإضافة إلى 120 مليون متر السكروز لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  2. شطف وpermeabilize مع 0.2٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم كتلة لمدة 30 دقيقة مع 2٪ الزلال المصل البقري (BSA).
  3. استعبد BSA دون الرينينغ وحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الأرنب المضادة MAP2 الأجسام المضادة 1:1,000، الماوس المضادة لβ3 tubulin (TuJ1) الأجسام المضادة 1:2000، الدجاج المضادة للنيوين الأجسام المضادة (1:100) والفئران المضادة CTIP2 الأجسام المضادة (1:500)، أو مع الماوس المضادة PSD95 ( 1:200)، أرنب المضادة للسينسابسين 1 (1:200) والدجاج المضادة MAP2 الأجسام المضادة لتلطيخ متشابك.
  4. شطف مع PBS، وحضانة مع اليكسا فلور المترافق الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى DAPI لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  5. وأخيرا، يغسل مرتين مع PBS قبل التصوير.

6. تصوير الكالسيوم

  1. إصابة الخلايا المستزرعة مع AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (معهد سالك للدراسات البيولوجية، GT3 مرفق الأساسية) في 10 أيام بعد replating وصورة لتقييم العابرين الكالسيوم عفوية في 3-4 أسابيع بعد replating.

7. الحصول على الصور وتحليلها

ملاحظة: وللاطلاع على تفاصيل عن نظام الاقتناء، يرجى الرجوع إلى كلبريس وآخرون12.

  1. استخدم وحدة تصوير للحصول على صورة يدوية أو تلقائية، ووحدة برمجية لتحليل الصور، مثل CellProfiler13،للقياسات المورفولومترية.
  2. حساب متوسط طول النيوريتيات الإيجابية TuJ1 وdendrites MAP2 إيجابية عن طريق قياس الطول الإجمالي لكل مجال من مجالات العرض مقسوما على عدد الخلايا العصبية (DAPI + MAP2 أو TuJ1 الخلايا الإيجابية) داخل نفس المجال.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعادة طلاء الخلايا العصبية المستمدة من hiPSCs التي تم تمييزها لعدة أسابيع يقدم العديد من المزايا. ومع ذلك، فصل وإعادة طلاء الخلايا العصبية المتمايزة التي لديها طويلة، مترابطة dendrites والمحاور (الشكل1A)يمكن أن يؤدي إلى جزء كبير من الخلايا العصبية التالفة لا رجعة فيه.

كما هو موضح في قسم البروتوكول، استخدمنا الحضانة مع إنزيم بروتيوليتيك لفصل الخلايا العصبية من الركيزة. عادة، بسبب شبكة سميكة من النيورايتات (الشكل 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أظهرنا إجراء ً مباشراً لإعادة تعليق وإعادة طلاء الثقافات العصبية البشرية التي تعمل على تحسين الجدوى، ونجاح التمايز، والتصوير دون الخلوي بطريقة متوافقة مع منصات فحص المحتوى العالي، وغيرها من الاختبارات ذات الصلة لاكتشاف المخدرات. ويبين الشكل 6 سير العمل العام والأمثلة على هذه التطبيقات.

على الرغم من أننا ركزنا هنا على الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC الموجهة نحو مصير الخلايا العصبية القشرية، ونحن نتوقع أن هذه الطريقة ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على قدم المساواة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل هو عنصر من عناصر مجموعات أبحاث الخلايا المعاد برمجتها التعاونية الوطنية (NCRCRG) لدراسة الأمراض العقلية، وكان مدعوما ً بمنحة المعهد الوطني للصحة U19MH1 2015-0644. كما تم دعم العمل الأولي من قبل المعهد الوطني للصحة منحة NS070297. نشكر الدكتوركارول ماركيتو وفريد غيج، معهد سالك، على توفير خط WT 126 من خلايا السلف العصبية، والدكتورين يوجين يو ولورانس غولدشتاين، جامعة كاليفورنيا في سان دييغو لتوفير خط CVB WT24 من خلايا السلف العصبية. نشكر ديبورا بري في مختبر الدكتورة آن بانغ، معهد سانفورد بورنهام بريبيس للاكتشافات الطبية، على المناقشات المفيدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي> بعد إعادة الطلاء الوسائط< / قوي>
L-Ascorbic AcidSigmaA4403أضف 1 مل من 200 ملي من المخزون إلى 1 لتر من وسائط N2B27
Dibutyryl-cAMPSigmaD0627أضف 1 & micro ؛ M
Human BDNFPeprotech450-0210 نانوغرام / مل التركيز النهائي
B27 (50x)ThermofisherScientific 17504044أضف 20 مل إلى 1 لتر N2B27 وسائط
DMEM / F12 مع GlutamaxThermofisher Scientific31331093أضف N2 ووزع في 50 مل من الأشكال المخروطية ؛ أغطية التفاف بارافيلم
Human GDNFPeprotech450-1010 نانوغرام / مل التركيز النهائي
35050038 GlutamaxThermofisher Scientificأضف 10 مل إلى 1 لتر وسائط N2B27 ؛ مكمل الجلوتامين
Mouse LamininSigmaP3655-10mgأضف 100 & micro ؛ L إلى 50 مل N2B27
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسيةThermofisher Scientific11140035أضف 5 مل إلى 1 لتر N2B27 وسائط
N2 (100x) تقنيات الحياة التكميلية17502048أضف 5 مل إلى 500 مل وسائط
Neurobasal A MediaThermofisher Scientific10888022تتحد مع DMEM / F12 لتوليد وسائط N2B27 لخلايا CVB wt ؛ الوسائط القاعدية العصبية
A الوسائط العصبية القاعدية العصبيةThermofisherScientific 21103049لخلايا WT126 ؛ الوسائط القاعدية العصبية
SM1 SupplementStemCell Technologies5711أضف 1:50 إلى الوسائط
بيكربونات الصوديومThermofisher Scientific25080-094أضف 10 مل إلى 1 لتر N2B27 وسائل الإعلام
< قوي > إعداد اللوحة < / قوي >
10 سم أطباق زراعة الأنسجةفيشر العلمي08772-Eأطباق بلاستيكية معالجة TC
6 آبار أطباق ثقافة الأنسجة توماسسينتفيلك1194Y80لوحات NEST
ماوس LamininLife Technologies23017-015أضف 1: 400 على البلاستيك
Poly-OrnithineSigmaP3655-10mgأضف 1: 1،000 على البلاستيك
UltraPure WaterPolared Life Technologies10977-015للتخفيف Poly-L-Ornithine
< قوي > كواشف الطلاء < / قوي >
100 ملي مصفاة خليةCorning431752معقمة ، ملفوفة بشكل فردي
384 بئرا ، طبقة 6007550 غير مطليةمن PerkinElmerمع PLO و Laminin
DPBSLife Technologies14190144محلول ملحي
مخزن بالفوسفات من Dulbeccoبولي دي ليسين مطلي مسبقا 384 بئر ألواحPerkinElmer6057500شطف قبل الطلاء ب laminin
StemPro AccutaseLife TechnologiesA1110501ضع لوحا 1 مل / 10 سم لمدة 30-45 دقيقة ؛ إنزيم محلل للبروتين
<قوي > مواد التثبيت< قوي>
37٪ فورمالديهايدفيشر ScientificF79-1مذاب في PBS
السكروزفيشر العلميS5-120.8 جم لكل 10 مل من
مواد التثبيت<القوية> المناعية< قوية>
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأرInvitrogenA-11001الجسم المضاد الثانوي
Alexa Fluor 568 الماعز المضاد للدجاجInvitrogenA-11041الجسم المضاد الثانوي
Alexa Fluor 647 Goat Anti-ChickenInvitrogenA-21449الجسم المضاد الثانوي
Alexa Fluor 561 الماعز المضاد للفئرانInvitrogenA-11077الجسم المضاد الثانوي
DAPIBiotium40043للفأر للحمض النووي
ضد b3-tubulin (TuJ-1)علم الأعصابMO15013للفئران في المرحلة المبكرة
ضد CTIP2Abcamab18465الطبقة 5/6 القشرية الخلايا العصبية
الجسم المضاد للدجاج ضد MAP2LifeSpan BiosciencesLS-B290علامة عصبية في المرحلة المبكرة
جسم مضاد للدجاج ضد NeuNMilliporeABN91عصبية في المرحلة المتأخرة
أجسام مضادة للأرانب ضد MAP2شيلي هالبينN / Aعلامة عصبية في المرحلة المبكرة
جسم مضاد للفأر ضد PSD-95SigmaP-246علامة ما بعد التشابك
الجسم المضاد للأرانب ضد Synapsin 1MilliporeAB1543علامة ما قبل التشابك
ألبومين مصل البقر (BSA) GEHealthcare Life SciencesSH30574.0210٪ في PBS لمنع
Titon X-100Sigma9002931تمييع إلى 0.2٪ على PBS للنفاذية
< قوية > علامات الجدوى< قوية>
Vivafix 649/660Biorad135-1118علامة موت الخلية
<قوي>تصوير الكالسيوم
اسم الكاشف / المعداترقم كتالوجالشركةتعليقات / وصف
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPREمعهد سالك ، GT3 Core FacilityN / Aمراسل الكالسيوم في نظام توصيل الفيروس
< قوي > hiPSC مشتق من NPCs< / strong>
WT 126 (Y2610) مختبرGageN / AMarchetto et al. ، 2010
CVB WT24Yeo و Goldstein labsN / Aغير منشور
يصور الجسم المضاد الجسمية المضادة علامة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
  2. Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109(2014).
  3. Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
  4. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
  5. Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
  6. Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
  7. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  8. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  9. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).
  10. Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
  11. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
  12. Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787(2014).
  13. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100(2006).
  14. Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
  15. Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
  16. Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
  17. Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
  18. Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
  19. Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
  20. Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
  21. Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900(2017).
  22. Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590(2018).
  23. Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem Cell derived NeuronsNeurite RegenerationSynapse MaturationHigh content ScreeningProtease IncubationCell ReplatingViability AssessmentNeuronal DifferentiationCalcium ImagingMultielectrode Array

Related Articles