يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور

8.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59314

⸱

أبريل 9, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، بروتوكولا للجسيمات واحدة تتبع تحليل الصور التي تتيح التقييم الكمي لنشر معاملات، أنواع الحركة والكتلة أحجام الجسيمات واحد الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري الأسفار.

الملخص

الجسيمات التي تتبع في تسلسل فيديو والتحليل اللاحق لمساراتها في الوقت الحاضر بعملية مشتركة في العديد من الدراسات البيولوجية. تحليل مستقبلات غشاء الخلية باستخدام مجموعات كنموذج، ونحن في الوقت الحاضر بروتوكول مفصل لهذه المهمة تحليل الصور باستخدام فيجي (إيماجيج) وإجراءات Matlab ل: 1) تحديد المناطق ذات الاهتمام وتصميم أقنعة تتكيف مع هذه المناطق؛ 2) تتبع الجسيمات في الأسفار مجهرية أشرطة الفيديو؛ 3) تحليل خصائص انتشار وشدة من المسارات المحددة. التحليل الكمي لمعاملات نشر، أنواع الحركة، وحجم الكتلة التي حصلت عليها مجهرية الأسفار ومعالجة الصور ويوفر أداة قيمة لتحديد موضوعيا ديناميات الجسيمات والمترتبة على تعديل الظروف البيئية. في هذا المقال نقدم بروتوكولات مفصلة لتحليل هذه الميزات. الطريقة الموضحة هنا ليس فقط يسمح الكشف عن تتبع جزيء واحد، ولكن أيضا أتمتة تقدير معلمات الانتشار الأفقي في غشاء الخلية ويصنف نوع مسار ويسمح تحليل كامل وبالتالي التغلب على الصعوبات في قياس حجم بقعة على مساره الكامل في غشاء الخلية.

المقدمة

بروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من بلير الدهن في حركة مستمرة بسبب نشر الحرارية. ديناميتها ضرورية لتنظيم استجابات الخلية، كما جزيئية تسمح تشكيل المجمعات التي تختلف في الحجم من مونومرات إلى ليغومرات وتؤثر في استقرار مما يشير إلى المجمعات. وهكذا توضيح آليات السيطرة على ديناميات البروتين تحديا جديداً في بيولوجيا الخلايا، اللازمة لفهم سبل توصيل الإشارات وتحديد مهام الخلية غير متوقعة.

وقد وضعت بعض وسائل بصرية لدراسة هذه التفاعلات في معيشة الخلايا1. ومن بين هذه، يسمح الانعكاس الداخلي الكلي مجهرية الفلورية (TIRF)، وضعت في أوائل الثمانينات، دراسة التفاعلات الجزيئية على أو بالقرب جداً من غشاء الخلية2. دراسة المعاملات الحيوية من الغشاء بروتين المسارات التي تم الحصول عليها من بيانات TIRF في الخلايا الحية، مطلوب جسيم واحد تتبع أسلوب (SPT). على الرغم من أن تتوفر عدة خوارزميات لذلك، نستخدم حاليا تلك التي نشرتها جاكامان et al.3 التي تعالج تباين الحركة الجسيمات في حقل جسيمات كثيفة التي تربط الجزيئات بين إطارات متتالية للاتصال المسار الناتج شرائح في مسارات كاملة (اختفاء الجسيمات مؤقتة). البرنامج يلتقط الجسيمات دمج وتقسيم تلك النتيجة من التجميع وتفكك الأحداث3. من بيانات الإخراج من هذا البرنامج الكشف عن الجسيمات على طول المسار الكامل بتحديد مواقفها X و Y في كل إطار.

وبمجرد اكتشاف الجسيمات، نقوم بتطبيق خوارزميات مختلفة لتحديد تيميلاج قصيرة نشرها معامل (د1-4)4،5. بتطبيق التحليل8 7،،من6لحظة قياس الطيف (MSS) أو عن طريق تركيب القيمة 'ألفا' بالتكيف للتشرد متوسط مربع (MSD) ل المنحنى9، نحن أيضا تصنيف الجسيمات استناداً إلى نوع المسار.

تحليل كثافة بقعة في الصور الأسفار هدف مشترك للعلماء في ميدان10،11. الخوارزمية الأكثر شيوعاً المستخدمة هو عدد ما يسمى والسطوع. ومع ذلك لا يسمح هذا الأسلوب الكشف الصحيح الإطار بكثافة في الجسيمات في كسر الجوال. ونحن، وهكذا ولدت خوارزمية جديدة لتقييم هذه الجسيمات كثافات الإطار حسب الإطار وتحديد حالتها التجميع. بمجرد اكتشاف إحداثيات كل الجسيمات باستخدام البرمجيات Track2 يو3، علينا أن نحدد كثافة في كل إطار عبر مسار كامل، أيضا مع مراعاة الخلفية الخلية في كل إطار. هذا البرنامج يوفر إمكانيات مختلفة لتحديد كثافة بقعة وخلفية الخلية، واستخدام البروتينات أحادي و dimeric المعروفة كمراجع، يحسب العدد التقريبي للبروتينات في الكشف عن الجسيمات (حجم الكتلة).

في هذه المقالة، يصف لنا دليل دقيق لتنفيذ الخطوات الثلاثة التالية: 1) كشف وتتبع الجسيمات واحدة على طول شريط فيديو للأسفار مجهرية باستخدام يو-المسار؛ 2) تحليل معامل نشر فوري (د1-4) لتلك الجزيئات ونوع الحركة (المحصورة أو الحرة أو الموجهة) الجسيمات مع مسارات طويلة من MSS؛ 3) قياس كثافة بقعة على طول الفيديو تصحيح بالأسفار الخلفية المقدرة لكل نقطة. وهذا يسمح لتقدير حجم الكتلة، وتحديد الخطوات فوتوبليتشينج.

استخدام هذا البروتوكول لا تتطلب مهارات متخصصة ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مع ثقافة الخلية، والتدفق الخلوي والفحص المجهري مرافق. يستخدم البروتوكول إيماجيج أو فيجي (توزيع ImageJ12) والمسار يو3وبعض إجراءات المخصصة المقدمة الإعلانية (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). إجراءات يو--المسار والمخصصة دهس Matlab التي يمكن تثبيتها في أي كمبيوتر متوافق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد العينات البيولوجية

  1. تنمو خلايا جوركات في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10 ٪ السفح، نابير ولام الجلوتامين (ربمي كاملة). الخلايا جوركات اليكتروبوراتي (20 × 106 خلايا/400 ميليلتر من 1640 RPMI مع السفح 10 ٪) مع ناقل مستقبلات chemokine أحادي بروتينات فلورية خضراء المسمى (CXCR4-أكجفب، 20 ميكروغرام) للسماح بالكشف عنها باستخدام مجهر الأسفار.
    ملاحظة: من الممكن استخدام أحادي البروتينات الفلورية الأخرى مثل مشري، مسكارليت، إلخ.
  2. تحليل ح 24 بعد تعداء الخلايا في سيتوميتير تدفق لتحديد جدوى الخلية والتعبير CXCR4-أكجفب.
  3. حدد الخلايا معربا عن مستويات منخفضة من CXCR4-أكجفب بالخلية فرز الخلايا إيجابيةانخفاض التجارة والنقل (الشكل 1)، كما مطلوب التعبير منخفضة من مستقبلات ترانسفيكتيد في تجارب تيرفم بغية ضمان تتبع الجسيمات مفردة للتتبع الفردية 9من المسارات.
  4. تحديد كمية عدد مستقبلات في سطح الخلية.
    ملاحظة: كما مثال13، مستقبلات المسمى أكجفب ~ 8,500-22,000/الخلية، تناظر ~ 2-4.5 الجسيمات/ميكرو2.
  5. ريسوسبيند فرز الخلايا في ربمي كاملة واحتضانها لمالا يقل عن 2 ح في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. الطرد المركزي خلايا (300 غ س، 5 دقيقة)، وحراكه لهم في TIRF المخزن المؤقت (pH حبس، 25 مم حبيس، FCS 2%، 7.3).
    1. لوحة على أطباق زجاجية ميكروويل 35 ملم (2-3 × 105 خلية/طبق) المغلفة مع فيبرونيكتين (20 ميكروغرام/مل، ح 1، 37 درجة مئوية) في وجود أو عدم وجود يجند المناسب (أي، CXCL12، 100 نانومتر، ح 1، 37 درجة مئوية). احتضان خلايا (20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2) قبل الحصول على الصور.
  6. القيام بتجارب باستخدام مجهر TIRF، مجهزة بكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر، 100 × الهدف النفط-الغمر (APO رر HCX 100 x/1.46 غ) و 488 نانومتر ليزر صمام ثنائي. المجهر يتيح التحكم في درجة الحرارة والحضانة مع CO2. قم بتحديد موقع وتركز الخلايا مع المقابض التركيز الخشنة وغرامة، باستخدام حقل مشرق للتقليل من آثار فوتوبليتشينج. للغرامة تركيز استخدام التكيف في وضع TIRF كثافة ليزر منخفضة، غير كافية للكشف عن الجسيمات مفردة أو للحث على آثار فوتوبليتشينج (طاقة الليزر 5 ٪، 28 μW).
  7. الحصول على أفلام (تسلسل الصور) لما يقرب من 50 s تقليل الفاصل الزمني بين الإطارات. ينبغي أن يكون اختراق الحقل زائل 70-90 نيوتن متر من العمق. حفظ الأفلام المكتسبة لكل شرط التجريبية ك ".lif" (video.lif).
    ملاحظة: تم اقتناء الأفلام في المثال المبين في 49 في المائة في طاقة الليزر (2 ميجاوات) مع وقت تعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 90، وفاصل زمني من 98 مرض التصلب العصبي المتعدد، ل 49 s (500 إطارات). كان الاختراق الموجه زائل المحددة 90 نانومتر.

2-اختيار الصور وإنشاء أقنعة

  1. لكل حالة تجريبية (video.lif)، قم بإنشاء مجلد جديد (فيديونامي) التي يجب أن تحتوي على مجلدات مختلفة لكل مجموعة. ويتضمن كل مجلد مجلد "فيديوسيق" لصور الفيديو ومجلد "نتائج" لنتائج التحليل. تأكد من أن بنية الملف في هذه اللحظة هو ما يلي:
    VideoName/video.lif
    فيديونامي/Series1/فيديوسيق
    فيديونامي/Series1/النتائج
    ملاحظة: من المجهر يتم الحصول على ملفات.lif مختلفة مع العديد من أشرطة الفيديو لكل شرط المعاملة (أي الجبهة الوطنية، الجبهة الوطنية + قوات الدفاع الذاتي). "video.lif" يتوافق مع ملف الفيديو input.lif مع جميع المقتنيات أفلام TIRF (سلسلة) يؤديها في المجهر. سوف يحتوي المجلد "فيديوسيق" على 500 إطارات الفيلم الذي نحن بتحليل. وسوف تحتوي على المجلد "نتائج" كافة الملفات الناتجة عن تحليل أداء. مصطلحات دقيقة والتعريب من مجلدات مختلفة ضرورية للدالة الصحيحة من الخوارزميات. أسماء بخط غامق في القائمة أعلاه هي ثابتة (أي، لديهم ليتم استدعاؤها في هذه الطريقة لأن هذه هي أسماء طلبتها البرامج النصية). يمكن تغيير الأسماء لا بخط غامق ليعكس إجراء التجربة.
  2. فتح الفيديو تيرفم (ملف.lif) مع فيجي أو إيماجيج عن طريق سحب وإسقاط الملف على شريط القوائم في فيجي وانقر فوق موافق لاستيراد الملف الآنف باستخدام بيوفورماتس (تكميلية الشكل 1).
  3. حدد سلسلة العملية ثم انقر فوق موافق (2A الرقم الإضافي). تصميم قناع لتحليل هذا الفيديو، استيراد أيضا صورة متعددة القنوات مع صباغات مختلفة (في المثال 1 سلسلة هو صورة متعددة القنوات وسلسلة 2 الفيديو المقابلة). وينبغي فتح الفيديو (والصورة الأقنية) رصة ImageJ. في المثال ("تكميلية الشكل" 2B)، الصورة على اليسار وشريط الفيديو على الحق.
    ملاحظة: إذا ليس هناك حاجة إلى إنشاء قناع للفيديو، انتقل إلى "الخطوة 2، 5".
  4. إنشاء قناع. إنشاء صورة واحدة مع القنوات مفيدة لتصميم القناع. وفي هذه الحالة، قنوات مثيرة للاهتمام هي الأحمر والأخضر والرمادي.
    1. تقسيم القنوات من الصورة الأقنية (3A الشكل التكميلية): حدد الصورة في الشريط القائمة ثم انقر فوق لون | تقسيم القنوات. سوف تظهر قنوات مختلفة كصور منفصلة (3B الشكل التكميلية).
    2. دمج القنوات الثلاث مرة أخرى في صورة واحدة (4A الرقم الإضافي): حدد الصورة في الشريط القائمة، وحدد لون | دمج قنوات. تحديد القنوات المناسبة واضغط موافق (4B الرقم الإضافي). وسوف تكون صورة جديدة غير مكدسة ولدت (تكميلية الشكل 4).
    3. مزامنة windows اثنين باستخدام أداة مزامنة Windows (5A الرقم الإضافي): حدد تحليل في الشريط القائمة | أدوات | مزامنة Windows. سيظهر إطار جديد مع إمكانيات الصورة تزامن (5B الرقم الإضافي).
    4. مع اثنين windows مزامنة (فقط الفيديو إذا لم يكن هناك لا صورة متعددة القنوات المرتبطة)، يمكن حصدها في نفس المنطقة في كل من ويندوز. رسم منطقة الاهتمام باستخدام أداة التحديد المستطيل من القائمة العائمة إيماجيج. حدد الصورة في الشريط القائمة وتحديد المحاصيل (6A الرقم الإضافي). سوف تظهر اثنين من اقتصاص الصور منفردة (6B الرقم الإضافي).
    5. أونسينتشرونيزي كل من ويندوز (6B الرقم الإضافي) بالضغط على زر أونسينتشرونيزي كافة في إدارة Windows المزامنة .
  5. إذا لم يتم إنشاء قناع كما في الخطوة 2، 4، رسم منطقة الاهتمام باستخدام أداة التحديد المستطيل من القائمة العائمة إيماجيج.
  6. حفظ الفيديو تسلسل الصور في الدليل فيديوسيق تحت الدليل فيديو المقابلة ("الشكل تكميلية" 7A): حدد الملف في الشريط القائمة ثم انقر فوق حفظ باسم | صورة تسلسل... إعادة تسمية التسميات لتسلسل الفيديو ك video0000.tif، video0001.tif،..., video0499.tif (7B الرقم الإضافي): في المربع الاسم ، قم بإعادة تسمية الفيديو ، ثم انقر فوق موافق. يجب أن يكون التسلسل وحدها في الدليل الخاص به لاستخدامها بنجاح من قبل يو-المسار.
    ملاحظة: إذا لم يكن وضع قناع للفيديو، انتقل إلى الخطوة 2.8.
  7. تصميم قناع. حدد صورة متعددة القنوات وفتح محرر تجزئة البرنامج المساعد (تكميلية الشكل 8 أ): حدد الإضافات في الشريط القائمة وحدد تجزئة | محرر تجزئة. إضافة وإعادة تسمية تسميات تجزئة حسب الاقتضاء بالحق النقر فوق تسميات المحرر تجزئة (8B "الرقم الإضافي"، ج).
    1. اختر أداة التحديد المناسبة في القائمة العائمة ImageJ (هنا، استخدم اليدوي)، حدد تسمية (الأخضر) والتصميم الأول قناع الأبعد ("تكميلية الشكل" 9 ألف). مجرد مصممة، سيتم عرض الزر اضغط + في اختيار خيار من نافذة المركبة ، والقناع المحدد على المشاهد ("تكميلية الشكل" 9 ألف). كرر هذه الخطوة مع التسميات التالية (الداخلية، باللون الأحمر) (9B الرقم الإضافي).
      ملاحظة: بعد وضع القناع للتسميات الخضراء، والداخلية، وسوف تشغل القناع الخارجي بقية الصورة.
    2. يتم ترميز الأقنعة في الصورة كمناطق 0، 1، 2،... ووفقا لترتيب التسميات في إطار التسميات RGB. عند كل الأقنعة لتسميات مختلفة مصممة، حفظ القناع مع نفس اسم الملف كالفيديو، مع اسم mask.tif (تكميلية الشكل 9): حدد الملف في الشريط القائمة، وحدد حفظ باسم | Tiff....
      ملاحظة: سوف تستخدم أقنعة المحدد في حساب معاملات نشرها والتصنيف للمسارات (راجع الخطوة 4، 2).
  8. تحقق من أن بنية الملف في هذه اللحظة هو ما يلي:
    VideoName/video.lif
    فيديونامي/Series1/ mask.tif
    فيديونامي/Series1/ فيديوسيق/video0000.tif
    فيديونامي/Series1/ فيديوسيق/video0001.tif
    ...
    فيديونامي/Series1/ فيديوسيق/video0499.tif
    فيديونامي/Series1/ النتائج
    ملاحظة: Mask.tif صورة مع القناع كما تم تصميمها في خطوات 2.4 و 2.7. Video*.tiff هو الفيديو كما تم حفظها في "الخطوة 2، 6". النحو المبين أعلاه، الأسماء في غامق في ثابتة في القائمة أعلاه، أي، لديهم ليتم استدعاؤها في هذه الطريقة لأن هذه هي أسماء طلبتها البرامج النصية. يمكن تغيير الأسماء لا بخط غامق ليعكس إجراء التجربة.

3-تتبع الجسيمات

  1. تتبع جميع الجسيمات ينظر في أشرطة الفيديو المحدد باستخدام يو-المسار.
  2. فتح Matlab وإضافة الدليل يو-المسار إلى المسار باستخدام "تعيين مسار" | إضافة مع خيار المجلدات الفرعية الموجودة في القائمة. حفظ المسار بحيث في المستقبل تنفيذ أحكام الإعدام في Matlab يو-المسار في المسار. هذا الإعداد المسار يحتاج إلى القيام به مرة واحدة فقط.
  3. تغيير دليل العمل إلى الدليل الذي يحتوي على سلسلة ليتم تحليلها. استدعاء يو-المسار بكتابة في وحدة التحكم (تكميلية الشكل 10) موفيسيليكتورجي واضغط على enter. إطار اختيار الفيلم سيتم فتح (الرقم الإضافي 11 ألف).
  4. اضغط على الزر فيلم جديد وسوف تظهر نافذة فيلم الطبعة (الرقم الإضافي 11B).
  5. اضغط على إضافة قناة لاختيار الدليل بالفيديو (فيديونامي/Series1/فيديو) وملء المعلمات معلومات الفيلم. تعيين دليل الإخراج لنتائج يو-المسار إلى النتائج (فيديونامي/Series1/النتائج).
    ملاحظة: يمكن الحصول على المعلمات معلومات الفيلم من المجهر وشروط اكتساب.
  6. اضغط على إعدادات متقدمة القناة وملء المعلمات المتعلقة باقتناء. تبدو قيم المعلمات في المثال (تكميلية الشكل 11).
  7. اضغط على حفظ في نافذة الإعدادات المتقدمة القناة و حفظ في إطار فيلم الطبعة . البرنامج سوف يطلب تأكيدا لكتابة ملف يسمى movieData.mat في الدليل النتائج . تأكيد.
  8. بعد إنشاء الفيلم، اضغط على متابعة في إطار التحديد الفيلم. U-المسار سوف يسأل عن نوع الكائن يتم تحليلها. اختر واحدة-الجسيمات (تكميلية الشكل 12). سوف يظهر إطار لوحة التحكم (الشكل تكميلية 13A).
    1. حدد الخطوة الأولى الخطوة 1: الكشف عن واضغط على الإعداد. سوف تظهر نافذة الإعداد المناسب غاوسي خليط من طراز (الرقم الإضافي 13B). في المثال، يتم تعيين "قيمة ألفا للمقارنة مع الخلفية المحلية" إلى 0.001 و "المتداول-نافذة الوقت المتوسط" إلى 3 (الرقم الإضافي 13B).
    2. اضغط على تطبيق في نافذة إعدادات تركيب خليط من طراز الضبابي و تشغيلها في لوحة التحكم. مع التكوين التكميلي رقم13، يعمل الخطوة الكشف فقط. هذه الخطوة تستغرق بضع دقائق (2-5). التحقق من النتائج بالضغط على زر نتيجة الخطوة 1 (الكشف، تكميلية الشكل 14).
      ملاحظة: كما هو موضح أعلاه، يظهر الفيلم دوائر حمراء على الكشف عن الجسيمات. وإذا تبين لا دائرة حمراء، ثم هذه الخطوة لم يعمل بشكل صحيح.
  9. القيام بتحديد المسارات، هي دمج جزيئات الكشف عنها في الخطوة السابقة في المسارات التي تمتد على إطارات متعددة. هذا الخطوة 2: تتبع يو-مسار الإعدادات التي يجب أن يكون تعريف كما هو موضح في "الشكل الإضافي" 15 ألف-جيم. يتم عرض الإعدادات دالة تكلفة الخطوة 2 ربط الإطار إلى الإطار و سد الفجوة ودمج وتقسيم في المثال في الشكل الإضافي 15 باء و جيم، على التوالي.
  10. بعد تعيين المعلمات لخطوة 2، اضغط تشغيل في لوحة التحكم وتشغيل فقط الخطوة 2 (تكميلية الشكل 16).
  11. إجراء تحليل المسار، الخطوة 3. تعريف الإعدادات كما هو موضح في تكميلية الرقم 17 (اللوحة اليمنى). ثم اضغط تطبيق في الفريق لتحليل وضع الحركة، و تشغيل في "عنصر تحكم" لوحة-U-المسار. هذه الخطوة تستغرق بضع ثوان.
  12. تحقق مع زر نتيجة الخطوة 3 أن العملية قد حددت بشكل صحيح كافة المسارات. للقيام بذلك، انقر فوق إظهار مسار عدد من الإطار خيارات الفيلم ، وتحقق من تحديد الإطار حسب الإطار بكل مسار بشكل صحيح (تكميلية الشكل 18). يدوياً إضافة تعليق تلك الجسيمات التي ليست جسيمات حقيقية.
    ملاحظة: إذا لم يتم هذا التحديد اليدوي، تحديد تلقائي أضعف يمكن أن يؤديها في وقت لاحق عندما يتم حساب معامل نشر (راجع الخطوة 4).

4-حساب معاملات نشرها والتصنيف للمسارات

  1. تأكد من أن كافة البرامج النصية يتم استدعاؤها من الدليل للفيديو التي تم تحليلها (في المثال، فيديونامي/Serie1).
  2. قراءة جميع المسارات لحساب معاملات نشرها بإصدارها في Matlab وحدة الأمر: trajectories=readTrajectories(0.1)، حيث هو 0.1 الوقت بالثواني بين إطارين متتاليين (الفاصل الزمني، يظهر في لوحة فيلم المعلومات، الشكل تكميلية 11B).
  3. استبعاد المسارات المقابلة للبقع/المسارات التي تم تحديدها بشكل غير صحيح. إعطاء قائمة من المواقع لاستبعاد. على سبيل المثال، لاستثناء النقاط 4 و 5 و 28، اكتب: المسارات = ريدتراجيكتوريس (0.1 [4، 5، 28]).
  4. حساب معاملات نشر فوري لكل واحد من المسارات من هذه الخلية. وفي هذه الحالة، حساب معامل نشر لفارق زمني = 4، دعا د1-4. للقيام بذلك، قم بتشغيل في وحدة التحكم Matlab الأمر: د = كالكولاتيديفوسيون (المسارات، 113.88e-3، 0.0015، 'ألفا') حيث المسارات هي المسارات التي تم الحصول عليها في الخطوة 3, 113.88e-3 حجم بكسل الصور المكتسبة في ميكرون، و 0.0015 الحد الأعلى لمعاملات نشر جزيئات غير متحركة تقاس في/s2ميكرومتر، و 'ألفا' هو النموذج المجهزة كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: عند استخدام الكاميرا أسرع والحاجة إلى المزيد من الإطارات لحساب المعلمة نشر زيادته، مثلاً إلى 20، د = كالكولاتيديفوسيون (المسارات، 113.88e-3, 0.0015، 'ألفا'، ''، 20). معلمة السلسلة قبل 20، في المثال أعلاه، ''، هو لاحقة تضاف إلى ملفات الإخراج. يمكن استخدام هذا اللاحقة التفريق بين تحليلات مختلفة.
  5. صالح MSD مع دالة مختلفة بواسطة استدعاء الدالة كالكولاتيديفوسيون مرة أخرى مع وضع تركيب مختلفة ('حصر' أو 'الحرة'، أو 'توجيه'). في هذا المثال، 'حصر': د = كالكولاتيديفوسيون (المسارات، 113.88e-3, 0.0015، 'حصر').
  6. الحصول على نتائج مناسبة لنموذج الموجه، كما هو مبين في تكميلية الرقم 20.
  7. تحلل المسارات إلى مسارات قصيرة وطويلة. استخدم الأمر: [شورتراجيكتوريس، longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) فيها 50 هو الحد الأدنى لطول مسار تعتبر منذ فترة طويلة (في المثال الموضح) في الإطارات.
  8. دراسة مسارات قصيرة باستخدام نفس الإجراء المناسب هو موضح في "الخطوة 4، 3": د = كالكولاتيديفوسيون (شورتراجيكتوريس، 113.88e-3, 0.0015، 'توجيه'، 'قصيرة'). تحليل مسارات قصيرة والشاذ مع الأمر: د = كالكولاتيديفوسيون (شورتراجيكتوريس، 113.88e-3, 0.0015، 'ألفا'، 'قصيرة').
  9. تحليل مسارات طويلة لتصنيف نوع الحركة من خلال هذه اللحظة قياس الطيف (MSS)7. الأمر: تراجيكتوريسكلاسيفيكيشن = كلاسيفيلونجتراجيكتوريس (لونجتراجيكتوريس، 113.88e-3,0.0015، 'طويلة') يبين التحليل في الشاشة ويقوم بإنشاء ملف يسمى تراجيكتوريكلاسيفيكيشن < لاحقة >.txt في الدليل results\TrackingPackage\tracks.

5-حساب سايز الكتلة من خلال كثافة الجسيمات

ملاحظة: تأكد من أن كافة البرامج النصية يتم استدعاؤها من الدليل للفيديو التي تم تحليلها (في المثال الموضح، فيديونامي/Serie1).

  1. تحليل كثافة كل الجسيمات على طول مسار بهم. للقيام بذلك، استدعاء البرنامج النصي عن طريق كتابة في وحدة Matlab: أناليزيسبوتينتينسيتيس أن يأخذ كإدخال مسارات حسبتها يو-المسار في القسم الأول. في أبسط أشكاله، استدعاء البرنامج النصي دون أي حجة من الدليل للفيديو التي تم تحليلها (في المثال الموضح، فيديونامي/Series1) analyzeSpotIntensities(). تكوين هذا السلوك الأساسية في العديد من الطرق المختلفة بتقديم حجج للبرنامج النصي كما هو الحال في: أناليزيسبوتينتينسيتيس ('Arg1´، Value1,' Arg2´, Value2،...). الحجج المقنعة مع قيمها متغير المناظرة (' ArgN´، فالوين) وترد.
    1. (' spotRadius´، 1)
      تحليل كثافة الأسفار باستخدام سبوتراديوس مقدار 1 بكسل (بشكل افتراضي) يتوافق مع تصحيح بحجم 3 × 3 تركزت على الفور ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      ملاحظة: لتصحيح من 5 × 5 تركزت على الفور، اختر سبوتراديوس 2، وما إلى ذلك.
    2. (' onlyInitialTrajectories´، 1)
      إذا أعطيت هذه الوسيطة (true، القيمة 1)، تحليل المسارات التي تبدأ في الإطار الأول من الفيديو فقط. وهذا مفيد لتحليل الصور تحكم (بشكل افتراضي 0، كاذبة).
    3. (' trackTrajectory´, 0)
      إذا تم تعيين هذه الوسيطة إلى 0 (false)، ثم الحفاظ على إحداثيات للموقع في الإطار الأول لكل الإطارات (وهذا مفيد للبقع غير متحرك). إذا تم تعيين الوسيطة إلى 1 (بشكل افتراضي 1، صحيح)، ثم تعقب الفور على طول الفيديو التالية حساب الإحداثيات قبل يو-المسار.
    4. (' excludeTrajectories´، [4,5,28])
      تضمين رقم مسار من هذه المسارات المستبعدة في "الخطوة 4، 3" (في المثال 4، 5، 28).
    5. (' اكستيندتراجيكتوري ´، 1)
      إذا تم تعيين هذه الوسيطة إلى 1 (صواب)، ثم تحليل الكثافة في التصحيح إلى نهاية الفيديو (حتى إذا توقف المسار في وقت سابق). إحداثي المكان هو تنسيق آخر في المسار (إذا كان صحيحاً تراكتراجيكتوري) أو تنسيق الأولى في المسار (إذا كان تراكتراجيكتوري كاذبة). وهذه الحجة false (0) بشكل افتراضي.
    6. (' subtractBackground´، 1)
      إذا تم تعيين هذه المعلمة، ثم الصحيح الفلورية الخام يقاس في كل بقعة تقدير fluorescence الخلفية لهذا المكان (انظر أدناه). وهذه الحجة true (1)، بشكل افتراضي.
    7. (' meanLength´، رقم الإطار)
      إذا تم تعيين هذه المعلمة، يتم قياس الفور كثافة يعني على طول أشارت إلى. مجموعة 'مينلينجث'، 20 لقياس كثافة بقعة يعني في الإطارات 20 أولاً. إذا لم يتم تعيين الوسيطة، ثم كثافة بقعة يحسب في مسار كامل (بشكل افتراضي، طول كامل).
    8. (' showIntensityProfiles´، 1)
      تعيين هذه المعلمة 1 (بشكل افتراضي 0، كاذبة)، لرسم الشخصية كثافة على طول إطارات مختلفة فضلا عن خلفيتهم.
      ملاحظة: هذه المؤامرات مفيدة جداً لتحديد فوتوبليتشينج كما هو موضح في تكميلية الرقم 21. لكل مسار، يحلل الروتين تلقائياً إذا كان من الممكن أن هناك فوتوبليتشينج. يتم ذلك عن طريق مقارنة قيم الكثافة مع تي الطالب في الإطارات ن الأول والأخير على طول المسار. بشكل افتراضي، N هو 10، ولكن يمكن تعديل هذه القيمة من خلال الوسيطة ' Nbleach´.
    9. (' backgroundMethod´، قيمة)
      تعيين هذه المعلمة إلى تحديد الخلفية من كل بقعة. يمكن أن يتم ذلك بطرق عدة، وواحد لاستخدامه يمكن أن يكون المحدد تغيير "قيمة":
      1. (' backgroundMethod´, 0)
        استخدم هذه القيمة لتحديد الخلفية للفيديو كله يدوياً. تسمح بتحديد 8 نقاط في الإطار الأول من الفيديو. ويتم تحليل تصحيحًا حول هذه النقاط على طول الفيديو كله، وكانتيل 95% من جميع هذه الكثافات يتم اختيارها ككثافة الخلفية لجميع النقاط.
      2. (' backgroundMethod´، 1)
        استخدم هذه القيمة لتحديد خلفية لكل إطار يدوياً. اختر 8 نقاط لكل بقعة وكل إطار. هذه مهمة تستغرق وقتاً طويلاً ولكن فإنه يعطي قدرا كبيرا من التحكم للمستخدم. كانتيل 95% من الشدة في هذه البقع يتم اختيارها ككثافة الخلفية لهذه البقعة في هذا الإطار.
      3. (' backgroundMethod´، 2)
        استخدام تقدر هذه القيمة حساب الخلفية لكل نقطة من 8 نقاط تقع في دائرة حول المكان مع دائرة نصف قطرها يسيطر عليها الحجة ' backgroundRadius´ (بشكل افتراضي، 4 * سبوتراديوس).
      4. (' backgroundMethod´، 3)
        استخدم هذه القيمة لحساب الخلفية لكل إطار بواسطة تحديد الخلية الأولى في الفيديو ثم تحليل كثافة الخلية في كل إطار (تكميلية الشكل 22).
        ملاحظة: الخلفية يتم اختيارها كقيمة الرمادي في كانتيل المعطاة لهذا التوزيع (حسب الافتراضي 0.5 (= 50%)، على الرغم من أن هذه المعلمة يمكن السيطرة عليها من خلال الوسيطة ' backgroundPercentile´، هذا يمكن تعيين القيمة أعلى، على سبيل المثال، 0.9 (= 90%) إذا كان يريد معظم الخلية باعتبار الخلفية. للمساعدة في تحديد الخلية، تشير إلى الذي هو قيمة الخلفية الحد الأقصى المتوقع على طول الإطارات باستخدام الوسيطة ' maxBackground´ (على سبيل المثال، في جميع أشرطة الفيديو تم تحليلها، القيمة الخلفية عادة لم يتجاوز 6000)13. بشكل افتراضي، يتم تعيين هذا الخيار إلى 0، مما يعني أن هذه التعليمات لا يستخدم بشكل افتراضي. انظر ما هو الكشف عن الخلية ومنطقة مختارة لتقدير الخلفية عن طريق تعيين الوسيطة ' showImages´ إلى 1 (وقف التنفيذ في أي وقت عن طريق الضغط على CTRL-C).
  2. جمع المعلومات التي نشرها وكثافة لجميع المسارات المحسوبة في الخطوات 4 و 5-1، على التوالي، باستخدام gatherDiffusion.AndIntensity (). جمع فقط معلومات نشرها وكثافة لمسارات قصيرة. للقيام بذلك، استخدم لاحقات المستخدمة في "الخطوة 4، 7"، واكتب: جاثيرديفوسيوناندينتينسيتي ('Short´) حيث' Short´ هو لاحقة المستخدمة في "الخطوة 4، 7".
  3. جمع "مقياس الطيف لحظة" وكتابة informationby الكثافة: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') حيث 'طويلة' اللاحقة يستخدم في "الخطوة 4، 7". ويرد موجز لجميع الملفات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول في الشكل 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يسمح استخدام هذا البروتوكول التتبع الآلي من الجسيمات التي اكتشفت في الأسفار مجهرية الأفلام وتحليل الخصائص الدينامية ل. في البداية، هي transfected الخلايا مع البروتين إلى جانب فلوريسسينتلي تعقبه. يعرض المستوى المناسب من مستقبلات على سطح الخلية يسمح SPT يتم الحصول عليها بالخلية الفرز (الشكل 1). ويتم تحليل الخلايا المحددة بالفحص المجهري TIRF الذي يقوم بإنشاء ملفات الفيديو في تنسيق التي يمكن دراستها مع الأدوات الموصوفة في هذا البروتوكول (تكميلية الفيديو 1...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصف الأسلوب السهل للقيام حتى بدون وجود أي خبرة سابقة في العمل مع Matlab. بيد أن الروتين Matlab تتطلب بالغة الدقة مع تسمية الأوامر المختلفة وإضفاء الطابع المحلي على المجلدات المختلفة المستخدمة من قبل البرنامج. في التعقب التحليل الروتيني (الخطوة 3)، يمكن تعديل معلمات متعددة. نافذة "إعداد خليط ضبابي النموذج المناسب" (الخطوة 3.8) يتحكم كيف يو-المسار سيتم الكشف عن الجسيمات واحد على الفيديو. ويتم ذلك بتركيب نموذج غاوسي خليط كما هو موضح في3. إحدى المعلمات الرئيسية لتركيب هذا تعريف عامل تصفية للمساعدة في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

نحن نشكر مانزو كارلو وماريا غارسيا براجو للتعليمات البرمجية الخاصة بهم في التعليمات ومصدر لتحليل معامل نشر. بتأييد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من وزارة العلوم الإسبانية، والابتكار والجامعات (القوات المسلحة السودانية عام 2017-82940-R) وبرنامج ريتيكس معهد الصحة "كارلوس الثالث" (RD12/0009/009 و RD16/0012/0006؛ RIER). تدريبيا والشركة معتمدة من قبل برنامج كومفوتورو للسفن العامة مؤسسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا Jurkat البشريةATCCCRL-10915خط الخلايا التائية البشرية. يمكن تحليل أي نوع آخر من الخلايا باستخدام هذا البرنامج
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFPClontech632469يمكن اتباع بروتينات الفلورسنت المختلفة وتحليلها باستخدام هذا الروتيني
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad نحن نستخدم 280 فولت ، 975 مللي فهرنهايت ، لخلايا Jurkat. استخدم طريقة التعداء بشكل أفضل في يديك.
Cytomics FC 500 مقياس التدفق الخلوي Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter بيكمان كولتراعتمادا على مستوى التعدي ، قد لا تكون هناك حاجة لفرز الخلايا. يمكنك أيضا استخدام الخلايا ذات التعبير المستقر عن مستويات كافية من المستقبل محل الاهتمام.
داكو كيفيكيتداكوCytomationK0078تستخدم لقياس عدد المستقبلات في سطح الخلية.
أطباق زجاجية ذات قاع صغيرشركة MatTekشركة P35G-1.5-10-C
فيبرونيكتين بشري من البلازماSigma-AldrichF0895
مؤتلف بشري CXCL12PeproTech300928A
مقلوب Leica AM TIRFكاميرا Leica
EM-CCDAndor DU 885-CSO- # 10-VP
MATLABبرنامج MathWorks و Natick و MA
U-Track2Danuser Laboratory
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
برنامج u-Track2أداة Matlab.  للتثبيت ، قم بتنزيل .zip الملف من صفحة الويب (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) وقم بإلغاء ضغط الملف في دليل من اختيارك
GraphPadPrism GraphPad
برنامج

المراجع

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601(2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تتبع الجزيء المنفردتتبع الجسيماتتحليل الانتشارتحليل حجم العنقودمنطقة الاهتمامتصميم القناعFiji ImageJروتينات MATLAB
معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.