Method Article

معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور

DOI:

10.3791/59314

⸱

April 9th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا للجسيمات واحدة تتبع تحليل الصور التي تتيح التقييم الكمي لنشر معاملات، أنواع الحركة والكتلة أحجام الجسيمات واحد الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري الأسفار.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجسيمات التي تتبع في تسلسل فيديو والتحليل اللاحق لمساراتها في الوقت الحاضر بعملية مشتركة في العديد من الدراسات البيولوجية. تحليل مستقبلات غشاء الخلية باستخدام مجموعات كنموذج، ونحن في الوقت الحاضر بروتوكول مفصل لهذه المهمة تحليل الصور باستخدام فيجي (إيماجيج) وإجراءات Matlab ل: 1) تحديد المناطق ذات الاهتمام وتصميم أقنعة تتكيف مع هذه المناطق؛ 2) تتبع الجسيمات في الأسفار مجهرية أشرطة الفيديو؛ 3) تحليل خصائص انتشار وشدة من المسارات المحددة. التحليل الكمي لمعاملات نشر، أنواع الحركة، وحجم الكتلة التي حصلت عليها مجهرية الأسفار ومعالجة الصور ويوفر أداة قيمة لتحديد موضوعيا ديناميات الجسيمات والمترتبة على تعديل الظروف البيئية. في هذا المقال نقدم بروتوكولات مفصلة لتحليل هذه الميزات. الطريقة الموضحة هنا ليس فقط يسمح الكشف عن تتبع جزيء واحد، ولكن أيضا أتمتة تقدير معلمات الانتشار الأفقي في غشاء الخلية ويصنف نوع مسار ويسمح تحليل كامل وبالتالي التغلب على الصعوبات في قياس حجم بقعة على مساره الكامل في غشاء الخلية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من بلير الدهن في حركة مستمرة بسبب نشر الحرارية. ديناميتها ضرورية لتنظيم استجابات الخلية، كما جزيئية تسمح تشكيل المجمعات التي تختلف في الحجم من مونومرات إلى ليغومرات وتؤثر في استقرار مما يشير إلى المجمعات. وهكذا توضيح آليات السيطرة على ديناميات البروتين تحديا جديداً في بيولوجيا الخلايا، اللازمة لفهم سبل توصيل الإشارات وتحديد مهام الخلية غير متوقعة.

وقد وضعت بعض وسائل بصرية لدراسة هذه التفاعلات في معيشة الخلايا1. ومن بين هذه، يسمح الانعكاس الداخلي الكلي مجهرية الفلورية (TIRF)، وضعت في أوائل الثمانينات، دراسة التفاعلات الجزيئية على أو بالقرب جداً من غشاء الخلية2. درا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد العينات البيولوجية

  1. تنمو خلايا جوركات في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10 ٪ السفح، نابير ولام الجلوتامين (ربمي كاملة). الخلايا جوركات اليكتروبوراتي (20 × 106 خلايا/400 ميليلتر من 1640 RPMI مع السفح 10 ٪) مع ناقل مستقبلات chemokine أحادي بروتينات فلورية خضراء المسمى (CXCR4-أكجفب، 20 ميكروغرام) للسماح بالكشف عنها باستخدام مجهر الأسفار.
    ملاحظة: من الممكن استخدام أحادي البروتينات الفلورية الأخرى مثل مشري، مسكارليت، إلخ.
  2. تحليل ح 24 بعد تعداء الخلايا في سيتوميتير تدفق لتحديد جدوى الخلية والتعبير CXCR4-أكجفب.
  3. حدد الخلايا معربا عن مستويات منخفضة من CXCR4-أكجفب بالخلية فرز الخلايا إيجابيةانخفاض التجار....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح استخدام هذا البروتوكول التتبع الآلي من الجسيمات التي اكتشفت في الأسفار مجهرية الأفلام وتحليل الخصائص الدينامية ل. في البداية، هي transfected الخلايا مع البروتين إلى جانب فلوريسسينتلي تعقبه. يعرض المستوى المناسب من مستقبلات على سطح الخلية يسمح SPT يتم الحصول عليها بالخلية الفرز (الشكل 1). ويتم تحليل الخلايا المحددة بالفحص المجهري TIRF الذي يقوم بإنشاء ملفات الفيديو في تنسيق التي يمكن دراستها مع الأدوات الموصوفة في هذا البروتوكول (تكميلية الفيديو 1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصف الأسلوب السهل للقيام حتى بدون وجود أي خبرة سابقة في العمل مع Matlab. بيد أن الروتين Matlab تتطلب بالغة الدقة مع تسمية الأوامر المختلفة وإضفاء الطابع المحلي على المجلدات المختلفة المستخدمة من قبل البرنامج. في التعقب التحليل الروتيني (الخطوة 3)، يمكن تعديل معلمات متعددة. نافذة "إعداد خليط ضبابي النموذج المناسب" (الخطوة 3.8) يتحكم كيف يو-المسار سيتم الكشف عن الجسيمات واحد على الفيديو. ويتم ذلك بتركيب نموذج غاوسي خليط كما هو موضح في3. إحدى المعلمات الرئيسية لتركيب هذا تعريف عامل تصفية للمساعدة في .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نشكر مانزو كارلو وماريا غارسيا براجو للتعليمات البرمجية الخاصة بهم في التعليمات ومصدر لتحليل معامل نشر. بتأييد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من وزارة العلوم الإسبانية، والابتكار والجامعات (القوات المسلحة السودانية عام 2017-82940-R) وبرنامج ريتيكس معهد الصحة "كارلوس الثالث" (RD12/0009/009 و RD16/0012/0006؛ RIER). تدريبيا والشركة معتمدة من قبل برنامج كومفوتورو للسفن العامة مؤسسة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
خلايا Jurkat البشريةATCCCRL-10915خط الخلايا التائية البشرية. يمكن تحليل أي نوع آخر من الخلايا باستخدام هذا البرنامج
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFPClontech632469يمكن اتباع بروتينات الفلورسنت المختلفة وتحليلها باستخدام هذا الروتيني
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad نحن نستخدم 280 فولت ، 975 مللي فهرنهايت ، لخلايا Jurkat. استخدم طريقة التعداء بشكل أفضل في يديك.
Cytomics FC 500 مقياس التدفق الخلوي Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter بيكمان كولتراعتمادا على مستوى التعدي ، قد لا تكون هناك حاجة لفرز الخلايا. يمكنك أيضا استخدام الخلايا ذات التعبير المستقر عن مستويات كافية من المستقبل محل الاهتمام.
داكو كيفيكيتداكوCytomationK0078تستخدم لقياس عدد المستقبلات في سطح الخلية.
أطباق زجاجية ذات قاع صغيرشركة MatTekشركة P35G-1.5-10-C
فيبرونيكتين بشري من البلازماSigma-AldrichF0895
مؤتلف بشري CXCL12PeproTech300928A
مقلوب Leica AM TIRFكاميرا Leica
EM-CCDAndor DU 885-CSO- # 10-VP
MATLABبرنامج MathWorks و Natick و MA
U-Track2Danuser Laboratory
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
برنامج u-Track2أداة Matlab.  للتثبيت ، قم بتنزيل .zip الملف من صفحة الويب (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) وقم بإلغاء ضغط الملف في دليل من اختيارك
GraphPadPrism GraphPad
برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Ce....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Image ProcessingFluorescence MicroscopySingle Molecule TrackingParticle TrackingDiffusion AnalysisCluster Size AnalysisRegion Of InterestMask DesignFiji ImageJMATLAB Routines

Related Articles