طريقة آلية لإجراء فحص النواة الدقيقة في المختبر باستخدام قياس تدفق تدفق التصوير متعدد الأطياف

وقد تم تطوير البروتوكولات التي تستخدم كل من الفحص المجهري وقياس التدفق والنسخ الضوئي ويتم التحقق منها وتستخدم بشكل روتيني لأداء اختبار MN في المختبر^6و7و⁸و^{9و10، 11،12،13،14}. يستفيد الفحص المجهري من القدرة على التأكيد بصرياً أن MN مشروعة ولكنها تستغرق وقتاً طويلاً وعرضة للتباين بين الهدافين¹⁵. لمعالجة هذا، تم تطوير أساليب الفحص المجهري الآلي لمسح الشرائح والتقاط الصور من النوى وMN^{16،17،18،19،}ولكن لا يمكن تصور السيتوبلازم، مما يجعلها من الصعب تحديد ما إذا كانت MN مرتبطة بالفعل بخلية معينة. وعلاوة على ذلك، تواجه هذه الأساليب صعوبات في تحديد الخلايا المتعددة النوى (POLY) (بما في ذلك الخلايا الثلاثية والرباعية) اللازمة لحساب السمية الخلوية عند استخدام Cyt-B⁹. طرق قياس التدفق الخلوي التي تم تطويرها لأداء التنظير MN توظيف الفلورة، فضلا عن كثافة التشتت إلى الأمام والجانب لتحديد السكان من كل من النوى وMN التي تم تحريرها من الخلية بعد lysis^{20،21 ،22}. وهذا يسمح بالحصول على البيانات من عدة آلاف من الخلايا في بضع دقائق ويسمح بالتحليل الآلي²³؛ ومع ذلك، فإن عدم القدرة على تصور الخلايا يجعل من المستحيل التأكد من أن الأحداث المسجلة حقيقية. بالإضافة إلى ذلك، فإن التسين في غشاء الخلية يمنع استخدام Cyt-B وكذلك خلق تعليق يحتوي على حطام آخر مثل المجاميع الكروموسومية أو الأجسام المبرمجة وليس هناك طريقة للتمييز بين هذه من MN²⁴.

وفي ضوء هذه القيود، يعتبر قياس تدفق التصوير المتعدد الأطياف (MIFC) نظاماً مثالياً لإجراء الفحص MN لأنه يجمع بين الصور الفلورية عالية الدقة للتنظير المجهري والمتانة الإحصائية وسرعة قياس التدفق الدقيق التقليدي. في MIFC، يتم إدخال جميع الخلايا في نظام fluidics ومن ثم تركز هيدروديناميا في وسط cuvette خلية تدفق. يتم إنجاز الإضاءة المتعامدة لجميع الخلايا من خلال استخدام الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) من الحقل الساطع، وهو ليزر مبعثر جانبي وليزر فلورسنت واحد (على الأقل). يتم التقاط الفوتونات الفلورية من قبل واحد من ثلاثة (20x أو 40x أو 60x) العدسات الموضوعية ذات الفتحة الرقمية العالية ثم تمر من خلال عنصر التحلل الطيفي. ثم يتم تركيز الفوتونات على كاميرا جهاز المقترنة بالشحن (CCD) للحصول على صور عالية الدقة لجميع الخلايا التي تمر عبر خلية التدفق. لتجنب عدم الوضوح أو الشرائط، تعمل اتفاقية مكافحة التصحر في وضع تكامل تأخير الوقت (TDI) الذي يتتبع الكائنات عن طريق نقل محتوى بكسل من صف إلى صف أسفل اتفاقية مكافحة التصحر في تزامن مع سرعة الخلية في التدفق. ثم يتم جمع معلومات البكسل من الصف الأخير من وحدات البكسل. يسمح التصوير TDI جنبا إلى جنب مع التحلل الطيفي ما يصل إلى 12 صورة (2 BF، 10 الفلورسنت) ليتم التقاطها في وقت واحد من جميع الخلايا التي تمر عبر خلية التدفق. يتم تخزين جميع الصور التي تم التقاطها في ملفات بيانات خاصة بالعين، مما يسمح بإجراء التحليل في أي وقت باستخدام برنامج تحليل البيانات MIFC. وأخيرا، تحتفظ ملفات البيانات بالصلة بين الصور الخلوية والنقاط على جميع المؤامرات ثنائية المتغيرات. وهذا يعني أنه يمكن تسليط الضوء على أي نقطة على مؤامرة ثنائية المتغيرات التقليدية وسيتم عرض الصور BF والفلورسنت المقابلة^{لها 25}.

في الآونة الأخيرة، تم تطوير الأساليب القائمة على MIFC لإجراء اختبار MN لكل من قياس الدوسيد الإشعاعي الفرز^{26،27،28،29،30،31} والوراثية السموم^32،33 اختبار. وقد أثبت هذا العمل أن الصور الخلوية للنوى الرئيسية، MN والسيتوبلازم يمكن تصويرها مع الإنتاجية أعلى من غيرها من الطرق²⁶. يمكن تحديد جميع أنواع الخلايا المطلوبة للتحليل، بما في ذلك خلايا MONO، وBNCs (مع وبلا MN)، وخلايا POLY، تلقائيًا في برنامج تحليل البيانات MIFC، ويتم تنفيذ معايير التهديف التي وضعتها Fenech وآخرون من خلال استخدام خوارزميات رياضية مختلفة^6،34. وأظهرت نتائج قياس الجرعات الأحيائية أن منحنيات معايرة استجابة الجرعة كانت مماثلة من حيث الحجم لتلك التي تم الحصول عليها من الأساليب الآلية الأخرى في المؤلفات عند التحديد الكمي لمعدل MN لكل BNC²⁹. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الأعمال الأخيرة في علم السموم أن الصور من خلايا MONO، BNCs (مع وبدون MN) وخلايا POLY يمكن التقاطها تلقائيا، وتحديدها، وتصنيفها وتعدادها باستخدام MIFC. ومكّن تحليل البروتوكول والبيانات من حساب السمية الخلوية والسمية الجينية بعد تعريض خلاياTK6 لعدة خلايا من الكلاستوجين اتّباب 32 .

يصف البروتوكول المعروض في هذه الورقة طريقة لإجراء الاختبار MN في المختبر باستخدام MIFC. تتطلب تقنية معالجة العينة المستخدمة في هذا العمل أقل من 2 ساعة لمعالجة عينة واحدة وسهلة الأداء نسبياً بالمقارنة مع أساليب أخرى. تحليل البيانات في برنامج تحليل MIFC معقد، ولكن يمكن إجراء إنشاء قالب التحليل في غضون ساعات قليلة بعد الخطوات المبينة في هذه الورقة. وعلاوة على ذلك، بمجرد إنشاء القالب، يمكن تطبيقه تلقائيا على جميع البيانات التي تم جمعها دون أي عمل آخر. ويحدد البروتوكول جميع الخطوات اللازمة لتعريض خلايا TK6 للكلاستوجينات والأنوجينات، ويصف كيفية زراعة الخلايا ومعالجتها ووصمها، ويوضح كيفية الحصول على صور عالية الدقة باستخدام MIFC. وعلاوة على ذلك، توضح هذه الورقة أفضل الممارسات الحالية لتحليل البيانات في برامج MIFC لتحديد وتسجيل خلايا MONO وBNCs وخلايا POLY تلقائياً لأغراض حساب السمية الخلوية والسمية الجينية.

1- إعداد وسائط الثقافة وزراعة خلايا المعارف التقليدية 6

ملاحظة: بعض المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول سامة. استنشاق أو ابتلاع أو الاتصال بالبشرة مع السيتوتشاليسين B يمكن أن تكون قاتلة. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة بما في ذلك معطف المختبر واثنين من أزواج من قفازات النتريل. غسل اليدين جيدا بعد التعامل معها. الفورماين / الفورمالديهايد هو سام إذا استنشق أو ابتلع؛ هو مزعج ة للعيون، الجهاز التنفسي، والجلد. وقد يسبب التحسس عن طريق الاستنشاق أو ملامسة الجلد. هناك خطر من ضرر خطير للعيون. وهو مسرطن محتمل.

1. إعداد 565 مل من 1X RPMI الثقافة المتوسطة. إضافة 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100X)، 5 مل من بيروفات الصوديوم (100 مل)، 5 مل من البنسلين-ستريبتوميسين-غلوتامين (100x)، و 50 مل من المصل البقري الجنيني (FBS) إلى زجاجة 500 مل من 1x RPMI 1640 المتوسطة. إعداد المتوسطة في خزانة السلامة البيولوجية وتخزينها في 2-8 درجة مئوية. قم بتسخين المتوسط إلى 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى خلايا TK6 (انظر جدولالمواد).
2. ذوبان 1 مل من خلايا TK6 (المخزنة في -80 درجة مئوية في DMSO) في 10 مل من المتوسطة. طرد مركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 8 دقائق واستنشاق supernatant. نقل الخلايا إلى 50 مل من وسائل الإعلام وحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO_2. ويختلف الوقت المضاعف لخلايا TK6 من حوالي 12-18 ساعة، وسيلزم عدد قليل (3 أو 4) مقاطع للخلايا للوصول إلى أقصى معدل انتشار لها (انظر جدولالمواد).
3. ثقافة 100 مل من الخلايا إلى تركيز ~ 7-8 × 10⁵ خلايا / مل.

2- إعداد الكلاتوجينات و/أو الأنيوجينات والسيتوتشاليسين باء

1. إعداد تركيزات المخزون المناسبة من الكلاتوجينات وaneugens المطلوب. على سبيل المثال، بالنسبة للميتوميسين C، قم بإذابة زجاجة كاملة 2 ملغ في 10 مل من المياه المعقمة لتحقيق تركيز المخزون النهائي من 200 ميكروغرام /مل. يمكن تخزين ميتوميسين C عند 4 درجة مئوية لمدة ثلاثة أشهر (انظر جدولالمواد).
2. في يوم التجربة، قم بإعداد تخفيف اتّسط من المواد الكيميائية المطلوبة التي تكون أعلى بمقدار 10 أضعاف أو 100 ضعف من تركيزات التعرض المطلوبة إذا تمييعها في الماء المعقمة أو DMSO، على التوالي.
3. بالنسبة لـ Mitomycin C، قم بإعداد 3 مل من تمييع المياه المعقمة من 0.5 و1.0 و2.0 و3.0 و4.0 و5.0 ميكروغرام/مل. لكولشيسين، إعداد 3 مل تخفيف في الماء المعقمة من 0.05، 0.1، 0.2، 0.3، 0.4، و 0.5 ميكروغرام / مل. وأخيرا، لمانيتول، إعداد 3 تخفيف مل في الماء المعقم من 5، 10، 20، 30، 40، و 50 ملغ / مل.
4. إعداد تركيز مخزون 200 ميكروغرام /مل من السيتوتشاليسين B عن طريق حل زجاجة 5 ملغ في 25 مل من DMSO. يمكن تخزين السيتوتشاليسين B عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.

3- تعرض الخلايا للكلورات و/أو الأنيوجينات

1. إضافة 1 مل من المواد الكيميائية المطلوبة (على سبيل المثال ميتوميسين C) إلى 9 مل من الخلايا في ~ 7-8x10⁵ خلايا / مل في قارورة T25. لعينات التحكم، إضافة 1 مل من الماء المعقم. ضع القوارير في حاضنة CO₂ 37 درجة مئوية و5% لمدة 3 ساعة.
   ملاحظة: إذا تم تخفيف المواد الكيميائية في DMSO، أضف فقط 100 ميكرولتر من المادة الكيميائية إلى كل قارورة وأضف 100 ميكرولتر من DMSO إلى الضوابط. يجب أن تحتوي كل قارورة على 9.900 مل من الخلايا.
2. بعد 3 ساعة، إزالة القوارير من الحاضنة ونقل الخلايا إلى أنابيب البولي بروبلين 15 مل. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 8 دقائق، يستنشق supernatant ونقل الخلايا إلى قوارير T25 جديدة تحتوي على ما مجموعه 10 مل من وسط الثقافة الطازجة. إضافة 150 درجة مئوية من تركيز المخزون (200 ميكروغرام/مل) من السيتوتشاليسين B إلى كل قارورة لتحقيق تركيز نهائي قدره 3 ميكروغرام/مل.
3. إعادة القوارير إلى حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ لفترة الانتعاش يساوي 1.5-2.0 مضاعفة مرات، على النحو الموصى به في المبادئ التوجيهية لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي⁹. بالنسبة لخلايا TK6 المستخدمة في هذا العمل، كان وقت الاسترداد 24 ساعة.
   ملاحظة: كان الوقت المضاعف لخلايا TK6 المستخدمة هنا 15 ساعة وتم استخدام وقت استرداد قدره 24 ساعة (1.6 مرات مضاعفة). وسيؤدي الانتعاش مرات أقل من 1.5 مرات مضاعفة إلى الحد من الانتشار في العينات المعرضة لجرعات أعلى تؤثر على عدد من الناقلات الوطنية. انحراف حسابات السمية الخلوية.

4- إعداد المخازن المؤقتة لتثبيت محتوى الحمض النووي ووسمه (انظر جدول المواد)

1. إعداد 75 مل من كلوريد البوتاسيوم (KCl) عن طريق إضافة 2.79 غرام إلى 500 مل من المياه النقية جدا. حرّك الحل لمدّة 5 دقائق باستخدام النمام المغناطيسي وفلتر معقم من خلال فلتر بقوة 200 متر. يمكن تخزين محلول KCl 75 mM عند 4 درجة مئوية لعدة أشهر.
2. إعداد كمية كافية من 4٪ رسمي للتجربة، وتوقع أن ما مجموعه 2.1 مل يجب أن تضاف إلى كل عينة. على سبيل المثال، لإعداد 10 مل من 4٪ فورمالين، إضافة 4 مل من 10٪ رصيد رسمي إلى 6 مل من 1X دولبيكو الفوسفات المخزنة محلول ملحي دون كاليفورنيا^{2 +} أو ملغ^{2 +} (PBS). يمكن تخزين هذا 4٪ فورمالين في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.
3. إعداد 510 مل من العازلة غسل (2٪ FBS في 1X PBS) عن طريق إضافة 10 مل من FBS إلى زجاجة 500 مل من PBS 1X.
4. إعداد 10 مل من تركيز 100 ميكروغرام/مل من Hoechst 33342 بإضافة 100 ميكرولتر من تركيز المخزون (1 ملغم/مل) إلى 9900 ميكرولتر من 1X PBS. يمكن تخزين حل Hoechst 33342 عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لعدة أشهر.

5. معالجة العينة: تورم نقص التوتر، والتثبيت، عد الخلايا ووضع العلامات محتوى الحمض النووي

1. في نهاية فترة الانتعاش، وإزالة جميع القوارير من الحاضنة ونقل جميع العينات إلى أنابيب البولي بروبلين 15 مل. الطرد المركزي جميع العينات في 200 × ز لمدة 8 دقائق.
2. يستنشق supernatant، وإعادة تعليق الخلايا وإضافة 5 مل من 75 مل ككل.
3. إضافة 2 مل من 4٪ شكلي في كل عينة، ومزيج بلطف عن طريق الانعكاس ثلاث مرات وحضانة في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تعمل هذه الخطوة بمثابة "تثبيت لينة".
4. الطرد المركزي جميع العينات في 200 × ز لمدة 8 دقائق. هذه الخطوة بمثابة "تثبيت الثابت".
5. إضافة 5 مل من العازلة غسل والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 8 دقائق.
6. نقل جميع العينات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
7. إجراء عدد خلايا على كل عينة لتحديد عدد الخلايا لكل عينة. وسوف تكون العينات مركزة للغاية بحيث يتم الحاجة إلى تخفيف 1:100 في 1X PBS (10 ميكرولتر من العينة في 990 ميكرولتر من PBS) للحصول على عدد دقيق.
   ملاحظة: في هذه المرحلة من الأفضل إجراء عمليات عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومات. إضافة KCl يعطي السيتوبلازم مظهر شفاف، مما يجعل من الصعب على عدادات الخلية الآلي التعرف عليها. أيضا، العدادات الآلية لديها صعوبة في تسجيل الخلايا متعددة النوى بسبب حجمها.
8. إذا لم يتم تشغيل العينات على MIFC على الفور، يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لعدة أيام. عندما تكون جاهزة لتشغيل العينات، إضافة 5 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل لكل 1x10⁶ خلايا / مل لكل عينة. كما يضاف 10 ميكرولتر من 500 ميكروغرام/مل من RNase لكل 100 ميكرولتر من العينة لتركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام/مل. حضانة العينات في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة.
9. أجهزة الطرد المركزي الدقيقة جميع العينات في 200 × ز لمدة 8 دقائق واستخدام ماصة لإزالة supernatant ترك ~ 30 درجة مئوية. استخدام ماصة لإعادة تعليق جميع العينات قبل تشغيل على MIFC ضمان عدم وجود فقاعات في الأنبوب. لا دوامة.

6. بدء ومعايرة MIFC

1. تأكد من غمد، نظام معايرة الكاشف، debubbler، المطهر والتعقيم حاويات ممتلئة وخزان النفايات فارغة. قم بتشغيل النظام وانقر نقرًا مزدوجًا على رمز برنامج MIFC. انقر فوق الزر بدء التشغيل وتأكد من تحديد خانة الاختيار بدء كافة المعايرة والاختبارات. وهذا سوف مسح النظام، غمد الحمل والكواشف معايرة النظام، ومعايرة النظام (انظر جدولالمواد).

7. تشغيل عينات على MIFC

ملاحظة: يفترض هذا المقطع استخدام MIFC كاميرا 2. إذا كنت تستخدم كاميرا MIFC 1، يرجى الاطلاع على الملحق 1 - البروتوكول الكامل، القسم 7 لإنشاء قطع الأراضي أثناء الاقتناء

1. إطلاق برنامج الحصول على بيانات MIFC (انظر جدول المواد). ويبين الشكل 1 إعدادات الأداة. تشغيل الليزر 405 نانومتر وتعيين قوة الليزر إلى10 mW (A). تعطيل جميع أشعة الليزر الأخرى (بما في ذلك SSC) وتعيين BF إلى القنوات 1 و 9 (B). تأكد من تعيين شريط تمرير التكبير إلى60x (C)، يتم تحديد وضع الحساسية العالية (D)، وأن القنوات 1 و7 و9 فقط تظهر في معرض الصور.
2. انقر على رمز مبعثر. حدد كافة التجمعات وحدد المنطقة M01 على المحور س ونسبة العرض إلى الارتفاع M01 على المحور ص. انقر على رمز منطقة مربع ورسم منطقة حول الخلايا المفردة. اسم هذه المنطقة خلايا واحدة. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وحدد المناطق. قم بتمييز منطقة الخلايا المفردة وتغيير إحداثيات x إلى 100 و900 وتغيير إحداثيات y إلى 0.75 و 1 (الشكل1I).
3. انقر على رمز مبعثر. حدد خلايا مفردة كمجموعة الأصل، وحدد تدرج RMS M01 على المحور س، وتدرج RMS M07 على المحور ص. انقر على رمز منطقة مربع ورسم منطقة حول غالبية الخلايا. اسم هذه المنطقة الخلايا المركزة. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وحدد المناطق. تسليط الضوء على منطقة الخلايا المركزة وتغيير إحداثيات س إلى 55 و 75 وتغيير إحداثيات y إلى 9.5 و 20 (الشكل1J).
4. انقر على أيقونة الرسم البياني. حدد مجموعة خلايا المركزة وحدد كثافة M07 كميزة. انقر على أيقونة المنطقة الخطية ورسم منطقة عبر الذروة الرئيسية في الرسم البياني. اسم هذه المنطقة الحمض النووي إيجابية. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وحدد المناطق. تسليط الضوء على المنطقة الإيجابية للحمض النووي وتغيير الإحداثيات إلى 2 × 10⁵ و 2 × 10⁶. قد يكون من الضروري تعديل النطاق اعتمادا على ذروة الكثافة على الرسم البياني (الشكل1K).
5. تعيين معلمات الاكتساب (الشكل1E). حدد اسم الملف والمجلد الوجهة، وقم بتغيير عدد الأحداث إلى 20,000، وحدد عدد التجمعات الإيجابية للحمض النووي.
6. انقر فوق تحميل (الشكل1F)ووضع عينة التحكم في MIFC. انقر فوق الزر اكتساب لجمع البيانات (الشكل1G). بمجرد اكتمال عملية الشراء، انقر فوق الزر إرجاع لإرجاع العينة (الشكل1H). إزالة أنبوب عينة من الصك. كرر هذه العملية لكافة العينات المتبقية في التجربة.

8. فتح ملف بيانات في IDEAS

1. إطلاق حزمة برامج تحليل MIFC (انظر جدولالمواد). انقر على بدء التحليل لبدء تشغيل "فتح ملفمعالج". حدد ملف بيانات عن طريق الاستعراض إلى ملف الصورة الخام المطلوب (.rif). انقر فوق الزر فتح ثم انقر فوق التالي.
2. بما أن هذا هو تحليل لون واحد، التعويض ليس ضرورياً لذلك انقر فوق التالي لتجاوز خطوة التعويض. في هذه المرحلة لا يوجد قالب تحليل لتطبيق، لذلك انقر فوق التالي مرة أخرى. إذا تم تنزيل قالب التحليل من المواد التكميلية، فحدده الآن. تعمل هذه القوالب فقط مع كاميرا MIFC 2 مع BF تعيين إلى القنوات 1 و 9 والصور النووية في القناة 7 أثناء الاستحواذ.
3. بشكل افتراضي، يتم إنشاء أسماء الملفات .cif و .daf تلقائياً لمطابقة .rif. لا ينصح بتغيير أسماء .cif و .daf. انقر فوق التالي. تعيين خصائص عرض الصورة عن طريق تحديد 01 و 07. انقر فوق التالي. لا يوجد معالج لهذا التطبيق، لذا انقر فوق إنهاء. من المهم جداً حفظ ملف تحليل البيانات (.daf) ونموذج التحليل (.ast) في كثير من الأحيان أثناء الأقسام 9-14 لتجنب فقدان التقدم.

9. إنشاء أقنعة وميزات لتحديد BNCs

1. انقر على أيقونة خصائص معرض الصور (رمز أزرق/أبيض). في علامة التبويب خصائص العرض انقر فوق تعيين النطاق إلى بيانات البكسل ثم تغيير اللون إلى الأصفر. انقر فوق موافق. صور Hoechst الآن أسهل لعرضها على خلفية سوداء.
2. إنشاء مؤامرة الخلايا غير المبرمجة.
   1. انقر على علامة التبويب تحليل، ثم انقر على أقنعة. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. ضمن وظيفة اختيار عتبة،تحت قناع اختيار M07 وتعيين نسبة الكثافة إلى 50. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. انقر فوق إغلاق.
   2. انقر على علامة التبويب تحليل، وانقر على الميزات، ثم انقر فوق جديد. بالنسبة لنوع الميزة حدد المنطقة. لقناع حدد عتبة (M07، Ch07،50). انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق. انقر فوق إغلاق لبدء حساب قيم المعالم.
   3. انقر على أيقونة نقطة مؤامرة. حدد كافة السكان. لميزة المحور س اختر ميزة Contrast_M01_Ch01 وميزة المحور ص اختر Area_Threshold(M07,Ch07,50). انقر فوق موافق.
   4. انقر فوق الزر منطقة مربع ورسم منطقة حول غالبية الخلايا. استدعاء هذه المنطقة غير apoptotic. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وانقر فوق المناطق. تسليط الضوء على المنطقة غير المبرمجة. تعيين إحداثيات س إلى 0 و 15 وتعيين إحداثيات y إلى 50 و 300. انقر فوق إغلاق.
3. إنشاء قناع BNC (الخطوات 9.3.1 إلى 9.3.5) لتعريف الخلايا التي تحتوي على نواة اثنين فقط.
   1. تصفح لBNC في معرض الصور وانقر عليه. هذا هو لتصور خلق القناع في قناة Hoechst.
   2. انقر على علامة التبويب تحليل، ثم انقر على أقنعة. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. ضمن وظيفة اختيار LevelSet، تحت قناع اختيار M07، حدد زر الاختيار قناع المستوى الأوسط ، وتعيين مقياس التفاصيل كفاف إلى 3.00. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى.
   3. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. تحت وظيفة، واختيار تمدد،وتحت قناع اختيار LevelSet (M07، Ch07، الأوسط، 3). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07، وقم بتعيين عدد البيكسلات إلى 2. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى.
   4. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. تحت وظيفة اختيار مستجمعاتالمياه، وتحت قناع اختيار تمدد (LevelSet(M07، Ch07، الأوسط، 3) 2). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07، وقم بتعيين سمك الخط إلى 1. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى.
   5. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. تحت وظيفة اختيار المدى،تحت قناع اختيار مستجمعات المياه (Dilate(LevelSet(M07، Ch07، الأوسط، 3)2)). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07. تعيين قيم الحد الأدنى والحد الأقصى للمساحة إلى 115 و 5000 على التوالي. تعيين قيم نسبة العرض إلى الارتفاع الحد الأدنى والحد الأقصى إلى 0.4 و 1 على التوالي. انقر فوق موافق. في الحقل الاسم تغيير النص لقراءة BNC ثم انقر فوق موافق.
4. إنشاء الميزات والمؤامرات للحصول على السكان BNC النهائي
   1. بقعة عدد BNC ميزة: انقر على علامة التبويب تحليل، ثم الميزات،ثم جديد. لنوع الميزة حدد عدد النقاط. بالنسبة للقناع، حدد قناع BNC النهائي الذي تم إنشاؤه في 9.3.5. تعيين الاتصال إلى أربعة وتغيير الاسم إلى عدد النقاط BNC. انقر فوق موافق ثم إغلاق لحساب قيم المعالم.
   2. الرسم البياني لـ BNC. انقر فوق رمز الرسم البياني. حدد غير أبوبتوتيك كمجموعة الأصل. بالنسبة لميزة المحور س اختر ميزة BNC عدد النقاط. انقر فوق موافق. انقر على أيقونة المنطقة الخطية. رسم منطقة عبر بن 2. استدعاء هذه المنطقة 2N.
      ملاحظة: الرجوع إلى القسم 9 في الملحق 1 - البروتوكول الكامل لإنشاء الأقنعة والميزات والمؤامرات المتبقية لتحديد السكان BNC النهائي

10. خلق أقنعة وميزات لتحديد MN ضمن السكان BNC

1. إنشاء قناع MN. استعرض للحصول على BNC الذي يحتوي على MN في معرض الصور وانقر عليه. هذا هو لتصور إنشاء قناع MN في قناة Hoechst. انقر على علامة التبويب تحليل، ثم انقر على أقنعة.
   1. إنشاء قناع تعريف موضعي 1:
      1. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. ضمن وظيفة اختيار بقعة وضمان تحديد زر الاختيار مشرق. تحت قناع اختيار M07، تعيين بقعة إلى خلية نسبة الخلفية إلى 2.00. تعيين نصف القطر الحد الأدنى إلى 2 وأقصى نصف قطر إلى 6. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى.
      2. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. تحت وظيفة اختيار المدى،وتحت قناع اختيار LevelSet (M07، Ch07، الأوسط، 3). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07. تعيين الحد الأدنى والحد الأقصى للمنطقة إلى 80 و 5000 على التوالي. تعيين الحد الأدنى والحد الأقصى لنسبة العرض إلى العرض إلى 0 و 1 على التوالي. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى.
      3. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. تحت وظيفة اختيار تمدد، تحت قناع اختيار المدى (LevelSet (M07، Ch07، الأوسط، 3)، 80-5000،0-1). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07. تعيين عدد وحدات البكسل إلى 2. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى.
      4. انقر فوق جديد. انقر نقرا مزدوجا على بقعة (M07، Ch07، مشرق، 2، 6، 2) قناع لإضافته إلى تعريف القناع. انقر فوق عامل التشغيل And ثم عامل التشغيل Not. انقر نقراً مزدوجاً فوق قناع التمدد (النطاق (LevelSet(M07، Ch07، الأوسط، 3)، 80-5000، 0-1)، 2) لإضافته إلى تعريف القناع. انقر فوق موافق.
      5. انقر فوق جديد، ثم دالة. ضمن وظيفة اختيار نطاق وتحت قناع اختيار القناع الذي تم إنشاؤه في 10.1.1.4:
         1. حدد بقعة (M07، Ch07، مشرق، 2، 6، 2) وليس ديلاتي (المدى (LevelSet (M07، Ch07، الأوسط، 3)، 80-5000، 0-1)، 2).
         2. تعيين الصورة إلى عرض إلى Ch07. تعيين الحد الأدنى والحد الأقصى للمنطقة إلى 10 و 80 على التوالي. تعيين الحد الأدنى والحد الأقصى لنسبة العرض إلى الارتفاع إلى 0.4 و1 على التوالي. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. اكتمال قناع تحديد الهوية الموضعية 1.
            ملاحظة: الرجوع إلى القسم 10 في الملحق 1 - البروتوكول الكامل لإنشاء الأقنعة والميزات والمؤامرات لتحديد السكان MN النهائي

11. إنشاء أقنعة وملامح والمؤامرات لتحديد السكان Mononucleateated وPolynucleated

1. إنشاء قناع POLY. انقر فوق تحليل، ثم أقنعة، ثم وظيفة جديدة . تحت وظيفة اختيار المدى،تحت قناع اختيار مستجمعات المياه (LevelSet (LevelSet(M07، Ch07، الأوسط، 3)، 2)). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07. تعيين قيم الحد الأدنى والحد الأقصى للمنطقة إلى 135 و 5000 على التوالي. تعيين قيم الحد الأدنى والحد الأقصى لنسبة العرض إلى 0.4 و 1 على التوالي. انقر فوق موافق. في الحقل الاسم، قم بتغيير النص لقراءة POLY ثم انقر فوق موافق ثم أغلق. تم إكمال قناع الخلية متعدد النوى.
2. إنشاء أقنعة مكون POLY.
   1. بولي مكون قناع 1: انقر على علامة التبويب تحليل، ثم أقنعة،ثم جديد،ثم وظيفة. ضمن وظيفة حدد مكون، وتحت قناع حدد قناع POLY. لترتيب ميزة حدد المنطقة، ولفرز النظام انقر فوق زر الاختيار تنازلي. تعيين رتبة إلى 1. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى.
   2. أقنعة مكون بولي 2 و 3 و 4: كرر كافة الخطوات في 11.2.1 باستثناء تعيين رتبة إلى 2و 3 و 4 لإنشاء أقنعة المكون الفردية.
3. عدد النقاط باستخدام قناع POLY.
   1. انقر فوق علامة التبويب تحليل، ثم الميزات، ثم جديد. بالنسبة لنوعالميزة، حدد عدد النقاط. للقناع اختر قناع بولي وتعيين الاتصال في 4. انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق ثم إغلاق لحساب قيم المعالم.
   2. انقر فوق رمز الرسم البياني. حدد السكان غير المبرمجين. بالنسبة لميزة المحور س اختر ميزة Count_POLY_4 الموضعية.
   3. منطقة عدد النقاط أحادية. انقر على أيقونة المنطقة الخطية. رسم منطقة عبر بن 1 على الرسم البياني الذي تم إنشاؤه في 11.3.2. استدعاء هذه المنطقة 1N.
   4. منطقة عد البقعة TRI. انقر على أيقونة المنطقة الخطية. رسم منطقة عبر بن 3 على الرسم البياني الذي تم إنشاؤه في 11.3.2. استدعاء هذه المنطقة 3N.
   5. منطقة العد الموضعي ة أحادية رباعية. انقر على أيقونة المنطقة الخطية. رسم منطقة عبر بن 4 على الرسم البياني الذي تم إنشاؤه في 11.3.2. استدعاء هذه المنطقة 4N.
4. تحديد السكان MONO.
   1. إنشاء ميزة نسبة العرض إلى الارتفاع MONO. انقر فوق علامة التبويب تحليل، ثم الميزات، ثم جديد. ضمن نوع الميزة، حدد ميزة نسبة العرض إلى الارتفاع وضمن قناع حدد مكون (1، منطقة، بولي، تنازلي). انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق.
   2. إنشاء ميزة التعميم MONO. مع استمرار فتح إطار "إدارة الميزات"، انقر فوق جديد. ضمن نوع الميزة، حدد ميزة التعميم وضمن قناع حدد مكون (1، منطقة، بولي، تنازلي). انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق ثم انقر فوق إغلاق لحساب قيم المعالم.
   3. للحصول على مخطط نقطة الخلايا MONO الدائرية، انقر فوق رمز رسم نقطة. حدد 1N كمجموعة الأصل. لميزة محور س اختر Circularity_Component(1، منطقة، بولي، تنازلي) وميزة محور ص اختر نسبة العرض إلى الارتفاع_المكون (1، منطقة، بولي، تنازلي). انقر فوق موافق. انقر على زر منطقة مربع ورسم منطقة حول السكان الخلية نحو الجزء الأيمن العلوي من المؤامرة. اسم هذه المنطقة Circular_1N. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وانقر فوق المناطق. تمييز منطقة Circular_1N. تغيير إحداثيات X إلى 20 و 55 وتغيير إحداثيات Y إلى 0.85 و 1.0. انقر فوق إغلاق.
   4. إنشاء ميزة بولي/Area_M07 المنطقة. انقر فوق علامة التبويب تحليل، ثم الميزات، ثم جديد. ضمن نوع الميزة، حدد ميزة المنطقة وضمن قناع حدد مكون (1، منطقة، بولي، تنازلي). انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق.
   5. مع إطار "إدارة الميزات" لا يزال مفتوحاً، انقر فوق جديد ثم ضمن نوع الميزة انقر فوق زر الاختيار المدمجة. من قائمة الميزات، قم بتمييز Area_Component(1، المنطقة، بولي، تنازلي) وانقر فوق السهم لأسفل لإضافته إلى تعريف الميزة. انقر فوق رمز القسمة (/). حدد ميزة Area_M07 وانقر فوق السهم لأسفل لإضافته إلى تعريف الميزة. انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق. انقر فوق إغلاق لبدء حساب قيم المعالم.
   6. للحصول على مخطط نقطة السكان MONO النهائي، انقر فوق رمز مؤامرة نقطة. حدد Circular_1N كمجموعة الأصل. لميزة محور س اختيار نسبة العرض إلى الارتفاع_M07 وميزة محور ص اختيار Area_Component(1، منطقة، بولي، تنازلي) / Area_M07. انقر فوق موافق. انقر فوق الزر منطقة مربع ورسم منطقة حول غالبية الخلايا. اسم هذه المنطقة Mononucleated. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وانقر فوق المناطق. تسليط الضوء على منطقة Mononucleated. تغيير إحداثيات X إلى 0.85 و 1.0 وتغيير إحداثيات Y إلى 0.55 و 1.0. انقر فوق إغلاق.
      ملاحظة: يرجى الرجوع إلى المادة 11 من الملحق 1 - البروتوكول الكامل لإنشاء الأقنعة والسمات والمؤامرات لتحديد السكان الترينوكليون ومتعددي النوى النهائيين.

12. إنشاء طريقة عرض مخصصة لفحص أقنعة BNC وMN

1. انقر على زر خصائص معرض الصور ثم انقر فوق علامة التبويب عرض. انقر على علامة التبويب مركبات ثم انقر فوق جديد. تحت اسم نوع Ch01/Ch07. انقر فوق إضافة صورة. ضمن صورة اختر Ch01 وتعيين النسبة المئوية إلى 100. انقر فوق إضافة صورة مرة أخرى، ضمن اختيار الصورة Ch07 وتعيين النسبة المئوية إلى 100.
2. انقر فوق جديد و ضمن نوع الاسم أقنعة BNC و MN
3. انقر فوق إضافة عمود. ضمن نوع الصورة اختر Ch01 وتحت قناع اختيار لا شيء
4. انقر فوق إضافة عمود. ضمن نوع الصورة اختر Ch07 وتحت قناع اختيار لا شيء
5. انقر فوق إضافة عمود. تحت نوع الصورة اختيار Ch07 وتحت قناع اختيار BNC
6. انقر فوق إضافة عمود. ضمن نوع الصورة اختر Ch07 وتحت قناع اختيار قناع MN
7. انقر فوق إضافة عمود. ضمن نوع الصورة انقر فوق زر الاختيار المركب. يجب إضافة الصورة المركبة Ch01/Ch07 تلقائياً إلى طريقة العرض. انقر فوق موافق لإغلاق الإطار خصائص معرض الصور.

13. إنشاء طريقة عرض مخصصة لفحص قناع بولي

1. راجع القسم 13 في الملحق 1 - البروتوكول الكامل لإنشاء طريقة عرض مخصصة لفحص قناع POLY

14 - إنشاء جدول إحصاءات لتعداد الأحداث الرئيسية

1. انقر على علامة التبويب تقارير ثم انقر فوق تعريف تقرير الإحصائيات. في الإطار الجديد، انقر فوق إضافة أعمدة.
2. إضافة إحصائيات عدد BNC. تحت إحصائيات حدّد عدد وتحت ينتقى السّكان ينتقي ال [بنكس] السّكان. انقر فوق إضافة إحصائيات لإضافة الإحصاء إلى القائمة.
3. كرر الخطوة 14.2 لإنشاء أعمدة منفصلة لتجمعات BNCs و MONOو TRI و POLY. انقر فوق إغلاق ثم انقر فوق موافق.
4. قالب تحليل البيانات مكتمل(الشكل 2). حفظ القالب (ملف، حفظ كقالب). يمكن العثور على قائمة قناع كامل في الملحق 2 - قائمة القناع.

15. ملفات تجربة عملية الدفعباستخدام قالب تحليل البيانات

1. ضمن القائمة أدوات انقر فوق ملفات البيانات الدفعية ثم انقر فوق إضافة دفعة في الإطار الجديد.
2. في الإطار الجديد انقر فوق إضافة ملفات لتحديد ملفات التجربة (.rif) لإضافتها إلى المجموعة. ضمن الخيار تحديد قالب أو ملف تحليل بيانات (.ast، .daf) ، انقر فوق رمز المجلد المفتوح للاستعراض إلى وفتح قالب تحليل البيانات (ملف .ast) الذي تم حفظه في الخطوة 14.4.
3. انقر فوق الزر معاينة تقرير إحصائيات لمعاينة جدول الإحصائيات. لن يتم عرض أية قيم هنا حيث لم يتم حسابها بعد. ومع ذلك، تعمل هذه الخطوة كتدقيق للتأكد من تحديد قالب التحليل الصحيح قبل تشغيل المجموعة.
4. انقر فوق موافق لإغلاق الإطار الحالي. ثم انقر فوق إرسال دفعات لبدء معالجة المجموعة من كافة الملفات.
5. عند اكتمال معالجة المجموعة، سيكون ملف .txt متوفراً في المجلد الذي يحتوي على كافة ملفات .rif. استخدم هذه الإحصائيات لحساب السمية الجينية والسمية الخلوية.

16- حساب بارامترات السمية الجينية والسمية الخلوية

1. حساب السمية الجينية: لحساب السمية الجينية، استخدم جدول الإحصاءات الذي تم إنشاؤه في 15.5. قسمة عدد الخلايا في عدد الخلايا BNCs MN على عدد الخلايا في السكان BNCs ثم ضرب 100:
   
2. حساب السمية الخلوية: تحديد العدد الإجمالي لخلايا POLY عن طريق جمع عدد الخلايا TRI وQUAD.
   1. حساب مؤشر انتشار كتلة السيتوكينيسيس (CBPI) باستخدام عدد الخلايا في MONO و BNCs و POLY كما يلي:
      
   2. وأخيراً، حساب السمية الخلوية لكل ثقافة باستخدام قيم CBPI من ثقافات التحكم (C) والثقافة المكشوفة كيميائياً (T) على النحو التالي:
      

وتتيح طريقة التحليل المبينة في هذه الورقة تحديد وتسجيل الشركات الوطنية للبيانات تلقائياً، مع السمية الجينية أو بدونها، لحساب السمية الجينية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم أيضا تحديد خلايا MONO وPOLY تلقائيا وسجل لحساب السمية الخلوية. يتم تنفيذ معايير تسجيل النقاط المنشورة6و34 التي يجب الالتزام بها عند تسجيل هذه الأحداث في برنامج تحليل البيانات MIFC. وتشير النتائج المعروضة هنا إلى أنه يمكن الكشف عن زيادات كبيرة إحصائياً في تواتر السمية الشمالية مع زيادة السمية الخلوية بعد تعرض خلايا TK6 اللمفاوية البشرية للمواد الكيميائية المعروفة التي تحفز MN (ميتوميسين C وكولشيسين). وقد ثبت نتائج مماثلة للمواد الكيميائية الإضافية التي تم اختبارها في منشور منفصل32. وبالإضافة إلى ذلك، تبين النتائج الناجمة عن استخدام مانيتول أنه يمكن أيضاً تحديد المواد الكيميائية غير المحفزة للMN بشكل صحيح باستخدام طريقة MIFC المبينة هنا. المعلمات الموضحة في البروتوكول لإنشاء كافة الأقنعة والميزات وحدود المنطقة من المرجح أن يكون لديك تعديل إذا تم استخدام أنواع الخلايا المختلفة (مثل خلايا الهامستر الصينية) لإجراء التقييم.

ويبين الشكل 3 أربعة أفرقة مختارة لتحديد المراكز الوطنية للإنشاء والقدرات (الشكل3ألف-3D). يظهر هنا رسم بياني يتيح اختيار الخلايا ذات النوى اثنين (الشكل3A)والمؤامرات ثنائية المتغيرات التي تمكن من اختيار BNCs مع التعميم مماثلة (الشكل3B)، والمناطق المماثلة والكثافات (الشكل3C ) وBNCs التي لديها جيدة منفصلة، والنوى غير متداخلة (الشكل3D) وفقا لcritieria التهديف6،34. الشكل 3 E يظهر BF وHoechst الصور وكذلك أقنعة BNC وMN تشير إلى أنه يمكن تحديد BNCs مع MN واحدة أو متعددة وتعدادها. وهذا يسمح بحساب السمية الجينية عن طريق تحديد معدل الـ BNCs الميكرونوي في عدد السكان النهائي من BNC. يظهر الشكل 4 تطبيق ميزة "عدد موضعي" باستخدام قناع POLY لتعريف الخلايا أحادية وثلاثية ورباعية. ويمكن بعد ذلك جمع عدد الخلايا الثلاثية ورباعية للحصولعلى العدد النهائي من خلايا POLY (الجدول 1). وهذا يمكّن من حساب السمية الخلوية باستخدام الصيغة الموضحة في البروتوكول. ولذلك، يمكن تقييم كل نقطة جرعة في التجربة من خلال كل من السمية الجينية ومعلمات السمية الخلوية.

ويبين الشكل 5 السمية الجينية وقيم السمية الخلوية للأنوجين كولشيسين، وميتوميسين C كلستوجين وللسيطرة السلبية، مانيتول. بالنسبة للكولشيسين (الشكل5ألف)فإن جرعات 0.02 إلى 0.05 ميكروغرام/مل تنتج زيادات كبيرة إحصائياً في تردد MN، تتراوح بين 1.28% إلى 2.44% على التوالي على التحكم في المذيبات (الجدول1). وفي حالة ميتوميسين جيم(الشكل 5باء)أنتجت الجرعتان العلويتان 0.4 و0.5 ميكروغرام/مل ترددات MN هامة إحصائياً بالمقارنة مع ضوابط المذيبات. وكانت ترددات الـ MN هذه 0.93 في المائة عند 0.4 ميكروغرام/مل و1.02في المائة عند 0.5 ميكروغرام/مل (الجدول 2). وأخيراً، بالنسبة لمانيتول (الشكل5جيم)،لا توجد جرعات تم اختبارها تؤدي إلى سمية مسيوية تزيد على 30 في المائة، كما أنها لم تنتج زيادات كبيرة في تواتر السمية المتعددة الجنسيات مقارنة بضوابط المذيبات، كما هو متوقع (الجدول3).

الشكل 1 إعدادات أداة MIFC. لقطة شاشة من إعدادات MIFC كما هو موضح في القسم الخطوة 7 من البروتوكول. (أ) وضع قوة الليزر 405 نانومتر إلى 10 مواطوات. (ب) وضع قنوات BF 1 و 9. (C) اختيار عدسة التكبير 60x الهدف. (D) تحديد أبطأ سرعة تدفق الذي يولد الصور مع أعلى دقة. (هـ)تحديد عدد الأحداث التي سيتم جمعها إلى 20,000. (F) النقر فوق الزر تحميل لبدء عملية تحميل العينة. (G) النقر فوق الزر اكتساب لبدء الحصول على الصور. (H) النقر فوق الزر إرجاع لإرجاع أي عينة غير مستخدمة. (I) scatterplot من نسبة العرض إلى الارتفاع BF مقابل منطقة BF لاختيار الخلايا المفردة. (ي) مبعثر من Hoechst التدرج RMS مقابل BF التدرج RMS لاختيار الخلايا المركزة. (K) الرسم البياني من كثافة Hoechst لاختيار الخلايا الإيجابية الحمض النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 تحليل استراتيجية التجمع البرمجيات. لقطة شاشة لاستراتيجية التغرير الموصوفة في القسم 9 من البروتوكول. وتظهر المناطق بترتيب تسلسلي لتحديد الخلايا البينوكلية (المربع الأحمر)، وmicronuclei (المربع الأصفر)، والخلايا الأحادية والمتعددة النوى (المربع الأزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 تحديد وتسجيل الشركات الوطنية مع أو بدون MN. (أ) اختيار الخلايا التي تحتوي على اثنين من النوى متميزة. (ب) تحديد الخلايا البينوكلية (BNCs) التي تحتوي على اثنين من النوى الدائرية للغاية من خلال استخدام ميزة كثافة نسبة العرض إلى الارتفاع. (ج) اختيار BNCs التي لديها نوى مع مناطق مماثلة وكثافة. ويتم ذلك عن طريق حساب نسبة مساحة كل من النوى ونسبة نسبة العرض إلى الارتفاع لكل من النوى. (D) استخدام ميزات نسبة الشكل ونسبة العرض إلى الارتفاع لتحديد BNCs التي تحتوي على اثنين من النوى المنفصلة بشكل جيد. (E) ميزة "عدد النقاط" باستخدام قناع النواة الدقيقة (MN) مما يدل على أنه يمكن تعريف BNCs مع MN واحد أو متعدد وتعدادها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 تحديد وتسجيل خلايا مونو وبولي. استخدام ميزة العد الموضعي لتحديد وتعداد الخلايا الأحادية والثلاثية وquadranucleated. قناع المكون 1 يسمح بتحديد الخلايا mononucleated (الصورة العليا). أقنعة المكون 1 إلى 3 يسمح بتحديد الخلايا trinucleated (الصورة الوسطى). أقنعة المكون 1 إلى 4 يسمح بتحديد الخلايا quadranucleated (الصورة السفلية). تم تعديل هذا الرقم من رودريغز 201832. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5 التحديد الكمي للسمية الخلوية. السمية السيتومية كميا باستخدام مؤشر انتشار كتلة السيتوكينيسيس (الدوائر السوداء) والسمية الجينية كميا باستخدام النسبة المئوية من MN (قضبان واضحة) بعد التعرض 3 ح و 24 ح الانتعاش ل (أ) كولشيسين ، (ب) ميتوميسين C و ( ج)مانيتول. وتشير النجوم إلى زيادات كبيرة إحصائياً في تواتر النطاقات المتعددة الجنسيات مقارنة بالضوابط (اختبار تشي تربيع؛ *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). جميع الكميات هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة. تم تعديل هذا الرقم من رودريغز 201832. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: المعلمات المطلوبة لحساب السمية الخلوية (عدد الخلايا الأحادية وثنائية ومتعددة النوى) والسمية الجينية (عدد ونسبة الخلايا البينوكلية الدقيقة) للكولشيسين. جميع الكميات المحسوبة هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة.

الجدول 2: Tانه المعلمات اللازمة لحساب السمية الخلوية (عدد الخلايا الأحادية وثنائية ومتعددة النوى) والسمية الجينية (عدد ونسبة الخلايا البينوكلية micronuated) للميتوميسين C. جميع الكميات المحسوبة هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة.

الجدول 3: البارامترات المطلوبة لحساب السمية الخلوية (عدد الخلايا الأحادية وثنائية ومتعددة النوى) والسمية الجينية (عدد ونسبة الخلايا البينوكلية الدقيقة) للمانيتول. جميع الكميات المحسوبة هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة.

الملحق 1: البروتوكول الكامل. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملحق 2: قائمة القناع. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ويعمل المؤلف من قبل شركة لومينيكس، صانع التصوير متعدد الأطياف ImageStream تدفق مقياس السيتومتر الذي تم استخدامه في هذا العمل.