مقالة منهجية

تحديد العوامل النيوكليولار أثناء النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال الترسيب المناعي القس والقياس الطيفي الكتلي

DOI:

10.3791/59329

⸱

يونيو 26, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقوم بوصف الترسيب المناعي Rev في وجود النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لقياس الطيف الكتلي. ويمكن استخدام الأساليب الموصوفة لتحديد العوامل النووية التي تنطوي عليها الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1، وهي تنطبق على نماذج الأمراض الأخرى لتوصيف المسارات التي لم تدرس بعد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 تفاعلات البروتين الفيروسي مع العوامل المضيفة لتسهيل النسخ المتماثل الفيروسي، والتعبئة والتغليف، والإفراج. كما تتطلب الدورة المعدية تشكيل مجمعات بروتين فيروسية/مضيفة مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 RNA لتنظيم الربط وتمكين النقل النووي. ويحقق بروتين HIV-1 Rev التصدير النووي لـ HIV-1 mRNAs من خلال التعدد مع الأهداف التي تعمل برابطة الدول المستقلة- عنصر الاستجابة للمراجعة. توجد إشارة توطين نيوكليولار (NoLS) داخل فوهة الأذن العضوية للزخرفة الغنية بالارجين (ARM)، مما يسمح بتراكم مجمعات Rev/RRE في النواة. وتكهن تُتكهن العوامل النووية لدعم الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال وظائف أخرى مختلفة بالإضافة إلى التوسط في التصدير النووي المستقل عن الحمض النووي الريبي والربط. نحن نصف طريقة الترسيب المناعي من النوع البري (WT) Rev بالمقارنة مع الطفرات النووية Rev (الحذف والطفرات Rev-NoLS نقطة واحدة) في وجود النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لقياس الطيف الكتلي. العوامل النووية المتورطة في النقل النووي (Nucleophosmin B23 وNocleolin C23)، فضلا عن عوامل الربط الخلوية، تفقد التفاعل مع القس في وجود الطفرات Rev-NoLS. تم تحديد مختلف العوامل النووية الأخرى، مثل snoRNA C /D مربع 58، لتفقد التفاعل مع الطفرات Rev، ومع ذلك وظيفتها في دورة النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لا تزال غير معروفة. وتبين النتائج المعروضة هنا استخدام هذا النهج لتحديد العوامل النووية الفيروسية/المضيفة التي تحافظ على الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1. وتنطبق المفاهيم المستخدمة في هذا النهج على النماذج الفيروسية والأمراض الأخرى التي تتطلب توصيف المسارات التي لم تدرس بعد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتفترض النوى كأرض التفاعل من مختلف المضيف الخلوي والعوامل الفيروسية اللازمة للنسخ المتماثل الفيروسي. النواة هي بنية معقدة مقسمة إلى ثلاث مقصورات مختلفة: مقصورة الفيبريلار، وحجرة الفيبريلر الكثيفة، والمقصورة الحبيبية. يُترجم بروتين HIV-1 Rev على وجه التحديد داخل المقصورات الحبيبية؛ ومع ذلك، السبب في هذا النمط الترجمة غير معروف. في وجود طفرات من نقطة واحدة ضمن تسلسل NoLS (Rev الطفرات 4 و 5 و 6)، يحتفظ Rev بنمط نيوكليولار وقد ثبت في السابق لإنقاذ تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2، ومع ذلك، مع انخفاض الكفاءة مقارنة WT Rev1 . جميع الطفرات نقطة واحدة غير قادرة على الحفاظ على دورة فيروس نقص المناعة البشرية-1NL4-3 المعدية. في وجود طفرات متعددة من نقطة واحدة ضمن تسلسل NoLS (Rev-NoLS الطفرات 2 و 9)، وقد لوحظ Rev لتفريق في جميع أنحاء النواة والسيتوبلازم ولم يتمكن من إنقاذ فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2 النسخ المتماثل1. والهدف من هذه الدراسة البروتيوميات هو فك النيوكليولار وكذلك العوامل الخلوية nonnucleolar المشاركة في المسار المعدي فيروس نقص المناعة البشرية-1 بوساطة القس. يتم تحسين ظروف الترسيب المناعي القس من خلال التفاعل مع البروتين الفوسفاتي B23 النووي، الذي ثبت سابقا أن تفقد التفاعل مع القس في وجود الطفرات النووية.

وقد درست العوامل الخلوية Rev على نطاق واسع في الماضي; ومع ذلك، وقد تم ذلك في غياب مسببات الأمراض الفيروسية. بروتين واحد، على وجه الخصوص، التي تتميز في هذه الدراسة من خلال التفاعل القس خلال النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 هو البروتين الفوسفاتي النووي B23 - وتسمى أيضا نوكلوفوسمين (NPM)، نومترين، أو NO38 في البرمائيات2،3، 4.وأعرب عن B23 كما isoforms ثلاثة (NPM1، NPM2، و NPM3) - جميع أعضاء nucleophosmin / nucleoplasmin الأسرة النووية مرافقة5،6. وظائف المشاركات الجزيئية NPM1 في التجميع السليم للنيوكليوسومات، في تشكيل البروتين / مجمعات حمض نووي المشاركة في هياكل الكروماتين أعلى ترتيب7،8، وفي منع التجميع و طي البروتينات المستهدفة من خلال المجال الأساسي N-الطرفية (بقايا 1-120)9. وظائف NPM1 يمتد إلى التكوين الريبوسوم من خلال نقل الجسيمات preribosomal بين النواة والسيتوبلازم10،11، وتجهيز الحمض النووي الريبي preribosomal في تسلسل فاصل ة منقولة الداخلية 12،13، والقبض على تجميع النيوكليولار من البروتينات خلال الجمعية ريبوسومال14،15. وتورط NPM1 في تثبيط المبرمج16 وفي تثبيت مثبطي الورم ARF17و18 و P5319، وكشف عن دورها المزدوج كعامل oncogenic ومثبط الورم. NPM1 يشارك في الأنشطة الخلوية لاستقرار الجينوم، والنسخ المتماثل المركز، والنسخ. تم العثور على NPM1 في النوى أثناء دورة الخلية بين المراحل، على طول محيط الكروموسومات أثناء الالمتعدد، وفي الهيئات قبل النوكليار (PNB) في ختام الداء الميتومي. NPM2 و NPM3 ليست مدروسة جيدا كما NPM1، الذي يخضع لمستويات التعبير المتغيرة خلال الأورام الخبيثة20.

تم توثيق NPM1 في اغلاق النيوكليوسيتوبلازمية من مختلف البروتينات النووية / النووية من خلال NES الداخلية وNLS9،21 وكان قد ذكر سابقا لدفع الاستيراد النووي من البروتينات Tat وفيروس نقص المناعة البشرية وRev. في وجود B23 ملزمة المجال-β-galactosidase البروتينات الانصهار، تات يسيء توطين داخل السيتوبلازم ويفقد نشاط التنشيط. وهذا يدل على تقارب قوي من تات لB232. وأنشأت دراسة أخرى مجمعاً مستقراً للنسخة Rev/B23 في غياب التقييمات الإلكترونية المضادة للانبعاثات. في وجود RRE mRNA، ينفصل Rev عن B23 ويربط يفضل أن يكون فيروس نقص المناعة البشرية RRE، مما يؤدي إلى تشريد B2322. ومن غير المعروف أين، على المستوى دون النووي، يتم نقل تات وعملية تبادل Rev من B23 لفيروس نقص المناعة البشرية mRNA. يتم تفترض كل من البروتينات لدخول النوى في وقت واحد من خلال التفاعل B23. ومن المتوقع إشراك البروتينات الخلوية المضيفة الأخرى في مسار النيوكليولار لفيروس نقص المناعة البشرية. الأساليب الموصوفة في هذا التحقيق البروتيوميات سوف تساعد على توضيح التفاعل من النوى مع العوامل الخلوية المضيفة المعنية خلال مرض فيروس نقص المناعة البشرية-1.

وقد بدأ التحقيق في البروتيوميات من خلال التعبير عن الطفرات ذات النقطة الواحدة Rev NoLS (M4 و M5 و M6) وبدائل الأرجينين المتعددة (M2 و M9) لإنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2. في هذا النموذج، يتم نقل خط خلية HeLa التي تعبر بشكل ملحوظ عن نقص Rev HIV-1HXB2 (HLfB) مع الطفرات النيوكليولار WT Rev وRev التي تحتوي على علامة العلم في نهاية 3'. وسيؤدي وجود WT Rev إلى السماح بحدوث النسخ المتماثل الفيروسي في ثقافة HLfB، بالمقارنة مع طفرات Rev-NoLS التي لا تنقذ نقص Rev (M2 وM9)، أو تسمح بحدوث النسخ المتماثل الفيروسي ولكن ليس بكفاءة مثل WT Rev (M4 وM5 وM6)1. يتم جمع lysate الخلية 48 ح في وقت لاحق بعد الانتشار الفيروسي في وجود التعبير القس وتعرض لمناعة الترسيب مع العازلة lysis الأمثل للتفاعل Rev/B23. يتم وصف تحسين العازلة تحلل باستخدام تركيزات الملح متفاوتة، ويتم مقارنة أساليب الإلتبيلة البروتين لفيروس نقص المناعة البشرية-1 Rev وتحليلها في الفضة الملطخة أو الكوماسي الملون SDS-PAGE هلام. وينطوي النهج البروتيومياتي الأول على التحليل المباشر لعينة من معدل WT Rev وM2 وM6 وM9 بواسطة قياس الطيف الكتلي جنباً إلى جنب. أما النهج الثاني الذي خضعت به الأيلات من WT Rev وM4 وM5 وM6 لعملية استخراج الجل إلى النهج الأول. يتم تحليل تقارب الببتيد إلى الطفرات Rev-NoLS بالمقارنة مع WT Rev وعرض احتمال تحديد البروتين. وتكشف هذه النُهُج عن العوامل المحتملة (النيوكليولار وغير النوكليولار) التي تشارك في نقل فيروس نقص المناعة البشرية-1 من الحمض النووي الريبي والربط مع Rev أثناء تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1. بشكل عام، فإن حالة الانحراف الخلوي، والملكية الفكرية، وelution الموصوفة تنطبق على البروتينات الفيروسية ذات الأهمية لفهم العوامل الخلوية المضيفة التي تنشط وتنظم المسارات المعدية. وهذا ينطبق أيضا على دراسة العوامل المضيفة الخلوية اللازمة لاستمرار نماذج المرض المختلفة. في هذا النموذج البروتيوميات، يتم تحسين فيروس نقص المناعة البشرية-1 Rev IP للتفاعل B23 لتوضيح العوامل النووية المشاركة في نشاط اغلاق النيوكليوسيتوبلازمية وفيروس نقص المناعة البشرية-1 mRNA ملزمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطوير خطوط الخلايا التي تعبر بشكل ملحوظ عن نماذج الأمراض المعدية التي تعاني من نقص في البروتينات الرئيسية ذات الأهمية، على غرار خط الخلايا HLfB، لدراسة مسارات الاهتمام المعدية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية ثقافة

  1. الحفاظ على HLfB في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2 MM L-الجلوتامين، و 1 مليون بينوفات الصوديوم داخل الأنسجة المعالجة ثقافة لوحات 100 ملم. الحفاظ على الثقافات الخلية في 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة الموردة مع 5٪ CO2. مرور الخلايا المتجانسة إلى كثافة الخلية من 1 × 106 خلايا / مل.
  2. تجاهل وسائط ثقافة الخلية. شطف بلطف الخلايا مع 10 مل من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). إزالة وتجاهل PBS 1X دون تعطيل طبقة الخلية.
  3. إضافة 2 مل من 1X trypsin-EDTA الحل إلى الخلايا. قم بصخرة الطبق لمعطف الطبقة الأحادية والحضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية داخل غرفة رطبة لمدة 5 دقائق.
  4. اضغط بقوة على جانب الطبق مع كف اليد لفصل الخلايا. إعادة تعليق الخلايا المنفصلة في 8 مل من وسائل الإعلام الثقافية الطازجة. تدور الخلايا في 400 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. تجاهل وسائل الإعلام الثقافة دون تعطيل بيليه الخلية. إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من وسائل الإعلام ثقافة جديدة. الثقافة الفرعية 1 مل من الخلايا المركزة مع 9 مل من وسائل الإعلام ثقافة جديدة داخل الأنسجة الثقافة المعالجة لوحات 100 ملم.
    ملاحظة: لكل طفرة Rev-NoLS، سوف 3X 100 مم HLfB أو لوحات ثقافة HeLa تسفر عن ما يكفي من البروتين lysate لتحليل وصمة عار الغربية والقياس الطيفي الكتلة. أضف لوحات إضافية للتحكم الإيجابي والتحكم السلبي في WT Rev. تتطلب وحدة تخزين الخلايا الفرعية التحسين باستخدام أنواع خلايا مختلفة.

2 - التعبير عن طفرات العلم Rev-NoLS-3 أثناء النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1

  1. قم بزراعة ثقافة الخلية HLfB إلى كثافة خلية من 2 × 106 خلايا/مل. إعداد 4 مل من الكالسيوم الفوسفات الحمض النووي تعليق لكل لوحة 100 ملم على النحو التالي.
    1. تسمية اثنين من أنابيب 15 مل كما 1 و 2. إضافة 2 مل من HBS 2X (0.05 M HEPES, 0.28 M NaCl, و 1.5 m Na2HPO4 [pH 7.12]) إلى أنبوب 1. إضافة TE 79/10 (1 m Tris-HCl و 0.1 m EDTA [درجة الحموضة 7.9]) إلى أنبوب 2. حجم TE 79/10 هو 1.760 مل - حجم الحمض النووي.
    2. إضافة 20 ميكروغرام من بلازميد يحتوي على طفرة Rev-NoLs-3'flag ذات الاهتمام بالأنبوب 2 وخلط محتوياته من خلال إعادة التعليق. إضافة 240 درجة مئوية من 2 M CaCl2 إلى أنبوب 2 ومزيج مرة أخرى من خلال إعادة تعليق.
    3. نقل خليط من أنبوب 2 إلى أنبوب 1 قطرة، خلط بلطف. السماح للتعليق للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. أضف 1 مل من التعليق إلى كل ثقافة من 3 خلايا، لوحات 100 مم أثناء تدوير الوسائط بلطف. ارجع الأطباق إلى الحاضنة واترك خليط التغوط لمدة 6 ح. استبدل خليط التغوط بـ 10 مل من وسائل الإعلام الثقافية الطازجة واحتضن الخلايا لمدة 42 ساعة.

3. جمع البروتين الفيروسي lysate

  1. تجاهل وسائط الخلية 48 ساعة posttransfection. ضع كل طبق 100 مم على سرير من الثلج. تسمية أنابيب 15 مل لكل عينة طفرة Rev-NoLS ووضع الأنابيب على الجليد.
  2. شطف بلطف الخلايا مع 10 مل من PREchilled 1X PBS دون تعطيل طبقة الخلية. تجاهل PBS 1x. إضافة 3 مل من الليسيس العازلة (50 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك [درجة الحموضة 8.0]، 137 مل حمض الهيدروكلوريك، و 1٪ X-100 المنظفات [انظر جدولالمواد]، تعامل مع كوكتيل مثبطات البروتياز، إلى كل من لوحات 100 ملم.
  3. استخدم مكشطة خلايا لتعطيل طبقة الخلية. إمالة لوحة وكشط بلطف وجمع الخلايا في بركة. جمع lysate الخلية باستخدام ميكرومازيت 1000 درجة مئوية وخلط lysates الخلية من كل من لوحات 100 ملم الثلاثة في أنبوب 15 مل المسمى مسبقا.
  4. احتضان الخلية lysate على الجليد لمدة 15 دقيقة، دوامة كل 5 دقائق.
  5. جمع supernatant البروتين دون تعطيل بيليه الحطام الخلية ونقلها إلى أنبوب آخر معقمة 15 مل. الحصول على تركيز البروتين الفيروسي باستخدام طريقة برادفورد (انظر القسم 4).
  6. حفظ aliquot من عينة الإدخال (20 ميكروغرام) لتحليل مناعي الغربية. إضافة 2X عينة العازلة (20٪ الجلسرين، 0.02٪ بروموفينول الأزرق، 125 mM تريس-كل [درجة الحموضة 6.8]، 5٪ SDS، و 10٪ 2-mercaptoethanol) إلى المجلد النهائي. تغلي في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتخزين عينة الإدخال في -20 درجة مئوية.

4. برادفورد ساي

ملاحظة: إعداد 10X الزلال المصل البقري (BSA) من 100x BSA الأسهم قبل توليد منحنيات البروتين القياسية.

  1. Aliquot المياه في أنابيب الطرد المركزي الجزئي للفراغ والمعايير التالية: فارغة = 800 درجة مئوية؛ المعيار 1 = 2 ملغم/مل، 798 درجة مئوية؛ المعيار 2 = 4 ملغم/مل، 796 درجة مئوية؛ المعيار 3 = 6 ملغم/مل، 794 درجة مئوية؛ المعيار 4 = 8 ملغم/مل، 792 درجة مئوية؛ المعيار 5 = 10 ملغم/مل، 790 درجة مئوية من الـ Aliquot 10x BSA في المعايير المعينة التالية: المعيار 1 = 2 ميكرولتر؛ المعيار 2 = 4 ميكرولتر؛ المعيار 3 = 6 ميكرولتر؛ المعيار 4 = 8 ميكرولتر؛ معيار 5 = 10 درجة مئوية.
  2. إعداد خليط من عينات البروتين عن طريق خلط 795 ميكرولتر من الماء مع 5 ميكرولتر من عينات البروتين. إضافة 200 ميكرولتر من البروتين فحص صبغ الكاشف (انظر جدولالمواد) إلى كل عينة فارغة، والقياسية، والبروتين. دوامة العينات لفترة وجيزة لخليط حتى وحضانة في درجة حرارة الغرفة (18-20 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
  3. نقل فارغة، والمعايير، وعينات البروتين إلى cuvettes. قياس تركيزات البروتين في OD من 595 نانومتر.

5. Coimmunoprecipitation من Rev-NoLS-3'العلم

  1. شطف 25 ميكرولتر من الخرز هلام تقارب M2 (انظر جدولالمواد) مع 500 درجة مئوية من العازلة lysis، تعامل مع كوكتيل مثبطات البروتياز. شطف المزيد من حبات هلام تقارب لكل عينة طفرة والضوابط.
    ملاحظة: إعداد ما يكفي من الخرز هلام تقارب M2 لاثنين من المواد الهلامية (50 درجة مئوية) - واحد لتحليل المناعية الغربية والآخر لتلطيخ البروتين والقياس الطيفي الشامل.
  2. تدور في 820 × ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant. شطف 2X أكثر.
  3. إضافة lysate البروتين الفيروسي (1 ملغ / مل في 5 مل من الحجم الإجمالي) إلى حبات تقارب M2 شطفها مسبقا. ضبط إجمالي حجم الصوت باستخدام المخزن المؤقت للتخدير.
  4. احتضان رد الفعل لمدة 3 ساعة، وتناوب في 4 درجة مئوية. الطرد المركزي الخرز M2 تقارب / البروتين الفيروسي lysate في 820 × ز لمدة 1 دقيقة.
  5. جمع supernatant وحفظ aliquot من عينة ما بعد IP (20 ميكروغرام) لتحليل المناعية الغربية. قياس تركيز البروتين من lysate ما بعد IP. جمع 20 ميكروغرام للمناعة الغربية.
  6. إضافة المخزن المؤقت نموذج 2 x إلى وحدة التخزين النهائية. تغلي في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتخزين عينة ما بعد IP في -20 درجة مئوية.
  7. شطف الخرز M2 مع 750 درجة مئوية من العازلة lysis وغسل الخرز على الدوار في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  8. كرر الخطوات 5.7 لمرتين أكثر من ذلك الإذاجة على الدوار في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل الثالث، قم بإزالة أي آثار للمخزن الاحتياطي للتخدير من مركب الخرز/IP المشترك M2 باستخدام طرف تحميل جل طويل.
    ملاحظة: قرصة نهاية طرف تحميل هلام مع ملاقط مسطحة قبل إزالة أي ة كميات ضئيلة من المخزن المؤقت lysis. وهذا سوف يمنع تعطيل وتحمل الخرز M2.
  9. إعادة تعليق الخرز M2 في 55 درجة مئوية من المخزن المؤقت التحميل 2X. تغلي العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  10. قم بتحميل 25 ميكرولتر من الإلوات على جلين منفصلين من SDS-PAGE (جل واحد للمناعة الغربية والآخر لتلطيخ الكوماسي).

6. إعداد المواد الهلامية SDS-PAGE

  1. يلقي اثنين من 15٪ SDS-أكريلاميد حل المواد الهلامية عن طريق خلط الكواشف التالية في أنبوب 50 مل (في حجم نهائي من 40 مل، ما يكفي لأربعة هلام): 4.16 مل من المياه النقية جدا، 15 مل من 40٪ أكريلاميد: بيساكريلاميد (29:1)، 10 مل من 1.5 M تريس-هكل (درجة الحموضة 8.8) ، 400 ميكرولتر من 10٪ SDS، 400 ميكرولتر من 10٪ كبريتات الأمونيوم، و 40 ميكرولتر من TEMED.
  2. خلط هلام حل عن طريق عكس أنبوب 50 مل عدة مرات. ماصة خليط هلام حل في جهاز هلام الغربية precleaned (أربعة هلام - ثلاثة لالمناعية الغربية وواحدة لبقعي / الفضة تلطيخ).
  3. ماصة بلطف ما يكفي من الماء لتغطية الطبقة العليا من خليط هلام. السماح للهلام حل لبلمرة.
  4. صب طبقة الماء من هلام حل، وذلك باستخدام ممسحة مهمة حساسة (انظر جدولالمواد) لاستيعاب أي المياه الزائدة.
  5. يلقي اثنين 5٪ SDS-أكريلاميد التراص هلام عن طريق خلط الكواشف التالية في أنبوب 50 مل (في حجم نهائي من 20 مل، ما يكفي لأربعة هلام): 11.88 مل من المياه فائقة النقي، 2.5 مل من 40٪ أكريلاميد: بيساكريلاميد (29:1)، 5.2 مل من 1.5 M تريس-حمض الهيدروكلوريك (PH 8.8) ، 200 ميكرولتر من 10٪ SDS، 200 ميكرولتر من 10٪ كبريتات الأمونيوم، و 20 ميكرولتر من TEMED.
  6. خلط هلام التراص عن طريق عكس أنبوب 50 مل عدة مرات. ماصة خليط هلام التراص فوق هلام حل إلى الجزء العلوي من الجهاز.
  7. وضع مشط كاسيت هلام تحتوي على العدد المناسب من الممرات في هلام التراص. استيعاب أي تجاوز من خليط هلام باستخدام ممسحة مهمة حساسة (انظر جدولالمواد). السماح هلام التراص لبوليمر تماما.
  8. فيضان جهاز هلام الغربية مع 1X الغربية تشغيل العازلة (تركيز 5X: 250 mM تريس-كل [درجة الحموضة 8.3] ، 1.92 M غليسين ، 0.5 ٪ SDS ، و 10 MM EDTA).
  9. سحب بلطف مشط كاسيت هلام من هلام التراص. السماح للمخزن المؤقت تشغيل الغربية 1X لملء آبار التحميل. مسح كل بئر مع 1X الغربية تشغيل العازلة باستخدام حقنة قبل تحميل العينات.
  10. تحميل عينات مناعي الغربية في كل هلام المقابلة (عينات الإدخال، عينات coimmunoed، وعينات ما بعد IP). تحميل علامات البروتين هلام الغربية.
  11. تحميل عينات coimmunoprecipitated لبقع Coomassie / الفضة في هلام آخر. تحميل علامات البروتين هلام الغربية.
  12. قم بتوصيل جهاز الجل الجاري بمصدر طاقة وقم بتشغيل المواد الهلامية على 100 فولت حتى تصل صبغة التحميل إلى الجل الصافر. زيادة الجهد إلى 140 V حتى صبغالتحميل تصل إلى الجزء السفلي من هلام حل.

7. نقل وصمة عار الغربية

  1. تفكيك جهاز هلام الغربية. شريحة وتجاهل هلام التراص، وترك هلام حل سليمة.
  2. نقل بلطف المواد الهلامية حل إلى صينية نظيفة مليئة العازلة نقل الغربية (25 Mتريس، 194 مل غليسين، 0.005٪ SDS، 20٪ الميثانول) ونقع لهم لمدة 15 دقيقة.
  3. تجميع جهاز نقل هلام على النحو التالي.
    1. قطع ثلاثة أغشية نقل PVDF وست قطع من ورق ة التصفية (انظر جدولالمواد) إلى حجم هلام حل.
    2. نقع غشاء PVDF في الميثانول لمدة 5 دقائق.
    3. ضع يُوضع كاسيت حامل الجل في صينية خبز زجاجية مملوءة جزئيًا بحاجز النقل الغربي، مع الجانب الأسود في الأسفل.
    4. ضع وسادة رغوة غارقة مع العازلة نقل الغربية ضد الجانب الأسود من كاسيت حامل هلام.
    5. الرطب قطعة من ورقة فلتر في العازلة نقل الغربية ووضعها على رأس وسادة رغوة. ضع جل الحل أعلى ورقة الفلتر.
      ملاحظة: ضع هلام الحل في اتجاه التحميل الصحيح ليتم نقلها إلى غشاء PVDF.
    6. وضع غشاء نقل PVDF واحد على رأس هلام حل. بلل قطعة من ورق الفلتر مع المخزن المؤقت لنقل الغربية ووضعها على رأس غشاء نقل PVDF.
    7. ضع وسادة رغوة أخرى غارقة مع العازلة نقل الغربية على رأس ورقة فلتر. أضعاف بعناية الجانب الأبيض من كاسيت حامل هلام على رأس وسادة رغوة غارقة. قفل الكاسيت بإحكام.
    8. ضع جهاز الكاسيت الهلامي في تجميع أقطاب جهاز النقل. كرر الخطوات 7.3.4 إلى 7.3.8 لكل هلام حل المتبقية.
    9. ملء خزان جهاز نقل مع العازلة نقل الغربية. وضع قضيب التحريك في خزان الجهاز.
    10. ضع خزان الجهاز فوق طبق التحريك. ضبط إعداد ضجة إلى 5-6، والتأكد من أن شريط تحريك ليست عالقة أو ضرب أشرطة حامل هلام.
    11. قم بتوصيل جهاز نقل الجل بمصدر طاقة ونقل الجل عند 100 فولت لمدة 1 ساعة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.

8. مناعة

  1. إزالة كاسيت حامل هلام ووضع الجانب الأسود إلى أسفل ضد صينية الخبز الزجاج نظيفة. افتح الدرج وتجاهل بعناية وسادة رغوة وورقة التصفية. وضع علامة على زاوية من غشاء PVDF لتحديد اتجاه التحميل الصحيح. الحفاظ على الغشاء الرطب.
    ملاحظة: يمكن أن يكون غشاء PVDF الهواء المجففة وتخزينها في حاوية نظيفة ومختومة. إعادة ترطيب الغشاء عن طريق تكرار الخطوات 7.3.2.
  2. ضع الغشاء في 100 مل من محلول الحجب (5٪ الحليب، 1X TBS، و 0.1٪ توين 20). سد الغشاء عن طريق هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة (18-20 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة.
  3. قطع عبر الغشاء فوق علامة البروتين 25 كيلودا. ضع الجزء العلوي من الغشاء، الذي يحتوي على نطاقات بروتين أكبر من 25 كيلوداً، في محلول حظر يحتوي على B23 ماوس أحادي النسيلة IgG1 (تخفيف 1:500). كتلة بين عشية وضحاها، هزاز في 4 درجة مئوية.
  4. ضع الجزء السفلي من الغشاء، الذي يحتوي على نطاقات البروتين أصغر من 25 كيلودا، في حل حظر يحتوي على M2 الماوس أحادي النسيلة IgG1 (1:1000 تخفيف، انظر جدول المواد). كتلة بين عشية وضحاها، هزاز في 4 درجة مئوية.
  5. غسل الغشاء 3X لمدة 10 دقائق في 25 مل من محلول الغسيل الغربي (1X TBS، 0.1٪ توين 20) على منصة هزاز.
  6. احتضان الأغشية في الماعز المضادة للماوس IgG1-HRP (1:5000 تخفيف) المخففة في حل حجب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الغشاء 3X لمدة 10 دقيقة في 25 مل من محلول الغسيل الغربي على منصة هزاز.
  7. إعداد chemiluminescence الركيزة النشاف الغربية. استخدام p1000 micropipette لإضافة الركيزة إلى الغشاء.
  8. تطوير كل غشاء في chemiluminescence الركيزة النشاف الغربية لمدة 5 دقائق. استيعاب الركيزة الزائدة باستخدام ممسحة مهمة حساسة (انظر جدولالمواد).
  9. وضع الغشاء في حامي ورقة نظيفة مسجلة داخل كاسيت. خذ الكاسيت إلى غرفة مظلمة ووضع ورقة واحدة من الفيلم في الكاسيت. قفل الكاسيت في مكان وحضانة لمدة 5-15 دقيقة.

9. البقع كوماسي

  1. تفكيك جهاز هلام الغربية. شريحة وتجاهل هلام التراص، وترك هلام حل سليمة. نقل بلطف هلام حل إلى صينية نظيفة مليئة 25 مل من الماء النقي جدا.
  2. قم بحضانة الجل على منصة هزازة لمدة 15 دقيقة. تخلص من الماء النقي جدًا وكرر خطوة الغسيل 2x أكثر.
    ملاحظة: إذا بقيت فقاعات SDS بعد خطوات الغسيل، يمكن غسل الجل في الماء النقي للغاية بين عشية وضحاها. SDS المتبقية يمكن أن يسبب تلطيخ خلفية عالية من هلام.
  3. خلط الكاشف وصمة عار Coomassie عن طريق عكس الزجاجة (انظر جدولالمواد). ضع 100 مل من كاشف بقع كوماسي لتغطية الجل الحل واحتضان الجل على منصة هزازة لمدة ساعة واحدة.
  4. تخلص من الماء منزوع الأيونات. كرر خطوة الغسيل 2x أكثر. الاستمرار في غسل الجل حتى يتم ملاحظة القرار المطلوب من العصابات البروتين.

10. الفضة تلطيخ

  1. تفكيك جهاز هلام الغربية. شريحة وتجاهل هلام التراص، وترك هلام حل سليمة. نقل بلطف هلام حل إلى صينية نظيفة مليئة 25 مل من الماء النقي جدا.
  2. قم بحضانة الجل على منصة هزازة لمدة 15 دقيقة. تخلص من الماء النقي جدًا وكرر خطوة الغسيل 2x أكثر.
    ملاحظة: إذا بقيت فقاعات SDS بعد خطوات الغسيل، يمكن غسل الجل في الماء النقي للغاية بين عشية وضحاها. SDS المتبقية يمكن أن يسبب تلطيخ خلفية عالية من هلام.
  3. إصلاح هلام في 30٪ الإيثانول: 10٪ محلول حمض الخليك (6:3:1 المياه: الإيثانول: حمض الخليك) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. اغسل الجل في محلول إيثانول 10% لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استبدال محلول الإيثانول وغسل لمدة 5 دقائق أخرى.
  4. إعداد حل العمل الحساس من مجموعة البقع الفضية بيرس عن طريق خلط جزء واحد من الفضة وصمة عار مع 500 أجزاء المياه فائقة النقي (50 درجة مئوية من الحساسية مع 25 مل من المياه فائقة النقي). قم بحضانة الجل المحلول في محلول العمل الحساس لمدة دقيقة واحدة.
  5. إعداد حل العمل وصمة عار عن طريق خلط جزء واحد الفضة وصمة عار محسن مع 50 أجزاء وصمة عار الفضة (500 درجة مئوية من محسن مع 25 مل من وصمة عار الفضة). احتضان هلام في حل العمل وصمة عار لمدة 30 دقيقة.
  6. إعداد المطور حل العمل عن طريق خلط 1 جزء الفضة وصمة عار محسن مع 50 أجزاء الفضة وصمة عار المطور (500 درجة مئوية من محسن مع 25 مل من المطور). إعداد 5٪ محلول حمض الخليك كحل وقف. اغسل الجل بالماء النقي لمدة دقيقة واحدة، واستبدل الماء، واغسل الجل لمدة دقيقة إضافية.
  7. استبدل الماء بمحلول عمل مطور واحتضن حتى يتم حل كثافة النطاق البروتيني المطلوب (5 دقائق). استبدال حل عمل المطور مع وقف الحل وحضانة لمدة 10 دقيقة.

11. في هلام الحد، الألكيلية، والهضم من العصابات هلام الملون Coomassie

  1. قطع عصابات هلام من هلام باستخدام شفرة الحلاقة نظيفة. قطع كل شريط هلام إلى مكعبات 5 ملم تقريبا ووضعها في أنبوب الطرد المركزي دقيقة 0.5 مل نظيفة.
  2. Destain قطع هلام من خلال تغطيتها مع بيكربونات الأمونيوم 100 M في 1:1 acetonitrile: الماء في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة.
  3. تجفيف قطع هلام لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي فراغ. تقليل البروتينات عن طريق تغطية قطع هلام المجففة مع 10 mm dithiothreitol في 100 MM بيكربونات الأمونيوم واحتضانها لمدة 1 ساعة في 56 درجة مئوية.
  4. ماصة قبالة أي supernatant. الألكيلية البروتينات من خلال تغطية قطع هلام مع 100 mm يودواسيتاميد في الماء واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  5. ماصة قبالة supernatant وتقليص قطع هلام من خلال تغطيتها مع acetonitrile ويهز لهم بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  6. كرر الخطوة 11.5. تجفيف قطع هلام لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي فراغ.
  7. تغطية قطع هلام مع 50 نانوغرام / ميكرولتر تسلسل الصف المعدلة تريبسين (انظر جدولالمواد) في 100 mM بيكربونات الأمونيوم. السماح للهلام تنتفخ لمدة 5 دقائق. ثم، ماصة قبالة أي حل المتبقية. تغطية قطع هلام مع 100 M بيكربونات الأمونيوم والسماح لهم ريسويل تماما، مضيفا إضافية 100 M بيكربونات الأمونيوم حتى يتم تغطية قطع هلام تماما.
  8. احتضان قطع هلام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. وقف رد الفعل عن طريق إضافة 1/10 من حجم حمض الفورميك 10٪ في الماء. جمع supernatant من كل أنبوب.
  9. استخراج قطع هلام عن طريق تغطيتها مع 1٪ حمض الفورميك في 60٪ acetonitrile وحضانة لهم لمدة 15 دقيقة مع هز لطيف.
  10. تقليل حجم supernatants مجتمعة إلى أقل من 20 درجة مئوية في جهاز طرد مركزي فراغ، مع الحرص على تجنب تجفيف supernatants تماما. إضافة 1٪ حمض الفورميك لجعل الحجم الإجمالي مرة أخرى إلى 20 درجة مئوية.

12- التصوير اللوني السائل/قياس الطيف الكتلي

ملاحظة: تم تحليل العينات باستخدام مطياف كتلة مجهزة بـ HPLC فائقة، ومصدر نانوبخاخ، وعمود (انظر جدولالمواد). المذيبات A و B هي 0.1٪ حمض الفورميك في الماء وacetonitrile، على التوالي.

  1. تحميل البروتينات المهضومة في قارورة البولي بروبلين autosampler عالية الانتعاش. تحميل قارورة في مدير عينة من نظام UPLC.
  2. حقن 6 ميكرولتر من كل عينة. تحميل كل عينة على عمود المحاصرين من nanotile لمدة 1.5 دقيقة في 8 درجة مئوية / دقيقة، وذلك باستخدام 99٪ المذيبات A /1٪ المذيبات B.
  3. Elute الببتيدات في مطياف الكتلة مع التدرج الخطي من 3٪ إلى 35٪ من المذيبات B أكثر من 30 دقيقة، تليها التدرج من 35٪ إلى 50٪ من المذيبات B أكثر من 4 دقائق و 50٪ إلى 90٪ من المذيب B أكثر من 1 دقيقة. ثم خفض ٪ B مرة أخرى إلى 3٪ أكثر من 5 دقيقة.
  4. الحصول على بيانات المواصفات المواصفات الخصائص ية الأيون ية إيجابية في وضع الدقة (20,000 دقة). الحصول على البيانات من 100 إلى 2000 دا بمعدل مسح واحد كل 0.6 ثانية. الحصول على البيانات في وضع MSE عن طريق عمليات المسح بالتناوب مع عدم وجود طاقة الاصطدام والمسح الضوئي مع ارتفاع طاقة الاصطدام.
  5. بالنسبة لطاقة الاصطدام المرتفعة، قم بمنحدر طاقة الاصطدام في خلية الفخ من 15 فولت إلى 40 فولت. الحصول على ملف بيانات باستخدام حقن فارغة من المذيبات A، وذلك باستخدام نفس طريقة اكتساب بين كل زوج من العينات للسيطرة على ترحيل.

13- تحليل البيانات من أجل قياس الطيف الكتلي

  1. نسخ ملفات نتائج قياس الطيف الكتلي إلى الكمبيوتر الذي يقوم بتشغيل منصة أبحاث البروتيوميات الكمية والنوعية (على سبيل المثال، خادم ProteinLynx العالمي). تحليل البيانات كثيف ة وحدة المعالجة المركزية وينبغي أن يتم على كمبيوتر تحليل بيانات منفصل وعالي الأداء.
  2. إنشاء مشروع جديد للبيانات. إنشاء لوحة ميكروتيدر جديدة تمثل لوحة autosampler. تعيين العينات إلى نفس الموضع في لوحة ميكروتيدر كما موضعها في autosampler.
  3. تعيين كل معلمات معالجة نموذج. المعلمات لاستخدام هي عرض الذروة الكروماتوغرافية التلقائي والقرار MSTOF؛ عتبة منخفضة الطاقة، 100 التهم؛ عتبة الطاقة المرتفعة، 5 التهم؛ عتبة الكثافة، 500 التهم.
  4. تعيين كل معلمات سير عمل نموذج. المعلمات التي يمكن استخدامها هي قاعدة البيانات، SwissProt البشرية المتسلسلة وفيروس نقص المناعة البشرية، مع تسلسل عكس؛ الببتيد التلقائي والتسامح جزء. دقيقة أجزاء أيون مباريات لكل ببتيد، 3؛ دقيقة أجزاء أيون مباريات لكل بروتين، 7؛ الحد الأدنى من الببتيد مباريات لكل بروتين، 1؛ كاشف هضمي أساسي، التربسين. غاب انشقاقات، 1؛ الكواشف المعدل الثابتة، كارباميدوميثيل C؛ متغير معدّل الكواشف، الأكسدة M؛ معدل اكتشاف كاذبة، 100.
  5. حدد العينات واختر معالجة أحدث البيانات الخام. عند اكتمال البحث، حدد العينات واختر تصدير البيانات إلى سقالة (الإصدار 3). فتح سقالة،إنشاء ملف جديد، واستيراد كل ملف تصديرها من منصة بروتيومياتك كعينة حيوية جديدة باستخدام الكم أيون السلائف.
  6. عند استيراد كافة الملفات، انتقل إلى شاشة تحميل وتحليل البيانات. حدد نفس قاعدة البيانات المستخدمة للبحث واستيراد البيانات باستخدام سجل LFDR وتجميع البروتين القياسي على نطاق التجربة. تعيين خيارات العرض إلى احتمال تحديد البروتين، وعتبة البروتين إلى 20٪، والحد الأدنى لعدد الببتيدات إلى 1، وعتبة الببتيد إلى 0٪ خلال التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم فحص الطفرات الأرجينين أحادية ومتعددة النقاط، المقابلة لمجموعة متنوعة من أنماط التعريب دون الخلوية، في قدرتها على التفاعل مع عوامل المضيف الخلوية بالمقارنة مع WT Rev. WT Rev-3'flag وpcDNA-flag تم التعبير عن متجه في ثقافة HLfB. تمت معالجة مجمعات البروتين من كامل الليسات الخلية وملطخة بكاشف وصمة عار الفضة. يمكن الكشف عن علم Rev-NoLS-3 (حوالي 18 كيلوداً) في ثلاثة ظروف عازلة مختلفة للإستليس تحتوي على تركيزات مختلفة من حمض الكلس (137 مليمتر و200 مليمتر و300 مليمتر) في الشكل1. B23 كان ق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقييم التحليلات الطيفية الكتلية التي تقارن بين طفرات Rev-NoLS وWT Rev في وجود فيروس نقص المناعة البشرية-1 لفهم العوامل النووية التي تنطوي عليها دورة النسخ المتماثل الفيروسي. وهذا من شأنه أن يحدد المكونات النووية اللازمة للعدوى الفيروسية. Nucleolar B23 لديه تقارب عالية إلى Rev-NoLS ووظائف في توطين النيوكليولار من Rev3 والنقل nucleocytoplasmic من Rev-bound HIV mRNAs22. تم تقييم تقارب B23 مع الطفرات Rev-NoLS، التي تحتوي على بدائل أرجينين واحدة أو متعددة، من خلال الترسيب الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وينوه المؤلفون بالدكتورة باربرا ك. فيلبر والدكتور جورج ن. بافلاكيس للثقافة الملتصقة بـ HLfB التي يوفرها برنامج المعاهد الوطنية للصحة للبحوث والكاشفات المرجعية، شعبة الإيدز، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية الأمراض (NIAID)، المعاهد القومية للصحة. ويعترف أصحاب البلاغ أيضاً بالمصادر المالية التي قدمتها المعاهد الوطنية للصحة، والمنح AI042552 وAI029329.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الخليكفيشر الكيميائيةA38S-212
الأسيتونيتريلفيشر الكيميائيةA955-500
أكريلاميد: بيساكريلاميدبيوراد1610158
بيكربونات الأمونيومفيشر الكيميائيةA643-500
بيرسلفات الأمونيومسيجما ألدريتش7727-54-0
تقارب مضاد للعلم M2 جلSigma-AldrichA2220
ماوس أحادي النسيلة M2 مضاد للعلم IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS فيلمCarestream8294985
Bio-Rad Bio-Rad مركز صبغة الصبغة ، 450 ملBio-Rad5000006
B23 ماوس أحادي النسيلة IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126
قرنفل حليب مجفف خالي من الدسمنستلهN / A
مكشطة خليةThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTile columnWaters186003763
Corning 100 مم أطباق الثقافة المعالجة TCفيشر Scientific08-772-22
DithiothreitolThermo J1539714
1 × DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Estern الركيزة نشافبيرس32106
الإيثانول ، 200 دليلفيشر الكيميائيةA409-4
FBSGibco16000044
حمض الفورميكفيشر الكيميائيةA117-50
كاشف وصمة عار زرقاء GelCodeThermoFisher24590
GlycerolFisher Chemical56-81-5
IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
IodoacetamideACROS Organics122270050
KimWipe ممسحة مهمة حساسةكيمبرلي كلارك بروفيشنال34120
L-glutamineGibco25030081
ميثانولفيشر كيميكال67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN / A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15-mL أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلينFalcon352097
سلم بروتين ملون مسبقا ، 10 إلى 180 كيلو دالتونThermo Scientific26616
كوكتيل مثبط البروتيازروش4693132001
المنقى BSAنيو إنجلاند بيولابسB9001
PVDF & nbsp ؛ غشاء النشاف الغربيروش3010040001
بيروفات الصوديومجيبكو11360070
10 × تيرابايتفيشر الكواشف الحيويةBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 محلول المنظفاتBioRad1610407
مصدر تريزايكووترN / A
تريبسين-EDTAكورنينج25-051-CIS
توين 20BioRad1706531
Synapt G2 مطياف الكتلةWatersN / A
Whatman ورق ترشيحTisch Scientific10427813
العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Rev HIV 1 Rev Rev NoLS B23 Nucleophosmin Nucleolin C23 snoRNA C D Box 58 Coomassie Staining

مقالات ذات صلة