تقييم انتشار Keratinocyte على عمليات ثنائية وثلاثية الأبعاد في النوع الأول من ركائز الكولاجين

تشمل الأنسجة الضامة فراغي ثلاثي الأبعاد meshwork البروتين لتكوين غير المتجانسة، المقام الأول يتألف من نوع أنا ييفات الكولاجين¹. تلعب دوراً رئيسيا سقالة للخلايا^1،،من²³ ييفات الكولاجين والتفاعل مع سائر البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM)³. في المختبر، ومختلف أشكال النوع الأول يمكن استخدام الكولاجين كركائز لثقافة الخلية تبعاً للتعامل مع الأسلوب^1،2،،من³⁴. في ظل الظروف الحمضية، النوع الأول الكولاجين يحافظ النموذج غير الليفي⁵. طلاء سطح الأطباق الثقافة بالشكل غير الليفي يعزز خلية التصاق وانتشار^6،7. في الأس الهيدروجيني الفسيولوجي، ودرجة الحرارة، النوع الأول من جزيئات الكولاجين يحشدوا في ييفات التي تشكل المواد الهلامية تمتلك هيكل ثلاثي الأبعاد^1،2،،من^{34، 56،،،}من⁷⁸. وهناك عدة الهامة الاختلافات بين فيبريل وأشكال غير الليفي من النوع أنا الكولاجين، بما في ذلك تصلب مصفوفة والكفاءة لتعمير مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة بالخلايا أثناء الثقافة¹. تصلب المصفوفة أحد العوامل التنظيمية درس أكثر من خلية الثقافة^{1، 9}. ومع ذلك، تظل التفاعلات المعقدة بين ركائز والخلايا إلى توضيح. دراسة التفاعلات المعقدة بين الخلايا والعوامل البيئية، نظام بسيط مفيدة. مقارنة بين سلوك الخلوية في شكلين مختلفين من الكولاجين قد تساعد على تبسيط أثر العوامل البيئية. تبعاً لغرض استخدامها، وأشكال مختلفة من نوع أنا الكولاجين بشكل انتقائي استخدامها. عادة الكيراتينيه على اتصال الغشاء ولكن ليس مع النوع الأول من الكولاجين. ومع ذلك، أثناء التئام الجروح، نقل الخلايا الكيراتينيه للنسيج الضام الجلدي، تتكاثر، والتئام الجرح¹⁰.

في الآونة الأخيرة، أثبتنا أن تركيز الكالسيوم خارج الخلية مهم لانتشار keratinocyte خط الخلايا باستخدام نظام الثقافة في شكل فيبريل النوع الأول من الكولاجين محاكاة النسيج الضام الجلدي¹¹. عند السطر الخلايا keratinocyte FEPE1L-8 كان مثقف في شكل فيبريل النوع الأول من الكولاجين، شكل الخلايا جولة وتوقفت عن بروليفيريشنز بتركيز كالسيوم خارج الخلية من 30 ميكرو¹¹. عندما زاد تركيز الكالسيوم إلى 1.8 مم، كان نمو الخلايا المستردة¹¹. الخلايا نمت تحت كلا تركيزات الكالسيوم (30 ميكرومتر و 1.8 مم) عند مثقف في النموذج غير الليفية¹¹، في حين أنهم كانوا أكثر حساسية لتركيز الكالسيوم خارجية عند مثقف في النموذج فيبريل. FEPE1L-8 تم إنشاؤها عن طريق تعداء مع فيروس الورم الحليمي نوع 16 تحويل الجينات E6 و E7 من سرطان عنق الرحم البشري، غير الورمية، تمنع انتشار غير محدود مع التمايز محدود المحتملة مثل الكيراتينيه العادي ^12،13. يمكن الحفاظ على الخلايا FEPE1L-8 باستخدام بعض أنواع keratinocyte المتوسطة المحددة، بما في ذلك نوع K110-الثاني مع الملحق المضافة K-1 (K110)⁶. هنا، يمكننا وصف البروتوكول الثقافة خط الخلايا keratinocyte البشرية في غير الليفي وأشكال فيبريل من النوع الأول من الكولاجين.

1-إعداد keratinocyte الثقافة المتوسطة

ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة.

1. إضافة 5 مل من البنسلين والستربتوميسين و 10 مل من الملحق K-1 المضافة إلى 500 مل من نوع K110-الثاني المتوسط (K110) استخدام ماصة.

2-إعداد النموذج فيبريل من النوع الأول من الكولاجين

ملاحظة: تنفيذ الإجراءات حتى الخطوة 2.6 تحت ظروف معقمة.

1. يبقى 10 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS (-)) والمياه والكولاجين، ولوحة ثقافة 96-جيدا وأنبوب 2 مل فارغة على الجليد.
   ملاحظة: لا تستخدم نفس اللوحة لإعداد فيبريل وأشكال غير الليفي.
2. إضافة 1.12 مل مياه إلى أنبوب فارغ 2 مل باستخدام ماصة. إضافة 200 ميليلتر من 10 x PBS (-) المياه في الأنبوب 2 مل باستخدام ماصة. بلطف يهز الأنبوبة عدة مرات.
3. إضافة مل 0.66 الكولاجين إلى أنبوب 2 مل باستخدام ماصة. تهز بلطف وبسرعة الأنبوبة عدة مرات.
   ملاحظة: تجنب تكوين فقاعة في الحل بقدر الإمكان. إعداد الحل الكولاجين مباشرة قبل استخدامها.
4. من أجل 100 ميليلتر من الحل الكولاجين من الخطوة 2، 3 في كل من لوحة الثقافة 96-جيدا جيدا. بلطف يهز لوحة الثقافة في يسار إلى الاقتراح اليمنى.
   ملاحظة: تغطي كامل السطح من الآبار مع الحل الكولاجين. إذا كان الحل لا تغطي كامل السطح، نشر الحل باستخدام تلميح ماصة. تجنب تكوين فقاعة في الحل بقدر الإمكان.
5. ضع لوحة الثقافة في حاضنة₂ CO واحتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 الاختيار جيليشن الكولاجين ونقل لوحة الثقافة إلى هيئة نظيفة.
   ملاحظة: تأكيد جيلاتيون بإمالة لوحة الثقافة.
6. بلطف من أجل 150 ميليلتر من K110 على المواد الهلامية استخدام ماصة على طول جدار البئر، مكان لوحة في حاضنة₂ CO الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 نقل لوحة الثقافة إلى منضدة نظيفة. قبل زراعة الخلايا، بلطف تجاهل K110 استخدام ماصة.
   ملاحظة: لحماية المواد الهلامية، ينبغي لمس غيض ماصة جدار البئر.

3-إعداد النموذج غير الليفي من النوع الأول من الكولاجين

ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة.

1. إضافة 4 ميليلتر من الكولاجين إلى 1.2 مل من 1 ملم حمض الهيدروكلوريك (HCl) في أنبوب 1.5 مل واستخدام ماصة مزيج بلطف.
   ملاحظة: إعداد الكولاجين مباشرة قبل استخدامها. الحفاظ على الكولاجين و HCl مبردة حتى وقت الاستخدام.
2. صب 100 ميليلتر من الكولاجين في كل بئر من لوحة الثقافة 96-جيدا باستخدام ماصة. بلطف يهز لوحة الثقافة في يسار إلى حق الحركة واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
   ملاحظة: تأكد من أن تغطي كامل السطح من الآبار مع الحل.
3. بعد الاحتضان، تجاهل الحل الكولاجين وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني (-) مرتين باستخدام ماصة.
4. من أجل 150 ميليلتر من 1% البقري الزلال/برنامج تلفزيوني (-) (1% جيش صرب البوسنة) إلى بئر للوحة الثقافة 96-جيدا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة حاء – 1 قبل زراعة الخلايا، وتجاهل جيش صرب البوسنة 1%.
   ملاحظة: تأكد من أن تغطي كامل السطح من الآبار مع الحل.

4-ثقافة FEPE1L-8 خلايا

ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة.

1. الحفاظ على FEPE1L-8 خلايا في K110 في 100 مم طبق في حاضنة₂ CO الثقافة والمحتضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂، إلى شبه كونفلوينسي.
2. إعداد K110، التربسين، ومثبطات التربسين في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
3. بعناية إزالة المتوسطة من طبق الثقافة وأضف 3 مل التربسين 0.05% استخدام ماصة، ضع الطبق في حاضنة₂ CO واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد الحضانة، تحقق من مفرزة الخلية من السطح الطبق الثقافة باستخدام مجهر تباين المرحلة في 10 x التكبير.
   ملاحظة: يصبح جولة مورفولوجيا الخلايا المنفصلة. إذا كان انتشار الخلايا، احتضانها لفترة إضافية مدتها 5 دقائق.
4. أضف 3 مل مثبطات التربسين وجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب الطرد مركزي 15 مل باستخدام ماصة. الطرد المركزي الخلايا في أنبوب الطرد مركزي 15 مل في 200 غ س لمدة 5 دقائق.
5. تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 10 مل K110 استخدام ماصة. عد الخلايا باستخدام مجهر تباين المرحلة في 10 x التكبير وإعداد تركيز الخلية في 5.0 × 10⁴ خلايا/مل بتمييع المناسبة مع K110.
6. بلطف البذور 0.1 مل K110 مع الخلايا في كل من لوحة الثقافة باستخدام ماصة على طول جدار البئر جيدا. ضع لوحة الثقافة في حاضنة₂ CO واحتضان في 37 درجة مئوية للمرة المشار إليها (2 ح، أيام 1، 3).
   ملاحظة: لحماية المواد الهلامية، ينبغي لمس غيض ماصة جدار البئر.

5-تقدير عدد خلايا قابلة للحياة

1. احتضان K110 في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. 130 ميكس ميليلتر الملح tetrazolium، 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2 tetrazoliumح ، أحادية الصوديوم الملح (WST-8)، ومل 1.3 من K110 في أنبوب 2 مل باستخدام ماصة.
2. نقل لوحة الثقافة إلى منضدة نظيفة وتجاهل K110 برفق باستخدام ماصة. يغسل برفق الخلايا غير ملتصقة مع K110 باستخدام ماصة
3. إضافة 110 ميليلتر من K110 مختلطة مع WST-8 في كل جيدا باستخدام ماصة ووضع لوحة الثقافة في حاضنة₂ CO احتضانها في 37 درجة مئوية ح 2.
4. نقل لوحة الثقافة إلى منضدة نظيفة وجمع 100 ميليلتر من المتوسط مكيفة من كل بئر ونقله إلى بئر آخر لوحة الثقافة 96-جيدا. قياس امتصاص في طول موجي 450 نانومتر (OD₄₅₀) باستخدام قارئ الميكروسكوبية وتقدير عدد خلايا قابلة للحياة.

تمثيل تخطيطي للسطوح من أطباق الثقافة باستخدام النوع الأول من الكولاجين هو مبين في الشكل 1. خلية مورفولوجيس لاحظ في الأشكال غير الليفي وفيبريل ترد في لوحات الجانب الأيسر والأيمن من الشكل 2، على التوالي. كانت مثقف FEPE1L-8 خلايا ح 2 (لوحات العلوي) و 3 أيام (أفرقة أقل). في ح 2 الأولى من استزراع، انضمت الخلايا وتنتشر في كل أشكال الكولاجين (الشكل 2، لوحات العلوي). ثلاثة أيام بعد البذر، واصل الخلايا على الشكل غير ليفية تنتشر وخلية أرقام زيادة (الشكل 2، اللوحة اليسرى السفلي). وفي المقابل، أظهرت الخلايا على شكل فيبريل محدودة الانتشار (الشكل 2، اللوحة اليسرى السفلي). FEPE1L-8 خلايا تتكاثر في الشكل غير الليفي من نوع الكولاجين (الشكل 3، خط أسود متصل، أغلقت الدوائر السوداء) والسطوح على الطبق غير المعالجة (الشكل 3، منقط الخط الرمادي، دوائر رمادية مغلقة). وفي المقابل، لا تتكاثر الخلايا في النموذج فيبريل (الشكل 3، خط منقط، الدوائر المفتوحة). تم تعديل الشكل 2 و الشكل 3 من فوجيساكى et al11.

الشكل 1 : التمثيل التخطيطي الأسطح طبق ثقافة التعامل مع نوع أنا الكولاجين- في ظل الظروف الحمضية، النوع الأول من الكولاجين هي تمتز الجزيئات على سطح طبق في الشكل غير الليفي (اللوحة اليمنى). ظروف محايدة في 37 درجة مئوية، النوع الأول من الكولاجين يتم تجميعها في ييفات الجزيئات وتمتز على سطح الأطباق على شكل هلام (اللوحة اليمنى). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : مورفولوجيا الخلايا FEPE1L-8- FEPE1L-8 خلايا في K110 كان مثقف باستخدام النموذج غير الليفي (10 ميكروغرام/مل؛ ولوحات اليسار) أو نموذج فيبريل (1 ملغ/مل؛ لوحات الحق) من النوع الأول من الكولاجين ح 2 (لوحات العلوي) أو 3 أيام (أفرقة أقل). أشرطة بيضاء تشير إلى 100 ميكرومتر. الشكل 2 تم تعديل من فوجيساكى وآخرون في الشكل 1ه – ح11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : انتشار الخلايا FEPE1L-8- وقدرت عدد خلايا قابلة للحياة في الشكل غير الليفي (الخط الأسود الصلب، دوائر شغلها أسود) أو على فيبريل النموذج (الخط المنقط، دائرة مفتوحة) من النوع الأول من الكولاجين، أو الأسطح طبق غير المعالجة (الخط المنقط الرمادي، دوائر تعبئة رمادية) 2 ح، اليوم 1، و 3 أيام. وأجريت تجارب في تريبليكاتيس ويتم عرض القيم كوسيلة + التنمية المستدامة. لقد تم تعديل هذا الرقم من فوجيساكى وآخرون في الشكل 1ي11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.