مقالة منهجية

تقييم انتشار Keratinocyte على عمليات ثنائية وثلاثية الأبعاد في النوع الأول من ركائز الكولاجين

DOI:

10.3791/59339

⸱

أبريل 22, 2019

 ,  ,  , 
1Nippi Research Institute of Biomatrix, 2Department of Anatomy and Cell Biology, Osaka Medical College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، على بروتوكول لإعداد نموذجين مختلفين من ركائز ثقافة الاستفادة من النوع الأول من الكولاجين. اعتماداً على كيفية معالجة الكولاجين، جزيئات الكولاجين أما الإبقاء على شكل ثنائي الأبعاد، وغير ليفية أو يحشدوا في شكل ثلاثي الأبعاد، فيبريل. النوع الأول من انتشار الخلايا في الكولاجين تتأثر جذريا بتشكيل فيبريل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النوع الأول من الكولاجين، مفيدة كركيزة للثقافة الخلية، توجد في شكلين: شكل ثنائي الأبعاد، وغير ليفية وثلاثية الأبعاد، فيبريل النموذج. يمكن إعداد النماذج معا بنفس النوع الأول من الكولاجين. وبصفة عامة، يشجع النموذج غير الليفي التصاق الخلايا وانتشارها. يوفر النموذج فيبريل (الهلام) أكثر الظروف الفسيولوجية في أنواع عديدة من الخلايا؛ ولذلك، ثقافة جل مفيد لدراسة السلوكيات الفسيولوجية للخلايا، مثل فعالية المخدرات.

الباحثون تحديد الشكل المناسب طبقاً للغرض من استخدامها. على سبيل المثال، في حالة الخلايا الكيراتينيه، استخدمت الثقافة في جل كجرح الشفاء النموذجي. FEPE1L-8، خط خلايا keratinocyte مثقف في النموذج غير الليفي من النوع أنا الكولاجين، وتعزيز التصاق الخلية. جدير بالذكر أن انتشار keratinocyte أبطأ في شكل فيبريل النموذج غير الليفي. بروتوكولات للتحضير للنوع الأول من الكولاجين لثقافة الخلية بسيطة ولها تطبيقات واسعة تبعاً للاحتياجات التجريبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشمل الأنسجة الضامة فراغي ثلاثي الأبعاد meshwork البروتين لتكوين غير المتجانسة، المقام الأول يتألف من نوع أنا ييفات الكولاجين1. تلعب دوراً رئيسيا سقالة للخلايا1،،من23 ييفات الكولاجين والتفاعل مع سائر البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM)3. في المختبر، ومختلف أشكال النوع الأول يمكن استخدام الكولاجين كركائز لثقافة الخلية تبعاً للتعامل مع الأسلوب1،2،،من34. في ظل الظروف الحمضية، النوع الأول الكولاجين يحافظ النموذج غير الليفي5. طلاء سطح الأطباق الثقافة بالشكل غير الليفي يعزز خلية التصاق وانتشار6،7. في الأس الهيدروجيني الفسيولوجي، ودرجة الحرارة، النوع الأول من جزيئات الكولاجين يحشدوا في ييفات التي تشكل المواد الهلامية تمتلك هيكل ثلاثي الأبعاد1،2،،من34، 56،،،من78. وهناك عدة الهامة الاختلافات بين فيبريل وأشكال غير الليفي من النوع أنا الكولاجين، بما في ذلك تصلب مصفوفة والكفاءة لتعمير مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة بالخلايا أثناء الثقافة1. تصلب المصفوفة أحد العوامل التنظيمية درس أكثر من خلية الثقافة1، 9. ومع ذلك، تظل التفاعلات المعقدة بين ركائز والخلايا إلى توضيح. دراسة التفاعلات المعقدة بين الخلايا والعوامل البيئية، نظام بسيط مفيدة. مقارنة بين سلوك الخلوية في شكلين مختلفين من الكولاجين قد تساعد على تبسيط أثر العوامل البيئية. تبعاً لغرض استخدامها، وأشكال مختلفة من نوع أنا الكولاجين بشكل انتقائي استخدامها. عادة الكيراتينيه على اتصال الغشاء ولكن ليس مع النوع الأول من الكولاجين. ومع ذلك، أثناء التئام الجروح، نقل الخلايا الكيراتينيه للنسيج الضام الجلدي، تتكاثر، والتئام الجرح10.

في الآونة الأخيرة، أثبتنا أن تركيز الكالسيوم خارج الخلية مهم لانتشار keratinocyte خط الخلايا باستخدام نظام الثقافة في شكل فيبريل النوع الأول من الكولاجين محاكاة النسيج الضام الجلدي11. عند السطر الخلايا keratinocyte FEPE1L-8 كان مثقف في شكل فيبريل النوع الأول من الكولاجين، شكل الخلايا جولة وتوقفت عن بروليفيريشنز بتركيز كالسيوم خارج الخلية من 30 ميكرو11. عندما زاد تركيز الكالسيوم إلى 1.8 مم، كان نمو الخلايا المستردة11. الخلايا نمت تحت كلا تركيزات الكالسيوم (30 ميكرومتر و 1.8 مم) عند مثقف في النموذج غير الليفية11، في حين أنهم كانوا أكثر حساسية لتركيز الكالسيوم خارجية عند مثقف في النموذج فيبريل. FEPE1L-8 تم إنشاؤها عن طريق تعداء مع فيروس الورم الحليمي نوع 16 تحويل الجينات E6 و E7 من سرطان عنق الرحم البشري، غير الورمية، تمنع انتشار غير محدود مع التمايز محدود المحتملة مثل الكيراتينيه العادي 12،13. يمكن الحفاظ على الخلايا FEPE1L-8 باستخدام بعض أنواع keratinocyte المتوسطة المحددة، بما في ذلك نوع K110-الثاني مع الملحق المضافة K-1 (K110)6. هنا، يمكننا وصف البروتوكول الثقافة خط الخلايا keratinocyte البشرية في غير الليفي وأشكال فيبريل من النوع الأول من الكولاجين.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد keratinocyte الثقافة المتوسطة

ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة.

  1. إضافة 5 مل من البنسلين والستربتوميسين و 10 مل من الملحق K-1 المضافة إلى 500 مل من نوع K110-الثاني المتوسط (K110) استخدام ماصة.

2-إعداد النموذج فيبريل من النوع الأول من الكولاجين

ملاحظة: تنفيذ الإجراءات حتى الخطوة 2.6 تحت ظروف معقمة.

  1. يبقى 10 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS (-)) والمياه والكولاجين، ولوحة ثقافة 96-جيدا وأنبوب 2 مل فارغة على الجليد.
    ملاحظة: لا تستخدم نفس اللوحة لإعداد فيبريل وأشكال غير الليفي.
  2. إضافة 1.12 مل مياه إلى أنبوب فارغ 2 مل باستخدام ماصة. إضافة 200 ميليلتر من 10 x PBS (-) المياه في الأنبوب 2 مل باستخدام ماصة. بلطف يهز الأنبوبة عدة مرات.
  3. إضافة مل 0.66 الكولاجين إلى أنبوب 2 مل باستخدام ماصة. تهز بلطف وبسرعة الأنبوبة عدة مرات.
    ملاحظة: تجنب تكوين فقاعة في الحل بقدر الإمكان. إعداد الحل الكولاجين مباشرة قبل استخدامها.
  4. من أجل 100 ميليلتر من الحل الكولاجين من الخطوة 2، 3 في كل من لوحة الثقافة 96-جيدا جيدا. بلطف يهز لوحة الثقافة في يسار إلى الاقتراح اليمنى.
    ملاحظة: تغطي كامل السطح من الآبار مع الحل الكولاجين. إذا كان الحل لا تغطي كامل السطح، نشر الحل باستخدام تلميح ماصة. تجنب تكوين فقاعة في الحل بقدر الإمكان.
  5. ضع لوحة الثقافة في حاضنة2 CO واحتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 الاختيار جيليشن الكولاجين ونقل لوحة الثقافة إلى هيئة نظيفة.
    ملاحظة: تأكيد جيلاتيون بإمالة لوحة الثقافة.
  6. بلطف من أجل 150 ميليلتر من K110 على المواد الهلامية استخدام ماصة على طول جدار البئر، مكان لوحة في حاضنة2 CO الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 نقل لوحة الثقافة إلى منضدة نظيفة. قبل زراعة الخلايا، بلطف تجاهل K110 استخدام ماصة.
    ملاحظة: لحماية المواد الهلامية، ينبغي لمس غيض ماصة جدار البئر.

3-إعداد النموذج غير الليفي من النوع الأول من الكولاجين

ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة.

  1. إضافة 4 ميليلتر من الكولاجين إلى 1.2 مل من 1 ملم حمض الهيدروكلوريك (HCl) في أنبوب 1.5 مل واستخدام ماصة مزيج بلطف.
    ملاحظة: إعداد الكولاجين مباشرة قبل استخدامها. الحفاظ على الكولاجين و HCl مبردة حتى وقت الاستخدام.
  2. صب 100 ميليلتر من الكولاجين في كل بئر من لوحة الثقافة 96-جيدا باستخدام ماصة. بلطف يهز لوحة الثقافة في يسار إلى حق الحركة واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
    ملاحظة: تأكد من أن تغطي كامل السطح من الآبار مع الحل.
  3. بعد الاحتضان، تجاهل الحل الكولاجين وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني (-) مرتين باستخدام ماصة.
  4. من أجل 150 ميليلتر من 1% البقري الزلال/برنامج تلفزيوني (-) (1% جيش صرب البوسنة) إلى بئر للوحة الثقافة 96-جيدا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة حاء – 1 قبل زراعة الخلايا، وتجاهل جيش صرب البوسنة 1%.
    ملاحظة: تأكد من أن تغطي كامل السطح من الآبار مع الحل.

4-ثقافة FEPE1L-8 خلايا

ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة.

  1. الحفاظ على FEPE1L-8 خلايا في K110 في 100 مم طبق في حاضنة2 CO الثقافة والمحتضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2، إلى شبه كونفلوينسي.
  2. إعداد K110، التربسين، ومثبطات التربسين في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  3. بعناية إزالة المتوسطة من طبق الثقافة وأضف 3 مل التربسين 0.05% استخدام ماصة، ضع الطبق في حاضنة2 CO واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد الحضانة، تحقق من مفرزة الخلية من السطح الطبق الثقافة باستخدام مجهر تباين المرحلة في 10 x التكبير.
    ملاحظة: يصبح جولة مورفولوجيا الخلايا المنفصلة. إذا كان انتشار الخلايا، احتضانها لفترة إضافية مدتها 5 دقائق.
  4. أضف 3 مل مثبطات التربسين وجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب الطرد مركزي 15 مل باستخدام ماصة. الطرد المركزي الخلايا في أنبوب الطرد مركزي 15 مل في 200 غ س لمدة 5 دقائق.
  5. تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 10 مل K110 استخدام ماصة. عد الخلايا باستخدام مجهر تباين المرحلة في 10 x التكبير وإعداد تركيز الخلية في 5.0 × 104 خلايا/مل بتمييع المناسبة مع K110.
  6. بلطف البذور 0.1 مل K110 مع الخلايا في كل من لوحة الثقافة باستخدام ماصة على طول جدار البئر جيدا. ضع لوحة الثقافة في حاضنة2 CO واحتضان في 37 درجة مئوية للمرة المشار إليها (2 ح، أيام 1، 3).
    ملاحظة: لحماية المواد الهلامية، ينبغي لمس غيض ماصة جدار البئر.

5-تقدير عدد خلايا قابلة للحياة

  1. احتضان K110 في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. 130 ميكس ميليلتر الملح tetrazolium، 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2 tetrazoliumح ، أحادية الصوديوم الملح (WST-8)، ومل 1.3 من K110 في أنبوب 2 مل باستخدام ماصة.
  2. نقل لوحة الثقافة إلى منضدة نظيفة وتجاهل K110 برفق باستخدام ماصة. يغسل برفق الخلايا غير ملتصقة مع K110 باستخدام ماصة
  3. إضافة 110 ميليلتر من K110 مختلطة مع WST-8 في كل جيدا باستخدام ماصة ووضع لوحة الثقافة في حاضنة2 CO احتضانها في 37 درجة مئوية ح 2.
  4. نقل لوحة الثقافة إلى منضدة نظيفة وجمع 100 ميليلتر من المتوسط مكيفة من كل بئر ونقله إلى بئر آخر لوحة الثقافة 96-جيدا. قياس امتصاص في طول موجي 450 نانومتر (OD450) باستخدام قارئ الميكروسكوبية وتقدير عدد خلايا قابلة للحياة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثيل تخطيطي للسطوح من أطباق الثقافة باستخدام النوع الأول من الكولاجين هو مبين في الشكل 1. خلية مورفولوجيس لاحظ في الأشكال غير الليفي وفيبريل ترد في لوحات الجانب الأيسر والأيمن من الشكل 2، على التوالي. كانت مثقف FEPE1L-8 خلايا ح 2 (لوحات العلوي) و 3 أيام (أفرقة أقل). في ح 2 الأولى من استزراع، انضمت الخلايا وتنتشر في كل أشكال الكولاجين (الشكل 2، لوحات العلوي). ثلاثة أيام بعد البذر، واصل الخلايا على الشكل غير ليفية تنتشر وخلية أرقام زيادة (الشكل 2، اللوحة اليسرى السفلي). وفي المقابل، أظهرت الخلايا على شكل فيبريل محدودة الانتشار (الشكل 2، اللوحة اليسرى السفلي). FEPE1L-8 خلايا تتكاثر في الشكل غير الليفي من نوع الكولاجين (الشكل 3، خط أسود متصل، أغلقت الدوائر السوداء) والسطوح على الطبق غير المعالجة (الشكل 3، منقط الخط الرمادي، دوائر رمادية مغلقة). وفي المقابل، لا تتكاثر الخلايا في النموذج فيبريل (الشكل 3، خط منقط، الدوائر المفتوحة). تم تعديل الشكل 2 و الشكل 3 من فوجيساكى et al11.

figure-results-1
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي الأسطح طبق ثقافة التعامل مع نوع أنا الكولاجين- في ظل الظروف الحمضية، النوع الأول من الكولاجين هي تمتز الجزيئات على سطح طبق في الشكل غير الليفي (اللوحة اليمنى). ظروف محايدة في 37 درجة مئوية، النوع الأول من الكولاجين يتم تجميعها في ييفات الجزيئات وتمتز على سطح الأطباق على شكل هلام (اللوحة اليمنى). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
الشكل 2 : مورفولوجيا الخلايا FEPE1L-8- FEPE1L-8 خلايا في K110 كان مثقف باستخدام النموذج غير الليفي (10 ميكروغرام/مل؛ ولوحات اليسار) أو نموذج فيبريل (1 ملغ/مل؛ لوحات الحق) من النوع الأول من الكولاجين ح 2 (لوحات العلوي) أو 3 أيام (أفرقة أقل). أشرطة بيضاء تشير إلى 100 ميكرومتر. الشكل 2 تم تعديل من فوجيساكى وآخرون في الشكل 1ه – ح11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-3
الشكل 3 : انتشار الخلايا FEPE1L-8- وقدرت عدد خلايا قابلة للحياة في الشكل غير الليفي (الخط الأسود الصلب، دوائر شغلها أسود) أو على فيبريل النموذج (الخط المنقط، دائرة مفتوحة) من النوع الأول من الكولاجين، أو الأسطح طبق غير المعالجة (الخط المنقط الرمادي، دوائر تعبئة رمادية) 2 ح، اليوم 1، و 3 أيام. وأجريت تجارب في تريبليكاتيس ويتم عرض القيم كوسيلة + التنمية المستدامة. لقد تم تعديل هذا الرقم من فوجيساكى وآخرون في الشكل 1ي11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعض مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، بما في ذلك النوع الأول من الكولاجين، وهياكل المجراة في1من نموذج ثلاثي الأبعاد. استزراع في هذه الثلاثية الأبعاد، يوفر الركيزة جل الظروف الفسيولوجية أكثر في المنطقةس من على سطح ثنائي الأبعاد، والبلاستيك1،2،،من34. أبلغ عن بروتوكولات عديدة فيما يتعلق بالأسلوب الثقافة هلام، مثل استخدام النوع الأول من الكولاجين1،2،،من34،،من67، 11والنوع الرابع الكولاجين14،15ماتريجيل16. النوع الأول من الكولاجين مادة محددة تحديداً جيدا، وتستخدم على نطاق واسع بسبب وفرة وسهولة التعامل. ملامح نوع المنقي أنا الكولاجين تعتمد على الحيوان الأنواع، والعمر، وتنقية الأساليب5،17. النوع الأول من الكولاجين يمكن تنقيته باستخدام حمض الخليك و/أو البروتياز، مثل بيبسن وغراء بروكتاسي5،17. وتحتفظ الكولاجين القابل للذوبان في حمض الأمينية تيلوبيبتيديس والكولاجين القابل للذوبان في حوزتي هي ملصوق الأمينية تيلوبيبتيديس5،17. محجوز طول الأمينية تيلوبيبتيديس يعتمد على النوع البروتياز، ووجود تيلوبيبتيديس يؤثر على مورفولوجيا فيبريل وهلام5،القوة17. لزوجة ييفات الكولاجين القابل للذوبان في حمض أكبر من المعالجة بحوزتي collagens17. في هذه الدراسة، ونحن المستخدمة قابلة للذوبان في حمض الأبقار في النوع الأول من الكولاجين. يمكن أيضا استخدام الكولاجين بيبسن solubilized في هذا البروتوكول الثقافة جل؛ ومع ذلك، هو قوام جل أضعف17. يمكن أن يسبب هذه الاختلافات في المواد الاختلافات السلوكية الخلية، بل أنها حاليا ليست مفهومة جيدا.

البروتوكول الثقافة هلام، المذكورة في هذه الدراسة بسيط جداً. وأبلغ العديد من التعديلات لهذا الأسلوب. يتم تعديل ممكن واحد للثقافة الكيراتينيه لتقليد الغشاء الطابق السفلي. قد يكون من الأفضل للحفاظ على بنية الغشاء مثل الركيزة في المختبر15،18الجل الكولاجين النوع الرابع. ومع ذلك، مطلوب فترة حضانة طويلة تحضيرا للنوع الرابع الكولاجين الجل14،،من1518. بدلاً من ذلك، خلط الكولاجين النوع الرابع مع النوع الأول من المواد الهلامية الكولاجين يمكن أن تنتج ركائز الثقافة رواية (النوع الأول/النوع الرابع الكولاجين الهجين الهلام)19. هذه المواد الهلامية الهجين من السهل التعامل معها، وتحتاج إلى فترة زمنية قصيرة جيلاتيون، وتسفر عن مزيد من الشروط مثل غشاء الطابق السفلي للخلايا الكيراتينيه. في النوع الأول/النوع الرابع الكولاجين الهجين الهلام، الكيراتينيه البقاء على قيد الحياة، وتشكل مستعمرات، ويحفز التمايز المحطة الطرفية19. يحتوي هذا الأسلوب الهجين التطبيقات المتنوعة.

الثقافة في جل باستخدام النوع الأول من الكولاجين يؤثر على الخلايا السرطانية. في النموذج فيبريل من النوع الأول من الكولاجين، التنشيط Akt ونمو الخلايا كربونات الكالسيوم-2 (خط خلية سرطان القولون) وقمعت7. وباﻹضافة إلى ذلك، يلقي القبض على نمو الخلايا البشرية سرطان الجلد (M24met) على شكل فيبريل في نقطة تفتيش G1/S20. وعلاوة على ذلك، لوحظت مستويات زيادة ملحوظة للأنواع الأكسجين التفاعلية في برياديبوسيتيس موريني 3T3-L1 مثقف في النموذج فيبريل. وعلاوة على ذلك، يتم تحفيز تكاثر الخلايا والهجرة في اتجاهين معاكسين بغير الليفي وأشكال فيبريل من النوع الأول من الكولاجين21.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشعر بالامتنان للدكتور ك. سيكيجوتشي (معهد "بحوث البروتين"، جامعة أوساكا)، د. م. يامادا (معهد "بحوث البروتين"، جامعة أوساكا)، د. ت. إيكيجيما (الصين واليابان أبحاث المعهد من الطبية والعلوم الصيدلية، كلية ويا الابتكار، وجامعة شنيانغ الصيدلانية) و "هاياشي ت." (الصين واليابان أبحاث معهد للطب والعلوم الصيدلية، كلية ويا للابتكار، جامعة شنيانغ الصيدلانية) التعليقات المفيدة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الألبومين ، من مصل الأبقار (BSA)Merck KGaAA4503
1٪ BSA   ؛Merck KGaAA4503قم بإذابة 1 جم من مسحوق BSA في 100 مل من PBS (-) والترشيح   ؛
مجموعة عد الخلايا -8Dojindo Molecular Technologies، Inc.347-07621ملح تيترازوليوم ، 2- (2-ميثوكسي -4-نيتروفينيل) -3- (4-نيتروفينيل) -5- (2،4-ثنائي سولفوفينيل) -2H & nbsp ؛ التيترازوليوم ، ملح أحادي الصوديوم (WST-8)   ؛
الكولاجين من النوع الأول (كولجين قابل للذوبان في الحمض)شركة Nippi Inc.ASC-1-100-20من الأبقار (أي نوع آخر متاح ، التركيز 3.0 مجم / مل
وحدة تصفية غشاء يمكن التخلص منه DISMIC خلات السليلوزADVANTEC Co.، LTD.25CS020AS0.2 & micro; م حجم المسام
الإنسان خلية خط الكيراتيناتي  FEPE1L-8  تبرع الدكتور دبليو جي كارتر (مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان ، سياتل ، واشنطن)   ؛    
K-1كيوكوتو سياكو28204مكمل إضافي مع 500 مجم من BSA ، 500 مجم من مستخلصات الغدة النخامية البقرية ، 2.5 مجم من الأنسولين ، 0.05 & micro ؛ ز من h-EGF و 5 ملغ من الهيبارين
K110 النوع الثاني المتوسطKyokuto Seiyaku Inc.28204الثقافة القاعدية للخلايا الكيراتينية  
K110 النوع الثاني متوسط مع K-1 والبنسلين ستربتومايسين (K110)Kyokuto Seiyaku Inc.28204إضافة 5 مل من البنسلين الستربتومايسين و 10 مل من المكملات المضافة (K-1) في 500 مل من وسط الاستزراع القاعدي للخلايا الكيراتينية من النوع الثاني K110  
برنامج تلفزيوني (-) Merck KGaAP-5368قم بإذابة كيس واحد من مسحوق PBS (-) في 1000 مل من الماء منزوع الأيونات والترشيح ؛
10x PBS (-)Merck KGaAP-5368قم بإذابة كيس واحد من مسحوق PBS (-) في 100 مل من الماء منزوع الأيونات والترشيح   ؛
البنسلين ستربتومايسينMP Biomedicals، LLC167004910000 وحدة / مل من البنسلين G و 10,000 مو ؛ جم / مل من كبريتات الستربتميسين في محلول ملحي فسيولوجي
فوسفات محلول ملحي معتمد من الأداء الحيوي ، درجة الحموضة 7.4Merck KGaAP-5368-10 عبوة
التربسين من البنكرياس الخنزيرMerck KGaAT4799
0.05٪ التربسين   ؛Merck KGaAT4799يذوب 0.25 جم من  التربسين و  0.186 جم من EDTA.2Na في 500 مل من PBS (-)  والترشيح 
مثبط التربسين من فول الصوياFUJIFILM Wako Pure Chemical corporation202-20123
مثبط التربسين  شركة فوجي فيلم واكو بيور كيميكالكوربوريشن 202-20123إذابة 50 مجم من مثبط التربسين و 500 مجم من BSA في 500 مل من PBS (-) والترشيح   ؛
شركة وسط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
  2. Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
  3. Kleinman, H. K., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. Haralsonand, M. A., Hassell, J. R. , IRL Press. Oxford. 289-301 (1995).
  4. Yamato, M., Hayashi, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. , 123-140 (1998).
  5. Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
  6. Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
  7. Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
  8. Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
  9. Shih, Y. -R., Tseng, K. F., Lai, H. -Y., Lin, C. -H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
  10. Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784(2013).
  11. Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
  12. Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
  13. Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
  14. Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
  15. Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
  16. Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922(2014).
  17. Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
  18. Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
  19. Japan Institute of leather Research and Osaka University. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. , 2489375 (11F019-EP) (2015).
  20. Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
  21. Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

WST 8 FEPE1L 8

مقالات ذات صلة