Method Article

نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر وخط أنابيب حسابي لتحديد الإمكانات الأوعية الدموية لالذرية البطانية المشتقة من iPSC

DOI:

10.3791/59342

⸱

May 13th, 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الذرية البطانية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSC-EPs) لديها القدرة على إحداث ثورة في علاجات أمراض القلب والأوعية الدموية وتمكين خلق نماذج أكثر إخلاصا لأمراض القلب والأوعية الدموية. هنا، يتم وصف تغليف iPSC-EPs في البيئات الدقيقة الكولاجين ثلاثية الأبعاد (3D) وتحليل كمي للإمكانات الأوعية الدموية لهذه الخلايا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) هي مصدر خلايا التكاثري خاص بالمريض يمكن أن يفرق في أي نوع من الخلايا الجسدية. وقد استمدت من كل من الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة الخلايا الجذعية المتعددة القوى، التي يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا اللازمة لتجميع الأوعية الدموية الناضجة والوظيفية. ومع ذلك، لم يتم تقييم هذه الخلايا بدقة في بيئات ثلاثية الأبعاد، ولا يزال المقياس الكمي لإمكاناتها الأوعية الدموية بعيد المنال. هنا، يتم أولاً تحديد توليد وعزل iPSC-EPs عن طريق فرز الخلايا الفلورية المنشطة، تليها وصف للتغليف وثقافة iPSC-EPs في هيدروجيلات الكولاجين. هذه المصفوفة خارج الخلية (ECM) -محاكاة البيئة الدقيقة تشجع على استجابة الأوعية الدموية قوية; شبكات الأوعية الدموية تشكل بعد أسبوع من الثقافة. ويتم تحديد إنشاء خط أنابيب حسابي يستخدم برمجيات مفتوحة المصدر لتحديد كمية هذه الاستجابة الأوعية الدموية. تم تصميم خط الأنابيب هذا خصيصًا للحفاظ على البنية ثلاثية الجوانب للشبكة الشعرية لتحديد عدد الفروع ونقاط التفرع وطول الشبكة الإجمالي مع الحد الأدنى من مدخلات المستخدم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت الخلايا البطانية الوريد السري البشري (HUVECs) وأنواع الخلايا البطانية الأولية الأخرى لمدة عقدين لنمذجة الأوعية الدموية تنبت والتنمية في المختبر1. هذه المنصات الوعائية وعد لإلقاء الضوء على الآليات الجزيئية والأنسجة على مستوى أمراض القلب والأوعية الدموية، ويمكن أن تقدم نظرة فسيولوجية في تطوير شبكات الأوعية الدموية البدائية2،3. على الرغم من أن مجال النمذجة الوعائية قد شهد تقدما كبيرا، فإن اختبار "المعيار الذهبي" الذي يمكن أن نموذج كميا وتقييم تطور الأوعية الدموية الفسيولوجية لا يزال بعيد المنال. معظم البروتوكولات المنشورة لا تلخص بشكل كاف محراب الأوعية الدموية لتشجيع تشكيل الأو....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية وحلول الطلاء

  1. لإعداد محلول طلاء فيترونيكستين، تمييع فيتروينشينسين 1:100 في المالحة السالينة المخزنة بالفوسفات (DPBS) في دولبيكو.
    تحذير: بمجرد تخفيفه، لا ينصح بتخزين هذا الحل للاستخدام في المستقبل.
  2. عند تلقي الفينول خالية من الأحمر، عامل النمو خفض خليط البروتين الجيلاتيني (انظر جدولالمواد) من الشركة المصنعة، ذوبان على الجليد في 4 درجة مئوية حتى الخليط شفاف ة والسائل. الحفاظ على الخليط على الجليد في غطاء تدفق اللامينار، ماصة 75 درجة مئوية من الخليط في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.8 مل وتجميد في -20 درجة مئوية على الفور. يمكن تخزين هذه aliquots لمدة تصل إلى سنة واحدة.
    تحذير: يصبح خليط البروتين الجيل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد التمايز (الشكل1)،FACS وتغليف iPSC-EPs في هيدروجيلات الكولاجين، وسوف تبقى الخلايا عادة تقريب لمدة 24 ساعة قبل البدء في الهجرة وتشكيل التجويف الأولي. بعد حوالي 6 أيام من الثقافة، سوف تكون الضفيرة الشعرية البدائية مرئية فيهيدروجيل عندما ينظر إليها مع المجهرية برايتفيلد (الشكل 2). بعد تصوير هيدروجيلات ثابتة وملطخة بالخلايا على مجهر بؤري (فيلم1، فيلم تكميلي1)، يتم تحويل الصور المعالجة مسبقًا إلى هيكل عظمي يتيح تحل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتضمن هذا البروتوكول ثقافة الخلايا على المدى الطويل في ثلاثة أنواع من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا: E8، LaSR Basal، وEGM-2. ولذلك، ينبغي توخي الحذر الشديد لتعقيم جميع المواد بشكل مناسب. بالإضافة إلى ذلك، يجب ارتداء معاطف المختبر والقفازات التي يتم تنظيفها بالإيثانول دائمًا عند العمل في غطاء تدفق اللامينار في المختبر. من المستحسن أن اختبار في كثير من الأحيان لتلوث الميكوزالات; إذا لوحظت كمية كبيرة من الحطام أثناء ثقافة iPSC أو لوحظ انخفاض مفاجئ في كفاءة التمايز، فإن تلوث الميكوزلا هو السبب المحتمل. وتميل الـ iPSC-EPs المتو.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (منحة رقم 15SDG25740035، منحت لJ.Z.)، والمعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية (NIBIB) من المعاهد الوطنية للصحة (منحة رقم EB007507، منحت إلى C.C.)، و التحالف من أجل البحث والتدريب في مجال إعادة التأهيل التجديدي (AR3T، منحة رقم 1 P2C HD086843-01، منحت لJ.Z.). نود أن نعرب عن تقديرنا للبروفيسورة جين ستاشوياك (جامعة تكساس في أوستن) على مشورتها التقنية بشأن الفحص المجهري البؤري. كما أننا ممتنون للمناقشات مع صموئيل ميهيليتش (جامعة تكساس في أوستن)، والدكتورة أليسيا ألين (جامعة تكساس في أوستن)، والدكتورة جولي ريتلوفسكي (التكنولوجيا الحيوية التكيفية)، والدكتور ليون بيلان (جامعة فاندربيلت) لبصيرتهم في التحليل الحسابي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
& - الشريحة تكوين الأوعيةIbidiN / Aتتيح لوحة زراعة الأنسجة المسطحة ذات القاع الزجاجي ذات الجدران الجانبية التصوير متحد البؤر السهلة
96 جيدا ، قاع دائري ، صفيحة دقيقة منخفضة للغاية ، معقمةCorning7007يمنع ارتباط الهلاميات المائية بالكولاجين المحملة بالخلايا بطبق زراعة الخلايا
AccutaseSTEMCELL Technologies7920حل انفصال الخلية اللطيف. لا يحط من حلقات خارج الخلية الحيوية ل FACS
Advanced DMEM/F12Thermo Scientific12634010الوسائط الأساسية لتمايز iPSC-EP. 
Barnstead GenPure xCAD Plus 50136165 Thermo Fisher Scientific؛ يمكن استبدال البعض الآخر بسهولة
بمحلول ألبومين مصل الأبقار ، 7.5٪ في DPBS ، معقم مفلتر ، BioXtra ، مناسب لزراعة الخلايافيشر ScientificA8412للحفاظ على جدوى الخلية عند فرز FACs
CD34-PE ، الإنسان (استنساخ: AC136)Miltenyi Biotec130-098-140الجسم المضاد المستخدم لعزل FACs ل iPSC-EPs
CHIR99021LC LaboratoriesC-6556يحفز تكوين الأديم المتوسط من الخلايا الجذعية متعددة القدرات
الكولاجين الأول ذيل الفئران عالي البروتين 100 مجمVWR354249المكون الرئيسي لأنابيب
الطرد المركزي المخروطي ثلاثي الأبعاد (15/50 مل)فيشر ساينتفيك14-959-49D / Aتستخدم لتخزين وخلط كميات كبيرة نسبيا من الكواشف ووسائط
زراعة الخلاياDAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد)Thermo Fisher ScientificD1306لمواجهة وتصور نوى الخلية
DMEM / F12Thermo Fisher Scientific11320-082لتخفيف Matrigel وإذابة الخلايا الجذعية متعددة القدرات
Dulbecco's Dulbecco's Fusion-Buffer Fusion14190-250لغسل الثقافات أحادية الطبقة
EDTASigma-AldrichE8008لمرور مستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات ولمنع تراكم الخلايا عندما تقوم FACs بفرز
نمو الخلايا البطانية المتوسطة 2PromoCellC-22011يعزز صلاحية الخلايا البطانية وتكاثرها
أساسي 8 متوسطثيرو فيشر العلميA1517001   للحفاظ على الخلايا الجذعية متعددة القدرات
Glycine ، BioUltra ، للبيولوجيا الجزيئية ، > = 99.0٪ (NT)Sigma-Aldrich50046يحيد المنظفات المتبقية
حمض L-Ascorbic 2-فوسفات sesquimagnesium ملح هيدرات ، > = 95٪Sigma-AldrichA8960مكون وسيط التمايز iPSC-EP
MATLABMathWorks1.8.0_152بيئة الحوسبة العددية متعددة النماذج (مجانية متوفرة في معظم المؤسسات الأكاديمية)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 مل (خليط البروتين الجيلاتيني)356231 فيشر Scientificالمخفف في DMEM / F12 لطلاء الألواح لتمايز iPSC-EP
متوسط -199 10XThermo FisherScientific1825015 يستخدم لموازنة الأسمولية النهائية للهيدروجيل وأنابيب الطرد المركزي الدقيق الأس الهيدروجيني
(1.7 مل)VWR87003-294يخزن كميات صغيرة من الكواشف
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجما ألدريتشP3813المكون الرئيسي لمحاليل التلوين المناعي
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)15140122العضوي الحراري فيشر العلميالمستخدم بعد الفرز لإزالة التلوث المحتمل من أداة FACS
المؤتلف البشري VEGF 165 بروتينR & D Systems293-VEMitogen الذي يحفز تكاثر الخلايا البطانية وتكوين الأنابيب
Rhodamine phalloidinThemo Fisher ScientificR415لتحديد ترسب F-actin وبالتالي تحديد حدود شبكات الأوعية
Triton X-100 (خافض للتوتر السطحي غير أيوني)Sigma-AldrichX-100منظف يستخدم لاختراق الخلايا بلطف
Tween-20 (كاشف مستحلب)فيشر العلميBP337يزيد من خصوصية ربط الأجسام المضادة المضافة
VE-Cadherin (F-8)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-9989  لتحديد التجويف البطاني ثلاثي الأبعاد في هيدروجيل الكولاجين
VitronectinThermoFisherA14700للحفاظ على الخلايا الجذعية متعددة القدرات
Y-27632Selleck ChemicalsS1049يحافظ على قابلية الخلايا الجذعية متعددة القدرات و iPSC-EP عند تفكيكها وإعادة زرعها
الدموية نظام تنقية المياه Fusion المضاد الحيوي الدموية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

iPSC Derived Endothelial ProgenitorsFluorescent Activated Cell SortingCollagen Hydrogel EncapsulationVasculogenic Potential Quantification3D Vascular Network FormationConfocal Microscopy AnalysisOpen Source Computational PipelineEndothelial Growth Medium 2ROCK Inhibitor Y 27632Vascular Endothelial Growth Factor

Related Articles