مقالة منهجية

عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل

DOI:

10.3791/59353

⸱

مايو 9, 2019

 , 
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية عزل خلايا القرنية الجلدية من نماذج الماوس، ووصمة عار مع الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية، وتحليل الخلايا الملونة عن طريق قياس الخلايا الشاملة من أجل تحديد نمط التعبير من البروتينات ذات الأهمية في مراحل دورة الخلية المختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن وقياس التغيرات في التعبير البروتين بطريقة تعتمد على دورة الخلية باستخدام خلايا واحدة معزولة عن البشرة من جلد الماوس. هناك سبع خطوات هامة: فصل البشرة عن الأدمة، وهضم البشرة، وتلطيخ مجموعات الخلايا الجلدية مع سيسبلاتين، والترميز عينة، وتلطيخ مع الأجسام المضادة المعدنية الموسومة لعلامات دورة الخلية والبروتينات من الفائدة، والكشف عن الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية عن طريق قياس الخلايا الشامل، وتحليل التعبير في مختلف مراحل دورة الخلية. ميزة هذا النهج على الأساليب النسيجية هي إمكانية تحليل نمط التعبير من > 40 علامات مختلفة في خلية واحدة في مراحل مختلفة من دورة الخلية. كما يسمح هذا النهج لتحليل الارتباط متعدد المتغيرات للتعبير البروتيني الذي هو أكثر قابلية للقياس الكمي من أساليب النسيج/التصوير. العيب في هذا البروتوكول هو أن هناك حاجة إلى تعليق الخلايا المفردة، مما يؤدي إلى فقدان معلومات الموقع التي يوفرها تلطيخ أقسام الأنسجة. وقد يتطلب هذا النهج أيضاً إدراج علامات إضافية لتحديد أنواع الخلايا المختلفة في حالات تعليق الخلايا الخام. تطبيق هذا البروتوكول واضح في تحليل نماذج أمراض الجلد فرط البلاستيك. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحليل نوع فرعي محدد من الخلايا (مثل الخلايا الجذعية) بإضافة أجسام مضادة خاصة بالنسب. ويمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لتحليل خلايا الجلد في الأنواع التجريبية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال ارتباط التعبير الجيني بمراحل دورة الخلايا يشكل تحدياً في تحليل النماذج الحيوانية لأمراض فرط التنسج مثل السرطان. ويتمثل جزء من هذا التحدي في الكشف المشترك عن البروتينات ذات الأهمية مع علامات الانتشار. يمكن العثور على الخلايا التكاثرية في مراحل دورة الخلايا المختلفة بما في ذلك G1، S، G2، وM. Ki67 هي واحدة من علامات الانتشار الأكثر استخداما ويتم التعبير عنها في جميع مراحل دورة الخلية. وقد استخدمت على نطاق واسع في تحليل كلمن الإنسان والأنسجة الماوس 1،2،3. ومع ذلك، مثل غيرها من علامات الانتشار العامة، Ki67 لا يميز مراحل دورة الخلية الفردية. نهج أكثر دقة يستخدم دمج النظائر النيوكليوتيد الثيميدين مثل بروموديوكسيوريبين (BrdU) في الخلايا التي تكرر بنشاط الجينوم (أي المرحلة S)4،5. عيب واحد لاستخدام النظائر النيوكليوتيد هو الحاجة إلى إدارتها للعيش الحيوانات قبل ساعات من التحليل. يتم الكشف عن Ki67 وBrdU عادة على أقسام الأنسجة الثابتة عن طريق استخدام الأجسام المضادة. وتتمثل إحدى مزايا هذا النهج في أنه يمكن التأكد من موقع POIs داخل بنية الأنسجة (على سبيل المثال، الطبقة القاعدية من البشرة الجلدية). ولا يتطلب هذا النهج أيضاً تفكك الأنسجة الذي قد يؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني. أحد العيوب هو أن تثبيت الأنسجة أو معالجة الأنسجة لOCT المجمدة أو تقسيم البارافين قد occlude أهداف الأجسام المضادة (أي، مستضدات). استرجاع المستضدات يتطلب عادة الحرارة أو هضم الأنسجة. كما يمكن أن يكون تحديد حجم التلطيخ أمراً صعباً. ويرجع ذلك إلى الاختلافات في تلطيخ، سمك القسم، وكشف إشارة، والتحيز المجرب. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن عدد محدود من العلامات في وقت واحد في معظم التجهيزات المختبرية النموذجية. ومع ذلك، فإن نُهُج تلطيخ المضاعفات الأحدث تعد بالتغلب على هذه القيود؛ أمثلة هي التصوير قياس السيتومترية الجماعية وتضخيم إشارة التيراميد6،7.

قياس التدفق هو آخر التكنولوجيا القوية للكشف عن الخلايا المنتشرة. فإنه يسمح للكشف عن متعددة من علامات في نفس الخلايا ولكن يتطلب تفكك الأنسجة لمعظم أنواع الخلايا غير المكونة للدم. يتم تحليل الخلايا المتكاثرة بشكل روتيني باستخدام الأصباغ التي تربط الحمض النووي (على سبيل المثال، بروبيوديوم يوديد (PI))8. تدفق cytometry يسمح أيضا تحديد أكثر دقة من مراحل دورة الخلية عندما يقترن الكشف عن إدراج BrdU9. على الرغم من اتباع نهج قوي، BrdU / PI تدفق قياس السيتومترية لديها عيوبها. وهي غير قادرة على حل مرحلتي G2/M وG0/G1 دون إدراج أجسام مضادة خاصة بالمرحلة. ومع ذلك، فإن عدد الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها محدود بالفلورة الخلوية، والانتشار الطيفي لانبعاثات الفلوروفور، واستخدام ضوابط التعويض. هذا القيد علامات عليه أكثر تحديا وشاقة للكشف عن التعبير عن علامات دورة الخلية مع POIs. وهناك نهج أكثر سهولة هو استخدام قياس السيتومتري ة الشامل10،11. وتستخدم هذه التكنولوجيا الأجسام المضادة المترافقة المعدنية التي لها طيف كشف أضيق. مرة واحدة يتم تلوين الخلايا مع الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية، يتم تبخرها، والمعادن التي تم الكشف عنها عن طريق قياس الطيف الكتلي وقت الطيران (CyTOF). نظرًا لهذه الخصائص، يتيح قياس السيتومتري ة الكتلة الكشف المتعدد المضاعفات عن >40 علامة مختلفة باستخدام الأنظمة الأساسية الموجودة10و11 . وبالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن لعينات الباركود مع المعادن التي تؤدي إلى وفورات الأجسام المضادة الثمينة مع الحد من العينة إلى عينة تلطيخ تقلب. من ناحية أخرى، قياس السيتومتري ة الكتلة لديه العديد من العيوب. هناك عدد محدود من الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن المتاحة تجاريا للخلايا المشتقة من الدم غير الدم. القياس الكمي لمحتوى الحمض النووي أقل حساسية مقارنة باستخدام أصباغ الحمض النووي الفلورية والقياس الخلوي الشامل لديه مجموعة ديناميكية منخفضة من الكشف عن إشارة بالمقارنة مع قياس تدفق الفلورة.

تم تصميم البروتوكول الموضح هنا لتحليل ديناميات دورة الخلية من الخلايا الكيراتينية المعزولة حديثا (KCs) من جلد الماوس وتميز خلية دورة تعبير البروتين محددة في هذه الخلايا باستخدام قياس الخلايا الشامل. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضًا مع الخلايا المستزرعة أو تكييفه مع أنواع الخلايا الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للالحيوانات في جامعة كولورادو أنشوتز على التجارب الحيوانية الموصوفة في هذا البروتوكول.

1 - الأعمال التحضيرية

  1. تصميم لوحة الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية. استخدام الحرة على الانترنت لوحة تصميم البرمجيات12 وتشمل 127يودودوكيوريدين (IdU)، 164Dy (Dysprosium) وصفت المضادة للCCNB1 (CYCLIN B1)، 175لو (لوتيتيوم) فوسفو (ع)-HISTONEH3Ser28 (pHH3)، و 150 Nd (النيوديميوم)-pRETINOBLASTOMA البروتينSer807/811 (pRB)13. إضافة أجسام مضادة إضافية ذات علامات معدنية لا تتداخل في إشارة القناة14.
  2. إعداد حل أسهم IdU. حل مسحوق إيدو في 10 ملغ / مل في 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم في 60 درجة مئوية. Aliquot IdU الأوراق المالية الحل في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وتجميد في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    1. ضبط النتيجة الهيدروجينية للمحلول IdU إلى 7.5 مع 12 N حمض الهيدروكلوريك مباشرة قبل الاستخدام. اختبار مع شريط الحموضة على aliquot تجاهل لضمان الحل هو في pH 7.5.
      ملاحظة: الوقت لفترات طويلة (>5 دقيقة) من IdU في الحموضة 7.5 سيؤدي إلى هطول الأمطار وهناك حاجة aliquot جديدة من IdU عندما يحدث هذا.
    2. استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (على سبيل المثال، القفازات، معطف المختبر، ونظارات السلامة) والعمل في خزانة السلامة عند التعامل مع حلول هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك.
  3. إعداد 2X بارافورمالهايد (PFA) حل تحديد. الجمع بين 5 مل من 10X PBS (درجة الحموضة 7.5) و 1 مل من 16٪ PFA مع 44 مل من الصف الجزيئي النقي dH2O (3.2٪ التركيز النهائي).
    ملاحظة: يمكن إعداد مخزون من PFA كما نشرت سابقا15 أو شراء 16٪ من الأسهم خالية من المعادن الملوثة.
    1. استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والعمل في مجلس الوزراء السلامة عند التعامل مع مسحوق PFA والحلول.
  4. إعداد الباريوم (با2 +) مجانا 1X PBS عن طريق الجمع بين 5 مل من المعادن خالية PBS 10X (الرقم الهيدروجيني 7.5) مع 45 مل من الصف الجزيئي النقي dH2O.
    ملاحظة: إن نوعية PBS وغيرها من الكواشف مهمة جداً لتجنب تلوث المعادن التي يمكن أن تحدث ضوضاء في الخلفية أثناء تحليل البيانات السيتومترية الكتلية.
  5. إعداد 100 مل سيسبلاتين الأوراق المالية الحل. حل 300.5 ملغ من مسحوق سيسبلاتين في 10 مل من DMSO. يُحفظ في العليكوت عند -80 درجة مئوية. إعداد 10 مل cisplatin حل العمل للتجارب لاستخدامها أكثر من 1 د.
  6. إعداد حلول فصل البشرة / الأدمة. إعداد محلول مخزون dispase 20X عن طريق حل 30 ملغ في 1 مل من HBSS أو PBS. تصفية تعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في aliquots في -20 درجة مئوية. إعداد 1X نوع الرابع كولاجيناز الأوراق المالية الحل في 1 ملغ / مل في HBSS، تصفية تعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر، وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية.

2. وضع العلامات على المرحلة S من قبل تأسيس IdU

  1. وزن الفئران. استخدام P1-P3 الجرو حديثي الولادة أو 8-10 أسابيع الفئران الكبار القديمة واستخدام الفئران الذكور أو الإناث من C57BL/6، FvB، أو 129 خلفيات. تحديد جرعة في 0.1 ملغ إيدو (الحموضة 7.5) / ز وزن الجسم. على سبيل المثال، يتطلب ماوس 25 جم 0.25 مل من IdU.
  2. إدارة جرعة IdU عن طريق حقن داخل احصان الخلايا والانتظار لمدة 2 ساعة قبل حصاد الخلايا. استخدام حقنة درنة لحقن الجرو حديثي الولادة.
    ملاحظة: يمكن استخدام جرعة من 2 ملغ / مل من IdU مع خلايا زراعة الأنسجة مع حضانة 1 ساعة في 37 درجة مئوية قبل الحصاد ووضع العلامات للخلايا الجماعية.

3. عزل الخلايا لوضع العلامات

  1. ذوبان ديسباس وكولاجيناز حلول الأسهم. تخفيف محلول الأسهم ديسباسي 20X إلى 1X (1.5 ملغ / مل) في HBSS أو PBS معقمة. يُحفظ على الجليد حتى يصبح جاهزاً للاستخدام.
  2. الجمع بين 2 مجلدات من dispase مع 1 حجم الكولاجين في حجم إجمالي يسمح للبشرة لتطفو بحرية. على سبيل المثال، يمكن طرح هضم 5 جلود ماوس حديثي الولادة على 8 مل من 1x ديسباس مع 4 مل من الكولاجين في طبق بيتري 100 مم.
  3. اتبع الطرق المعتمدة لقتل الفئران التجريبية (على سبيل المثال، جرعة زائدة من الأيسوفلوران/ فحص قرصة القدم أو استنشاق ثاني أكسيد الكربون/خلع عنق الرحم). تنظيف جلد الأذن الكبار مع محلول اليود (انظر جدولالمواد) وشطف بالماء المعقم عندما الخلايا المعزولة لاستخدامها في زراعة الأنسجة.
  4. إزالة الأذن جراحيا في القاعدة (الشكل1A). شطف الأذنين في PBS معقمة عندما يتم استخدام الخلايا المعزولة لثقافة الأنسجة. توضع على طبق بيتري جاف 100 مم.
  5. فصل أمامي بعناية من الجلد الخلفي عن طريق إنشاء في البداية جيب في منتصف أو حافة منطقة القطع باستخدام ملقط غرامة وسحب اثنين من اللوحات الجلد بعيدا (الشكل 1B-D). المضي قدما مع كل من الجلود الأمامية والخلفية.
    ملاحظة: يتم توفير تعليمات مفصلة لتشريح جلد الفأر الوليدي من قبل Litchi وآخرون16 بالإضافة إلى ذلك، قد يساعد استخدام نطاق تشريح في فصل الأمامي من الجلد الخلفي وتحديد الجانبين البشرة / الجلد من تشريح الجلد: الشعر مرئي على الجانب البشرة في حين أن الأدمة سيكون لها مظهر الجيلاتين.
  6. وضع بعناية الجلود الأمامية والخلفية للأذن مع الجانب الأدمة من الجلد لمس محلول ديسباس / كولاجيناز (الشكل 1E). استخدم 1 مل لكل من الجلد الأمامي والخلفي لأذن واحدة لكل بئر من طبق ثقافة جيد 12. الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، بدلاً من ذلك، تطفو الجلود على محلول ديسباسي 1x عند 4 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
    ملاحظة: العمل في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة مع تقنية معقمة عندما الخلايا التي سيتم التتزرّعها.
  7. ضع يهضم الجلد مع الجانب البشرة لمس سطح طبق بيتري نظيفة. تسطيح الجلد والانزلاق بلطف الأدمة قبالة البشرة من خلال العمل من مركز إلى حواف في نمط دائري.
  8. تجاهل الأدمة أو هضمه كذلك لتحرير الخلايا الليفية لثقافة الأنسجة أو التحليل16.
    ملاحظة: الأدمة سوف تكون أكثر قتامة في المظهر ولها تكوين الجيلاتين ولزجة. يجب أن يأتي الأدمة بسهولة قبالة. الفشل أو صعوبة في إزالة الأدمة يشير إلى عدم كفاية هضم الأنسجة. ومع ذلك، فإن الحضانة الموسعة في المخزن المؤقت الهضم تقلل من قدرة الخلية على البقاء. سوف تبقى البشرة على طبق بيتري وسيكون لها مظهر ابيض.
  9. رفع بلطف قبالة البشرة عن طريق الاستيلاء على حواف وقشر قبالة سطح طبق بيتري. ضع البشرة بعناية على حل مفرزة الخلايا الدافئة مسبقاً (انظر جدولالمواد) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية أو 20 دقيقة في RT. استخدم 500 ميكرولتر من محلول مفرزة الخلايا لـ 2 من البشرة الأذن البالغة لكل بئر من لوحة ثقافة الآبار 12 واستخدام 750 ميكرولتر من مفرزة الخلايا حل لالبشرة حديثي الولادة واحد لكل بئر من 6 لوحة ثقافة جيدا.
  10. فهم البشرة باستخدام ملقط معقمة وفرك عن طريق سحب البشرة ضد الجزء السفلي من الطبق إلى فصل الخلايا. إضافة 1 مل من DMEM تحتوي على 1٪ FBS (0.01 مل) وتمر من خلال منخل خلية 40 ميكرومتر في أنبوب جمع. شطف جيدا مع 2 مل إضافية من DMEM وإضافة إلى تعليق الخلية.
  11. الطرد المركزي في 120 × ز لمدة 5 دقائق.
  12. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1-2 مل من DMEM تحتوي على 1٪ FBS. تحديد الخلية ونسبة حساب الخلايا الحية باستخدام الأزرق Trypan ومقياس الهيموكيتوميمتر أو جهاز العد الآلي. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 3.11.
    ملاحظة: يمكن زراعة الخلايا في وسائط زراعة الأنسجة المناسبة بعد الخطوة 3.12. 17 سنة

4. سيسبلاتين وضع العلامات لتحديد الخلايا الحية / الميتة

  1. إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا لكل 1 مل من DMEM تحتوي على 25 ميكرومتر سيسبلاتين (2.5 ميكرولتر من المخزون / مل). حضانة لمدة دقيقة واحدة وتبريد عن طريق الأنابيب مع حجم متساو من FBS (على سبيل المثال، 1 مل).
  2. الطرد المركزي في 120 × ز لمدة 5 دقائق Decant supernatant في كوب يحتوي على التبييض المخفف وأنابيب عكس لاستنزاف الحل المتبقي على منشفة ورقية. اضغط بلطف لتحرير الحل المتبقي على بيليه والجدار الجانبي للأنبوب.
  3. إعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من Ba+2خالية PBS. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 4.2.
    ملاحظة: من المستحسن إصلاح الخلايا إذا كان لا يمكن تلوينها فوراً.

5. تثبيت الخلايا وصفت سيسبلاتين (اختياري)

  1. إعادة تعليق 1-3 × 106 سيسبلاتين الخلايا المسماة في 1 مل من Ba+2خالية PBS. دوامة الخلايا تحت الطاقة المنخفضة المستمرة وإضافة إسقاط 1 مل (1 حجم) من المخزن المؤقت تثبيت PFA 2X. احتضان في RT لمدة 10 دقائق على منصة هزاز.
  2. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 4.2، ولكن الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
  3. غسل الخلايا مع 2 مل من Ba+2خالية PBS وخلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. كرر الخطوة 5.3 مرة واحدة.
  4. إعادة تعليق بيليه في 2 مل من Ba+2خالية PBS. تخزين في 4 درجة مئوية ل <3 د. إضافة FBS إلى 3٪ (على سبيل المثال، 0.3 مل من FBS / مل من الخلايا) من الحجم الإجمالي إذا تخزين أطول > 3 د، ثم مزيج وتجميد في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد يؤثر التثبيت على الكشف عن بعض الepitopes. يجب تحديد آثار التثبيت على إشارة الأجسام المضادة تجريبياً.

6. فك التشفير من العينات (اختياري ولكن الموصى بها)

  1. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2 ثم إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا في 1 مل من 1X تثبيت العازلة (انظر جدول المواد). حضانة في RT لمدة 10 دقيقة خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2.
  2. غسل الخلايا مع 1 مل من الباركود نفاذية العازلة (انظر جدولالمواد). خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. كرر الخطوة 6.2 مرة واحدة.
  3. إضافة 100 درجة مئوية من الباركود نفاذيبيليت العازلة إلى الباركود (انظر جدولالمواد)18 ومزيج على الفور في حين أن الخلايا من الخطوة 6.2 هي التكوير.
  4. إعادة تعليق بيليه الخلية في 800 درجة مئوية من الباركود نفاذية العازلة. إضافة حل الباركود إلى الخلايا، مزيج وحضانة في RT لمدة 30 دقيقة خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. غسل الخلايا في 2 مل من خلية تلطيخ العازلة (انظر جدولالمواد) وبيليه مرة أخرى.
    ملاحظة: يمكن تسمية ما يصل إلى 20 عينة مع تركيبات مختلفة من معادن البلاديوم18. ويرد وصف لاستراتيجيات الترميز الأخرى في أماكن أخرى15.

7. وضع العلامات على الخلايا للخلايا الشاملة

  1. إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا في 1 مل من المستضد النووي وصمة عار العازلة حل العمل (انظر جدول المواد). الجمع بين العينات في أنبوب واحد للخطوات اللاحقة عند استخدام عينات الباركود. حضانة في RT لمدة 30 دقيقة بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2.
  2. إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا في 2 مل من المستضد النووي تلطيخ نفاذية العازلة (انظر جدولالمواد). مقياس حسب الضرورة. على سبيل المثال، استخدم 6 مل من المخزن المؤقت لـ 10 عينات مدمجة مع عدد خلايا 9 × 106 خلايا. بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2.
  3. كرر الخطوة 7.2. دوامة بلطف بيليه الخلية في حجم المتبقية اليسار في الأنبوب.
  4. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا لكل 1-3 × 106 خلايا. مقياس حسب الضرورة. على سبيل المثال، استخدم 150 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لـ 10 عينات مجمعة مع عدد خلايا من 9 × 106 خلايا. مزيج وحضانة في RT لمدة 45 دقيقة إضافة 2 مل من الخلية تلطيخ العازلة وبيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2.
  5. إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا بيليه في 2 مل من الخلية تلطيخ العازلة. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. كرر الخطوة 7.5 مرة واحدة.
    ملاحظة: يمكن استخدام حلول عازلة أخرى لتلطيخ الغشاء خارج الخلية أو علامات السيتوبلازمية والمجربة قد يكون لتحسين تلطيخ إذا كانت هناك حاجة للكشف عن epitopes في مواقع خلوية مختلفة. يمكن أيضًا إصلاح الخلايا في PFA بعد الخطوة 7.5 عند استخدام الخلايا الحية للتلطيخ.
  6. إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا في 1 مل من محلول التشذيب وتخزينها لمدة 1-3 د عند 4 درجة مئوية.
    1. تخزين الخلايا في -80 درجة مئوية في DMSO تحتوي على الحل لخلايا بيليه > 3 د. كما هو موضح في الخطوة 5.2 إذا كانت الخلايا في حل التشبيك. إعادة تعليق بيليه (1-3 × 106 خلايا) في 1 مل من الخلية تلطيخ العازلة وخلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من 10٪ DMSO / 90٪ FBS19،نقل إلى التبريد، ووضع هافيحاوية تجميد isopropanol، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  7. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. غسل 1-3 × 106 الخلايا مع 2 مل من الخلية تلطيخ العازلة، بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. قم بإجراء غسلين إضافيين مع 2 مل من الماء، كما هو موضح في الخطوة 5.2.
  8. تخفيف الخرز معايرة EQ 1:9 في الماء (حل الأوراق المالية في 3.3 × 105 الخرز / مل).
  9. إعادة تعليق بيليه الخلية في تركيز 1 × 106 خلايا / مل مع تخفيف EQ حبة الحل. تصفية الخلايا من خلال 35 ميكرومتر أنابيب تدفق غطاء مصفاة.
  10. تشغيل عينات على مقياس السيتومتر الشامل والحصول على البيانات. سيتم إيداع البيانات بتنسيق ملف قياس التدفق Cytometry قياسي (FCS).

8 - تجهيز وتحليل ملفات بيانات القياس السيتومي الشامل

  1. تطبيع ملفات FCS. استخدام برنامج مجاني متاح في20 https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest
  2. Deconvolute الباركود ملفات FCS. فصل مجموعة الباركود المجمعة في ملفات الباركود منفصلة مع برنامج مجاني متاح في https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
  3. تحليل ملفات FCS التي تمت تسويتها. استخدم برامج تجارية21أو22 أو مجانية (انظر web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الجدول 1 الغلة المتوقعة للخلايا وجدوى الأذن الفأرة البالغة (الشكل 1) وجلد حديثي الولادة في ظروف غير مرضية. ويبين الجدول أيضا بيانات تمثيلية للأراضي من خلفية مختلطة من C57/126. ومن المتوقع أن الجلد من سلالات أخرى من شأنه أن يؤدي إلى غلة الخلايا مماثلة وحيوية. ويعتمد العائد التقريبي على المساحة السطحية للبشرة ويشير إلى أن جلد حديثي الولادة سيكونخياراً أفضل للتجارب التي تتطلب أعداداً أكبر من الخلايا (الجدول 1). انخفاض الغل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن إكمال البروتوكول الموضح في هذه الورقة في حوالي 8 ح. والنتيجة النهائية هي تعليق الخلايا المخصب في KCs التي يمكن تحليلها للتعبير عن البروتين بطريقة تعتمد على دورة الخلية. وقد حددت العديد من الدراسات السابقة طرق لعزل KCs من الجلد البشري والماوس16،25. وتشمل هذه الدراسات أيضا بروتوكولات لعزل KCs لتدفق قياس السيتومترية26. ومع ذلك، لم يتم وصف بروتوكول مفصل من قبل يجمع بين عزل ة KCs مع تحليل التعبير البروتيني وديناميات دورة الخلية باستخدام قي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وجاء الدعم لهذا العمل من قسم الأمراض الجلدية، ومركز غيتس للطب التجديدي في جامعة كولورادو وجامعة كولورادو (UC) مركز الأمراض الجلدية مورفولوجيا والنوى الفينوتين (NIAMS P30 AR057212). يقر المؤلفون بـ "مركز السرطان في جامعة كاليفورنيا" "الموارد المشتركة للسيتوميتري" ومنحة الدعم (NCI P30 CA046934) لتشغيل مقياس الخلايا الكتلي، وهم ممتنون لكارين هيلم وكريستين تشايلدز في صميم نصائحهم الخبيرة بشأن التدفق ومقياس الخلايا الشامل تقنيات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12 بئر لوحةمعالجة الخلية229512
حل IntercalatorFluidigm201192A125 & micro ؛ م - محلول الأشعة تحت الحمراء
المجهرالإلكتروني بارافورمالديهايد30525-89-416 ٪   ؛ أنابيب
تدفق غطاء المصفاةفيشر / كورنينج35223535 ومايكرو ؛ م حجم المسام 
غربال الخليةفيشر2236354740 مو ؛ م حجم المسام 
حل إزالة الخلاياCELLnTECCnT-ACCUTASE-100Accutase
ThermoFisher / Purdue67618-151-17البيتادين 7.5٪ اليود الجراحية
المقشر الباركود نفاذية المخزن المؤقت  Fluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd مجموعة الترميز الشريطي
الباركودFluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd مجموعة الترميز
الشريطي شرائط الأس الهيدروجيني EMD9590colorpHast
DMEMHycloneSH30022.01Dulbecco ' s تعديل النسر وسائل
الإعلام ملقط غرامةDumont & amp Fils0109-5-PODumostar # 5
ملقط دقيق منحنيDumont & Fils0109-7-PODumostar # 7
حبات المعايرةFluidigm201078EQ حبات معايرة أربعة عناصر
HBSSGibco14175-095محلول الملح المتوازن هانك
الماءفيشرSH30538.03Hyclone علم الأحياء الجزيئي درجة المياه
Iododeoxyuridine  قوارير SigmaI7125IdU
CryoThermoFisher366656PKالخيط الداخلي
خلية تلطيخ العازلةFluidigm201068Maxpar خلية تلطيخ العازلة
Fix & بيرم عازلةFluidigm201067Maxpar Fix & بيرم عازلة
Fix I عازلةFluidigm201065Maxpar Fix I عازلة
محلول ملحي مخزنRocklandMB-008حاوية تجميد الأيزوبروبانول خالية من المعادن 10x PBS
ThermoFisher5100-0001Mr.Frosty
هيدروكسيد الصوديومفيشرBP359-500طبق بيتري NaOH
Kord-Valmark2900مقدمة من Genesee 32-107 
15 مل مخروطيأوليمبوس / جينيسي28-101
50 مل مخروطيأوليمبوس / جينيسي28-106
آبار صفيحةمعالجة الخلية229506
سيسبلاتينسيجما479306
Dispase IIسيجما / روش4942078001
DMSOSigmaD2650
FBSAtlanta BiologicalsS11150
حمض الهيدروكلوريكفيشرA144-212
تلطيخ المستضد النوويFluidigm201063
النووي تلطيخ عازلةFluidigm201063
Trypan blueSigmaT8154
حقنةالسل BD309626
النوع الرابع كولاجيناز ورثينجتون بيوساينسCLSS-4
علوم PFA محلول اليود 6 المستضد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140(2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  8. Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
  9. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  10. Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
  12. http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
  13. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  14. Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
  15. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
  16. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  17. Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465(2016).
  18. Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  19. Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
  20. Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  21. http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
  22. http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
  23. Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
  24. Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
  25. Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
  26. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  27. Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  28. Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
  29. Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
  30. Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
  31. Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة