Method Article

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

DOI:

10.3791/59387

⸱

September 5th, 2019

 , 
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم استخدام الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد ثلاثي الدمنل لسبر المواقف المكانية ومسارات الحركة للبروتينات ذات العلامات الفلورية في الخلايا البكتيرية الحية. يحدد بروتوكول تحليل البيانات التجريبية الموضحة هنا السلوكيات المشتتة السائدة للبروتينات الخلوية استناداً إلى مسارات أحادية الجزيء مجمعة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسبر الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد موضع وحركات الجزيئات الفردية في الخلايا الحية مع عشرات النانومتر المكاني والاستبانة الزمنية المليثانية. هذه القدرات تجعل من جزيء واحد التعريب المجهري ة مناسبة بشكل مثالي لدراسة الوظائف البيولوجية على المستوى الجزيئي في البيئات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. هنا، نقوم بتوضيح بروتوكول متكامل لكل من الحصول على ومعالجة/تحليل بيانات تتبع جزيء واحد لاستخراج مختلف الدول المشتتة التي قد تظهر البروتين ذات الأهمية. ويمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد كمية تشكيل المعقدة الجزيئية في الخلايا الحية. نحن نقدم وصفا مفصلا لتجربة توطين جزيء واحد 3D المستندة إلى الكاميرا، فضلا عن خطوات معالجة البيانات اللاحقة التي تسفر عن مسارات الجزيئات الفردية. ثم يتم تحليل هذه المسارات باستخدام إطار تحليل عددي لاستخراج الحالات الانقباحية السائدة للجزيئات التي تحمل علامة الفلورسنت والوفرة النسبية لهذه الدول. ويستند إطار التحليل إلى عمليات محاكاة استوكاستك لمسارات الانتشار البنيداخل الخلايا التي تقتصر مكانياً على هندسة الخلايا التعسفية. استناداً إلى مسارات محاكاة، يتم إنشاء الصور الخام جزيء واحد وتحليلها بنفس الطريقة مثل الصور التجريبية. وبهذه الطريقة، فإن القيود التجريبية على الدقة والدقة، التي يصعب معايرة تجريبياً، تُدمج صراحة في سير عمل التحليل. يتم تحديد معامل الانتشار والكسور السكانية النسبية للحالات المشتتة السائدة عن طريق تركيب توزيعات القيم التجريبية باستخدام تركيبات خطية من التوزيعات المحاكاة. نحن نبرهن على فائدة بروتوكولنا من خلال حل الحالات المنافية للبروتين الذي يعرض حالات مختلفة من عدم الاكتراث عند تشكيل المجمعات المتجانسة والمتغايّرة القلة في السيتوسول من مسببات الأمراض البكتيرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسة السلوك المختلف للجزيئات الحيوية يوفر نظرة ثاقبة في وظائفها البيولوجية. أصبحت التقنيات المستندة إلى التنظير المجهري الفلوري أدوات قيمة لمراقبة الجزيئات الحيوية في بيئة الخلايا الأصلية الخاصة بها. الانتعاش الفلوري بعد تبييض الصور (FRAP) ومطياف الارتباط الفلوري (FCS)1 توفير السلوكيات الفرقية متوسط الفرقة. وعلى العكس من ذلك، فإن الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد يتيح مراقبة الجزيئات الفردية ذات العلامات الفلورية ذات الدقة المكانية والزمنية العالية2و3و4. مراقبة الجزيئات الفردية مفيد لأن البروتين من الفائدة قد توجد في حالات مختلفة من عدم الأهمية. على سبيل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. مزدوج الحلزون نقطة انتشار وظيفة المعايرة 2.

ملاحظة: يتم الحصول على الصور الموضحة في هذا القسم والأقسام التالية باستخدام مجهر الفلورة المقلوب المبني ة حسب الطلب، كما هو موضح في Rocha et al.23. نفس الإجراء ينطبق على تطبيقات المجهر المختلفة المصممة لتوطين جزيء واحد وتتبع المجهرية2،3،4. تتوفر كافة البرامج الخاصة بالحصول على الصور ومعالجة البيانات الموضحة في هذه المقالة (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

  1. إعداد منصات أغاروز لتركيب عينات على زلات غطاء زجاجي ليتم عرضها تح....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في ظل الظروف التجريبية الموصوفة هنا (20،000 لقطة، طول المسار الحد الأدنى من 4 التعريب) واعتمادا على مستويات التعبير من البروتينات الانصهار المسمى الفلورسنت، ما يقرب من 200-3،000 التعريب تسفر عن 10-150 يمكن إنشاء مسارات لكل خلية(الشكل 2a،ب). وهناك عدد كبير من المسارات اللازمة لإنتاج توزيع عينات جيدة من معاملات الانتشار الظاهرة. حجم FOV التي تم جمعها هنا هو ~ 55 × 55 ميكرومتر، مع 10 FOV التي تم جمعها في التجربة. لذلك، للحصول على >5,000 مسارا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والعامل الحاسم للتطبيق الناجح للبروتوكول المعروض هو ضمان فصل إشارات الجزيء الواحد بشكل جيد عن بعضها البعض (أي أنها تحتاج إلى أن تكون متفرقة في الفضاء وفي الوقت المناسب(Supplementary Mov. 1)). إذا كان هناك أكثر من جزيء مفلور واحد في خلية في نفس الوقت، ثم يمكن تعيين التعريب بشكل غير صحيح إلى مسار جزيئات أخرى. ويشار إلى هذا باسم مشكلة الربط30. يمكن اختيار الظروف التجريبية، مثل مستويات التعبير البروتيني وكثافة الليزر الإثارة لتجنب مشكلة الربط. ومع ذلك، ينبغي الحرص على الحصول على مستوي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أليسيا أكيموفيتش وتينغ يان على قراءتهما النقدية للمخطوطة. نشكر إد هول، كبير علماء الموظفين في مجموعة خدمات الحوسبة البحثية المتقدمة في جامعة فرجينيا، على المساعدة في إعداد إجراءات التحسين المستخدمة في هذا العمل. وقدمت جامعة فرجينيا التمويل اللازم لهذا العمل.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2،6-حمض ديامينوبيميليكChem Impex International5411ضروري لنمو الخلايا المعوية القولونية Y. < / em> المستخدمة.
عدسات 4fThorlabsAC508-080-Af = 80 مم ، 2 "
514 نانومتر ليزرمتماسكGenesis MX514 MTMاستخدم لإثارة التألق
agaroseInivtrogen16520100تستخدم لصنع وسادات هلامية لتركيب عينة بكتيرية سائلة على المجهر.
كلوريد الأمونيومسيجما ألدريتشA9434M2G المكون.
مسار الإثارة لمرشح ممر النطاقالترددي ChromaET510 / bp.
تسريب القلب في الدماغسيجما ألدريتش53286وسائط النمو ل Y. المعوية القولونية< / em>.
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتش223506مكون M2G.
كاميرامصدر التصويرDMK 23UP031الكاميرا لتصوير تباين الطور.
قناع الطور العازلالكهربائي Double Helix، LLCN / Aينتج إشارة DHPSF.
مكون فوسفات ثنائي الصوديومSigma Aldrich795410M2G.
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكفيشر ScientificS311-100مخلبات Ca2 + < / sup>. يحفز الإفراز في T3SS.
مرآة الوجهنيوبورت8892-Kيسمح بالتبديل بين مسارات تضان وتباين الطور.
fluospheresInvitrogenF8792حبات الفلورسنت. 540/560 أطوال موجية الانبعاث والانبعاث. قطر 40 نانومتر.
زلة الغطاء الزجاجيVWR16004-302# 1.5 ، 22 مم × 22 مم
الجلوكوزChem Impex International811M2G المكون.
زيت الغمرأوليمبوسZ-81025وضعت على عدسة موضوعية.
كبريتات الحديد (II)Sigma AldrichF0518M2G المكون.
مرشح التمرير الطويلSemrockLP02-514RU-25مسار الانبعاث.
كبريتات المغنيسيومفيشر S25414A العلميمكون M2G.
منصة المجهرCity Labsمنصة مخصصةللمجهر المقلوب.
حمض الناليديكسيكسيجما ألدريتشN4382Y. الخلايا المعوية القولونية< / em> المستخدمة مقاومة لحمض الناليديكسيك.
عدسة موضوعيةأوليمبوس1-U2B99160X ، 1.4 NA
منظف الأوزونNovascanPSD-UV4تستخدم للتخلص من مضان الخلفية على زلات الغطاء الزجاجي.
فوسفات البوتاسيومسيجما ألدريتش795488مكون M2G.
يضيء LED الأحمرThorlabsM625L3عينة لتصوير تباين الطور. 625 نانومتر.
كاميرا sCMOSكاميرا HamamatsuORCA-Flash 4.0 V2للتصوير الفلوري.
مسار انبعاث مرشح التمرير القصيرChromaET700SP-2P8.
عدسة أنبوبيةThorlabsAC508-180-Af = 180 مم ، 2 "
Yersinia enterocolitica< / em> dHOPEMTasdN / AN / Aسلالة AD4442 ، eYFP-YscQ
ربع موجة من الترتيب الصفريThorlabsWPQ05M-514مسار الإثارة.
Mad لوحة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Tracking3D Localization MicroscopyDiffusive States AnalysisFluorescent Bead FiducialDouble Helix Point Spread FunctionMATLAB Data ProcessingApparent Diffusion CoefficientStochastic Simulation FrameworkCytosolic Protein ComplexesBacterial Pathogen Imaging

Related Articles