مقالة منهجية

التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للعدوى بفيروس داء الكلب في أنسجة الدماغ التي تم تطهيرها من المذيبات

DOI:

10.3791/59402

⸱

أبريل 30, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح تقنيات إزالة الأنسجة الجديدة المتوافقة مع التلطيخ المناعي مثل التصوير ثلاثي الأبعاد النهائي للأعضاء التي يتم تطهيرها بالمذيبات بالتصور ثلاثي الأبعاد للعدوى الدماغية بفيروس داء الكلب وبيئته الخلوية المعقدة. يتم جعل شرائح أنسجة الدماغ السميكة التي تحمل اسم الأجسام المضادة شفافة بصرياً لزيادة عمق التصوير وتمكين التحليل ثلاثي الأبعاد عن طريق الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصور لعمليات العدوى في الأنسجة والأعضاء عن طريق وضع العلامات المناعية هو وسيلة رئيسية في علم الأحياء العدوى الحديثة. القدرة على مراقبة ودراسة توزيع، التروبيسم، ووفرة مسببات الأمراض داخل أنسجة الأعضاء يوفر بيانات محورية عن تطور المرض والتقدم. باستخدام أساليب الفحص المجهري التقليدية، يقتصر وضع العلامات المناعية في الغالب على المقاطع الرقيقة التي يتم الحصول عليها من عينات جزءا لا يتجزأ من البارافين أو المجمدة. ومع ذلك، فإن مستوى الصورة ثنائي الأبعاد المحدود لهذه الأقسام الرقيقة قد يؤدي إلى فقدان معلومات حاسمة عن البنية المعقدة للجهاز المصاب والسياق الخلوي للعدوى. توفر تقنيات إزالة الأنسجة الحديثة متعددة الألوان والمتوافقة مع تلطيخ المناعة الآن طريقة سريعة وغير مكلفة نسبياً لدراسة أكوام الصور ثلاثية الأبعاد ذات الحجم الكبير من أنسجة الأعضاء المصابة بالفيروس. من خلال تعريض الأنسجة للمذيبات العضوية، فإنه يصبح شفافا بصريا. وهذا يطابق مؤشرات الانكسار للعينة ويؤدي في نهاية المطاف إلى انخفاض كبير في تشتت الضوء. وهكذا، جنبا إلى جنب مع أهداف مسافة العمل الحرة لمسافات طويلة، يمكن تصوير أقسام الأنسجة الكبيرة تصل إلى 1 ملم في الحجم بواسطة الفحص المجهري الضوئي بالليزر البؤري التقليدي (CLSM) بدقة عالية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتطبيق التصوير الأنسجة العميقة بعد تطهير الأنسجة لتصور توزيع فيروس داء الكلب في العقول المصابة من أجل دراسة مواضيع مثل مسببات الأمراض الفيروس، وانتشار، التروبيسم، والغزو العصبي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد تقنيات علم الأنسجة التقليدية في الغالب على أجزاء رقيقة من أنسجة الأعضاء، والتي يمكن أن توفر بطبيعتها رؤى 2D فقط في بيئة 3D معقدة. على الرغم من أن من الممكن من حيث المبدأ، إعادة الإعمار 3D من أقسام رقيقة المسلسل يتطلب خطوط أنابيب التقنية الصعبة لكل من تشريح واللاحقة في محاذاة silico من الصور المكتسبة1. وعلاوة على ذلك، إعادة الإعمار السلس من z-volumes بعد تشريح microtome أمر بالغ الأهمية كما يمكن أن تبقى على حد سواء القطع الأثرية الميكانيكية والحسابية بسبب تسجيل صورة دون المستوى الأمثل الناجمة عن طائرات الصورة غير المتداخلة، والاختلافات تلطيخ، والمادية تدمير الأنسجة من قبل، على سبيل المثال، شفرة microtome. وعلى النقيض من ذلك، فإن التقطيع البصري النقي لعينات الأنسجة السميكة السليمة يسمح باقتناء طائرات صور متداخلة (الإفراط في أخذ العينات)، وبالتالي يسهل إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. وهذا بدوره مفيد للغاية لتحليل عمليات العدوى في مجموعات الخلايا المعقدة (مثل الشبكات العصبية في سياق الخلايا الدبقية والمناعية المحيطة). ومع ذلك، تشمل العقبات الكامنة في أقسام الأنسجة السميكة التشتت الخفيف واختراق الأجسام المضادة محدودة في الأنسجة. في السنوات الأخيرة، تم تطوير مجموعة متنوعة منالتقنيات وتحسينها للتغلب على هذه القضايا 2،3،4،5،6،7،8 , 9 , 10 سنوات , 11 , 12 , 13.أساسا، يتم تحويل الأنسجة المستهدفة شفافةبصريا عن طريق العلاج مع إما مائي 2،3،4،5،6،7 ،8،9 أو العضوية المذيبات القائمةعلى 10،11،12،13 الحلول. إدخال 3DISCO (التصوير 3D من الأجهزة المذيبات تطهيرها)11،12 وuDISCO خليفتها (في نهاية المطاف التصوير 3D من الأجهزة المذيبات تطهيرها)13 وفرت أداة سريعة نسبيا، بسيطة، وغير مكلفة مع قدرات ممتازة المقاصة. والمكونات الرئيسية لبروتوكول المقاصة هي المذيبات العضوية tert-butanol (TBA)، والكحول البنزيل (BA)، وبنزوات البنزيل (BB)، والإيثر الثنائي الفينيل (DPE). تطوير وإضافة iDISCO (التصوير 3D تمكين وضع العلامات المناعية من الأجهزة المذيبات تطهيرها)14،بروتوكول متوافق للبقع المناعية، شكلت ميزة أخرى على الأساليب القائمة وتمكين وضع العلامات الأنسجة العميقة من المستضدات من الفائدة، فضلا عن التخزين على المدى الطويل من العينات الملطخة بالمناعة. وهكذا، فإن الجمع بين iDISCO14 و uDISCO13 يسمح للتصوير عالية الدقة من البروتينات التي تحمل اسم الأجسام المضادة في أقسام الأنسجة الكبيرة (تصل إلى 1 ملم) باستخدام CLSM التقليدية.

الحفاظ على بنية الجهاز المعقدة في جميع الأبعاد الثلاثة مهم بشكل خاص لأنسجة الدماغ. الخلايا العصبية تشكل شبه السكان الخلوية غير متجانسة جدا مع مورفولوجيات 3D متنوعة للغاية على أساس التوقعات النيورايت (استعرض من قبل ماسلاند15). وعلاوة على ذلك، يتكون الدماغ من عدد من المقصورات والمقصورات الفرعية، يتكون كل منها من مجموعات فرعية خلوية مختلفة ونسب منها، بما في ذلك الخلايا الغليفية والخلايا العصبية (التي استعرضها فون بارتالد وآخرون16). كفيروس عصبي، فإن فيروس داء الكلب (RABV، الذي استعرضه Fooks et al.17)يصيب الخلايا العصبية في المقام الأول، وذلك باستخدام آلات النقل الخاصة بهم للسفر في اتجاه رجعي على طول المحاور من الموقع الرئيسي للعدوى إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS). يسمح البروتوكول الموضح هنا (الشكل1A)بالكشف بمساعدة المناعة والتصور للخلايا المصابة بـ RABV وRABV في أكوام صور كبيرة ومتماسكة تم الحصول عليها من أنسجة الدماغ المصابة. وهذا يمكّن من إجراء تقييم غير متحيز وثلاثي الدقة لبيئة العدوى. وهو ينطبق على أنسجة الدماغ من مجموعة متنوعة من الأنواع، ويمكن القيام به مباشرة بعد التثبيت أو بعد التخزين الطويل الأجل للعينات في البارافورمالهايد (PFA)، ويسمح بتخزين وإعادة تصوير العينات الملونة وتطهيرها لعدة أشهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام مواد الدماغ المحفوظة الثابتة بـ PFV. تم تقييم الدراسات التجريبية الحيوانية ذات الصلة من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المسؤولة، واستخدام، والأخلاقيات التابعة لمكتب الدولة للزراعة والسلامة الغذائية وصيد الأسماك في مكلنبورغ بوميرانيا الغربية (LALFF M-V) وحصلت على الموافقة بإذن 7221.3-2.1-002/11 (الفئران) و 7221.3-1-068/16 (النمس). وقد أجريت الرعاية العامة والأساليب المستخدمة في التجارب الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.

تحذير: يستخدم هذا البروتوكول مواد سامة و/أو ضارة مختلفة، بما في ذلك PFA، الميثانول (MeOH)، بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)،أزيد الصوديوم (NaN3)،TBA، BA، BB، وDPE. MeOH وTBA قابلة للاشتعال للغاية. تجنب التعرض عن طريق ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والقفازات، وحماية العين) وإجراء التجارب في غطاء الدخان. جمع النفايات بشكل منفصل في الحاويات المناسبة والتخلص منها وفقا للوائح المحلية. ويصنف فيروس داء الكلب على أنه ممرض على مستوى السلامة الأحيائية (BSL)-2، وبالتالي يمكن التعامل معه عموماً في ظل ظروف BSL-2. وقد تتطلب بعض الأنشطة، بما في ذلك الإجراءات التي قد تولد الهباء الجوي، أو العمل بتركيزات عالية من الفيروسات، أو العمل مع فيروسات الليسا الجديدة، تصنيف BSL-3. يوصى بالوقاية قبل التعرض للموظفين المعرضين لمخاطر عالية، بمن فيهم القائمون على رعاية الحيوانات وعمال المختبرات18،19. الرجوع إلى لوائح السلطة المحلية.

1. تثبيت أنسجة الدماغ والقسم

  1. إصلاح عينات الدماغ في حجم مناسب من 4٪ PFA في محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS [درجة الحموضة 7.4]) لمدة 48 ساعة على الأقل في 4 درجة مئوية (مع نسبة الأنسجة إلى المثبتة التقريبية من 1:10 [V/v]).
  2. غسل عينات الأنسجة 3X في PBS لمدة 30 دقيقة على الأقل كل غسل وتخزينها في 0.02٪ NaN3/ PBS في 4 درجة مئوية حتى استخدامها.
  3. قسم الأنسجة إلى 1 مم سميكة باستخدام الاهتزاز (معدل تغذية شفرة: 0.3-0.5 مم / ثانية، السعة: 1 ملم، سمك شريحة: 1000 م).
  4. للاحتفاظ بتسلسل الشريحة الصحيح، قم بتخزين كل مقطع من الأنسجة بشكل منفصل في بئر لوحة ثقافة الخلية متعددة الآبار. إضافة 0.02٪ NaN3/ PBS وتخزين أقسام الأنسجة في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. عينة المعالجة المسبقة مع الميثانول

ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. وتخدم المعالجة المسبقة للعينة الغرض العام المتمثل في تحسين انتشار الأجسام المضادة والحد من الفلورة الذاتية للأنسجة عن طريق التعرض لـ MeOH و H2O2،على التوالي14.

  1. إعداد 20٪ (V / V)، 40٪، 60٪، و 80٪ حلول MeOH في الماء المقطر. على سبيل المثال، ل20٪ MeOH، إضافة 10 مل من 100٪ MeOH إلى 40 مل من الماء المقطر في وعاء قابل للغلق المناسب ومزيج عن طريق عكس ذلك.
  2. نقل العينات إلى أوعية ذات حجم معقول (على سبيل المثال، 5 أنابيب رد فعل مل). الحرص على استخدام المواد المقاومة كيميائيا للكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول. على سبيل المثال، لاحظ أنه في حين أن البولي بروبلين هو مناسب، والبوليسترين ليست كذلك.
    ملاحظة: تشير مواصفات وحدة التخزين في هذا البروتوكول إلى أنابيب التفاعل 5 مل. إذا تم استخدام وعاء مختلف، ضبط وحدات التخزين وفقا لذلك.
  3. احتضان العينات في 4 مل من كل تركيز من سلسلة أعدت من حلول MeOH في ترتيب تصاعدي لمدة ساعة واحدة لكل منهما.
  4. احتضان العينات 2X لمدة ساعة واحدة كل في نقية (100٪) حسناً، حسناً، حسناً، حسناً
  5. تبريد العينات إلى 4 درجة مئوية (على سبيل المثال، في ثلاجة آمنة مختبر).
  6. إعداد محلول التبييض (5٪ H2O2 في MeOH) عن طريق، على سبيل المثال، تخفيف 30٪ H2O2 حل الأسهم في 1:6 في نقية (100٪) MeOH، والبرد في 4 درجة مئوية.
  7. إزالة MeOH 100٪ من العينات المبردة وإضافة 4 مل من محلول التبييض prechilled (5٪ H2O2 في MeOH). الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  8. تبادل محلول التبييض لمدة 4 مل من 80٪ MeOH والحضانة لمدة 1 ح. مواصلة استخدام سلسلة أعدت من حلول MeOH في ترتيب تنازلي لمدة ساعة واحدة لكل حتى يتم احتضان العينات لمدة 1 ساعة في 4 مل من 20٪ MeOH.
  9. غسل العينات 1X لمدة ساعة مع 4 مل من PBS.

3. تلطيخ المناعة

ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. لمنع نمو الميكروبات، أضف NaN3 إلى التركيز النهائي بنسبة 0.02% إلى الحلول في هذا القسم. عينات الأنسجة هي أكثر نفاذية عن طريق العلاج مع المنظفات nonionic تريتون X-100 وتوين 20. يتم استخدام المصل العادي لمنع ربط الأجسام المضادة غير محددة. يتم إضافة الجلايسين والهيبارين للحد من خلفية الوسم المناعي14.

  1. غسل العينات 2X لمدة 1 ساعة كل في 4 مل من 0.2٪ تريتون X-100/PBS.
  2. Permeabilize العينات لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية مع 4 مل من 0.2٪ تريتون X-100/20٪ DMSO / 0.3 M غليسين / PBS.
  3. منع الربط غير محددة من الأجسام المضادة عن طريق احتضان العينات لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في 4 مل من 0.2٪ تريتون X-100/10٪ DMSO / 6٪ المصل العادي / PBS.
    ملاحظة: استخدم المصل الطبيعي من نفس النوع الذي تم رفع الجسم المضاد الثانوي فيه لتحقيق نتائج حظر مثالية.
  4. احتضان العينات في 2 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية (3٪ المصل العادي / 5٪ DMSO / PTwH [PBS-توين 20 مع الهيبارين] + الأجسام المضادة الأولية / الأجسام المضادة) لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية. قم بتحديث محلول الأجسام المضادة الأساسي بعد 2.5 يوم.
    1. لPTwH، إعادة تشكيل ملح الصوديوم الهيبارين في الماء المقطر لجعل 10 ملغ / مل حل الأوراق المالية (تخزين هذا الحل، aliquoted، في 4 درجة مئوية). إضافة محلول الأسهم إلى 0.2٪ توين 20 /PBS إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: قد يتطلب اختيار تخفيف الأجسام المضادة الصحيح التحسين. بشكل عام، تركيزات الكيمياء المناعية القياسية هي نقطة انطلاق جيدة.
  5. اغسل العينات لمدة يوم واحد في 4 مل من PTwH، وتبادل المخزن المؤقت للغسيل على الأقل 4x-5x خلال اليوم وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.
  6. احتضان العينات في 2 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية (3٪ المصل العادي / PTwH + الأجسام المضادة الثانوية / الأجسام المضادة) لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية. قم بتحديث محلول الأجسام المضادة الثانوي بعد 2.5 يوم.
    1. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية / الأجسام المضادة في 1:500 في محلول الأجسام المضادة الثانوية (أي، 4 ميكرولتر في 2 مل).
  7. اغسل العينات لمدة يوم واحد كما هو موضح في الخطوة 3.5، وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.

4 - التلطيخ النووي

ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. وإذا لم تكن هناك حاجة إلى تلطيخ نووي أو إذا كان الطول الموجي/الانبعاث للموجة من TO-PRO-3 مطلوباً للإثارة أو الكشف عن فلوروفور آخر، تخطي هذه الخطوة.

  1. تخفيف وصمة عار حمض نووي TO-PRO-3 في 1:1,000 في PTwH واحتضان العينات في 4 مل من محلول تلطيخ النووية لمدة 5 ساعة.
  2. اغسل العينات لمدة يوم واحد كما هو موضح في الخطوة 3.5، وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.
    ملاحظة: بعد السهي، يمكن تخزين العينات في PBS في 4 درجة مئوية حتى مسح البصرية.

5. إزالة الأنسجة

ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. يتم تجفيف عينات الأنسجة في سلسلة متدرجة من حلول TBA. وبما أن تلطيخ المناعة يتطلب حلولاً مائية، يجب الانتهاء من جميع إجراءات التلطيخ قبل تطهير الأنسجة. يتم تحقيق التخليص البصري ومطابقة مؤشر الانكسار عن طريق العلاج مع خليط من BA، BB، وDPE. يتم استكمال حل المقاصة مع DL-α-توكوفيرول كمضاد للأكسدة13.

  1. إعداد 30٪ (V / V)، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، و 96٪ TBA الحلول في الماء المقطر. على سبيل المثال، بالنسبة لـ 30٪ TBA، إضافة 15 مل من 100٪ TBA إلى 35 مل من الماء المقطر في وعاء قابل للغلق المناسب ومزيج عن طريق عكس.
    ملاحظة: TBA لديه نقطة انصهار من 25-26 درجة مئوية; وبالتالي، فإنه يميل إلى أن تكون صلبة في درجة حرارة الغرفة. من أجل إعداد حلول TBA، تسخين زجاجة مختومة جيدا في 37 درجة مئوية في حاضنة أو حمام مائي.
  2. تجفيف العينات مع 4 مل من كل تركيز من سلسلة أعدت من حلول TBA في ترتيب تصاعدي لمدة 2 ساعة لكل منهما. ترك 96٪ TBA على بين عشية وضحاها.
  3. تجفيف العينات أكثر في نقية (100٪) TBA لمدة 2 ساعة.
  4. إعداد حل المقاصة BABB-D15.
    ملاحظة: BABB-D15 هو مزيج من مكتبة الإسكندرية وBB (BABB) التي يتم خلطها مع DPE بنسبة x:1، حيث يتم تحديد x في اسم الحل، في هذه الحالة 15.
    1. لBABB، مزيج من جزء واحد BA مع جزأين BB.
    2. مزيج BABB وDPE بنسبة 15:1.
    3. إضافة 0.4 فول٪ DL-α-توكوفيرول (فيتامين E).
      ملاحظة: على سبيل المثال، ل20 مل من BABB-D15، مزيج 6.25 مل من مكتبة الإسكندرية مع 12.5 مل من BB. إضافة 1.25 مل من DPE وتكمله مع 0.08 مل من DL-α-توكوفيرول.
  5. قم بإلغاء مسح العينات في محلول المقاصة حتى تكون شفافة بصريًا (2-6 ساعة).
  6. يمكن تخزين العينات في 4 درجة مئوية في BABB-D15، محمية من الضوء، حتى التركيب والتصوير.

6. عينة تصاعد

  1. باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد، اطبع غرفة التصوير والغطاء (المادة: copolyester [CPE]، فوهة: 0.25 مم، ارتفاع الطبقة: 0.06 مم، سمك الجدار: 0.88 مم، عدد الجدران: 4، الحفر: 100٪، لا هيكل دعم؛ المقابلة . يمكن العثور على ملف STL في المواد التكميلية لهذا البروتوكول).
  2. تجميع غرفة التصوير(الشكل 2).
    1. جبل غطاء جولة (قطرها: 30 ملم) على غرفة التصوير مع RTV-1 (مكون واحد غرفة درجة الحرارة- مبركن) سيليكون المطاط. إزالة المطاط سيليكون الزائدة مع مسحة القطن مبللة بالماء وعلاج بين عشية وضحاها.
    2. قم بتركيب غطاء دائري (قطر: 22 مم) على الغطاء مع مطاط السيليكون RTV-1. إزالة المطاط سيليكون الزائدة مع مسحة القطن مبللة بالماء وعلاج بين عشية وضحاها.
  3. ضع العينة في غرفة التصوير، وأضف وحدة تخزين صغيرة من BABB-D15، وأدخل الغطاء. املأ الغرفة بـ BABB-D15 من خلال مدخل الباب، باستخدام إبرة تحت الجلد (27 G × 3/4 بوصة [0.40 مم × 20 مم]).
  4. سد مدخل وختم غرفة التصوير مع المطاط سيليكون RTV-1. علاج بين عشية وضحاها في الظلام.

7. التصوير ومعالجة الصور

  1. إعداد الحصول على الصورة عن طريق تحديد خطوط الليزر ذات الصلة لتتناسب مع الفلوروفور المستخدمة. ضبط نطاقات الكشف عن كل كاشف لمنع تداخل الإشارة بين القنوات.
    ملاحظة: نطاقات الكشف المثالي لأليكسا فلور 488، اليكسا فلور 568، وTO-PRO-3 هي 500-550 نانومتر، 590-620 نانومتر، و 645-700 نانومتر، على التوالي.
  2. اختر معلمات الاكتساب، وحدد الحد العلوي والسفلي لمكدس z، واحصل على مكدس الصور.
    ملاحظة: معلمات الاكتساب المثالية هي مسح تسلسلي بحجم بكسل من 60-90 نانومتر، وحجم خطوة z 0.5 ميكرومتر، ومتوسط خط 1، وسرعة مسح 400 هرتز، وحجم ثقب من وحدة متجددة الهواء 1.
  3. معالجة كومة الصور باستخدام برامج تحليل الصور المناسبة (مثل فيجي) لتوليد إسقاطات ثلاثية الأبعاد أو إجراء تحليلات متعمقة.
    ملاحظة: بسبب الحجم الكبير لملفات الصور المكتسبة عادةً ما يكون استخدام محطة عمل ضروري.
    1. فتح ملف (ملفات) الاكتساب أو الصورة في فيجي (ملف | فتح | حدد الملفات).
      1. إذا كنت تستخدم، على سبيل المثال، . LIF، حدد أو قم بإلغاء تحديد الخيارات المطلوبة في إطار الحوار تنسيقات حيوية. عرض المكدس مع Hyperstack. بخلاف ذلك، لا توجد اختيارات محددة أو علامات التجزئة ضرورية. اضغط على موافق.
      2. إذا كان الملف يحتوي على مكدسات صور متعددة، حدد تلك التي سيتم تحليلها وتأكيدها عن طريق الضغط على موافق.
    2. إجراء تصحيح التبييض عن طريق تقسيم الصورة المدمجة إلى قنوات فردية (صورة | اللون | أداة القنوات، ثم حدد المزيد | تقسيم القنوات). لكل قناة، حدد تصحيح التبييض (صورة | ضبط | تصحيح التبييض) واختر نسبة بسيطة (كثافة الخلفية: 0.0).
      ملاحظة: في بعض الحالات، على سبيل المثال، عندما لا يكون هناك اضمحلال خطي للإشارة أو الإشارة ضعيفة جداً بشكل عام، قد تفشل نسبة بسيطة. بدلاً من ذلك، حاول Exponential Fit أو تخطي تصحيح التبييض.
    3. ضبط السطوع والتباين لكل قناة باستخدام أشرطة التمرير (صورة | ضبط | السطوع | التباين).
    4. دمج القنوات (صورة | اللون | دمجالقنوات)، وجعل مركب (صورة | اللون | أداة القنوات، ثم حدد المزيد | جعلمركب)، وتحويلها إلى تنسيق RGB (صورة | اللون | أداة القنوات، ثم حدد المزيد | قم بالتحويل إلى RGB).
    5. إذا لزم الأمر، تغيير حجم مكدس الصور لتقليل وقت الحساب وحجم الملف (صورة | ضبط | الحجم،كلا الخيارين تكتك بالإضافة إلى الاستيفاء bilinear).
    6. إنشاء إسقاط ثلاثي الأبعاد (صورة | مكدسات | 3D المشروع). اختر نقطة ألمع كطريقة إسقاط وتعيين تباعد الشرائح لمطابقة حجم خطوة z لمكدس الصور المكتسبة. للحصول على أقصى جودة، قم بتعيين زيادة زاوية الدوران إلى 1 وتمكين الاستيفاء. تعديل الاستدارة الإجمالية وعتبات الشفافية والتعتيم حسب الحاجة.
    7. إذا لزم الأمر، تعديل التباين والسطوع عن طريق تحويل الإسقاط 3D مرة أخرى إلى تنسيق 8 بت (صورة | النوع | 8 بت). استخدام المتزلجون المعنية (صورة | ضبط | السطوع | التباين) وإعادة تحويل مكدس الصور إلى تنسيق RGB كما هو موضح في الخطوة 7.3.4.
    8. حفظ الإسقاط 3D كـ . TIF (تنسيق ملف الصورة) و . AVI (تنسيق ملف الفيديو).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مزيج من iDISCO14 و uDISCO13 جنبا إلى جنب مع CLSM عالية الدقة يوفر رؤى عميقة في القرار spatiotime واللدونة من العدوى RABV من أنسجة الدماغ والسياق الخلوي المحيطة بها.

باستخدام التلطيخ المناعي للبروتين الفوسفاتي RABV (P)، يمكن تصور الطبقات المعقدة منالخلايا العصبية المصابة في أقسام سميكة من أدمغة الماوس (الشكل 3). وفي وقت لاحق، يمكن إعادة بناء الإسقاطات ثلاثية الأبعاد السلسة لأكوام الصور المكتسبة (الشكل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عودة ومواصلة تطوير تقنيات إزالة الأنسجة في السنوات الأخيرة2و3و4 و5 و6و7و8، 9 , 10 سنوات , 11 , 12 , 13 , <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون توماس [ك.]. [متّنليتر] و [فيرينا] [ت] [كمب] ل [أنفيوو] يقرأ المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مبادرة التميز الاتحادية لمكلنبورغ بوميرانيا الغربية والصندوق الاجتماعي الأوروبي (ESF) منحة KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) ومنحة بحثية تعاونية داخل الجدارية على Lyssaviruses في [فريدريش-لوفلر-ينستيت] ([ري-0372]).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > الكواشف < / قوي>
كحول البنزيلألفا إيسار41218كاشف المقاصة
بنزوات البنزيلسيجما ألدريتشBB6630-500MLكاشف المقاصة
ثنائي ميثيل سلفوكسيدكارل روث4720.2مخازن مؤقتة مختلفة
ثنائي الفينيل الأثيرسيجما ألدريتش240834-100Gكاشف المقاصة
DL-&alpha TocopherolAlfa AesarA17039مصل الحمار المضاد للأكسدة
Bio-RadC06SBZكاشف حجب
الجلايسينكارل روث3908.2مصل الماعز للحد
الخلفية MerckS26-100MLكاشف حجب
الهيبارين ملح الصوديومكارلروث 7692.1خلفية اختزال
محلول بيروكسيد الهيدروجين (30٪)كارل روث8070.2عينة تبييض
الميثانولكارلروث 4627.4المعالجة المسبقة للعينة
بارافورمالديهايدكارل روث0335.3مسحوق بلوري لصنع محلول مثبت
أزيد الصوديومكارل روثK305.1منع النمو الميكروبي في محاليل
المخزونtert-ButanolAlfa Aesar33278عينة الجفاف لتنظيف الأنسجة
TO-PRO-3Thermo FisherT3605صبغة الحمض النووي
Triton X-100Carl Roth3051.2منظف
Tween 20AppliChemA4974،0500منظف
<قوي >متفرقات < / قوي >
5 مل تفاعل أنابيبEppendorf0030119401أنابيب عينة
Coverslip ، دائري (قطر: 22 مم)Marienfeld0111620جزء من غرفة التصوير
Coverslip ، دائري (قطر: 30 مم)Marienfeld0111700جزء من غرفة التصوير
إبرة تحت الجلد (27 G x ¾ ؛ ” [0.40 مم × 20 مم])ب. براون4657705ملء غرفة التصوير بمحلول المقاصة
RTV-1 مطاط السيليكونWackerE43لاصق لتجميع غرفة التصوير
Ultimaker CPE 2.85 مم شفافUltimaker8718836374869خيوط كوبوليستر للطابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة أجزاء من غرفة
التصوير <قوية > المعدات والبرامج التقنية < / قوية>
طابعة ثلاثية الأبعادUltimakerUltimaker 2 +طباعة غرفة التصوير
نظام الغمر المائي الآليLeica15640019مضخة مياه يتم التحكم فيها بواسطة البرمجيات شاكر
مداري منضدةElmiDOS-20Mحضانة عينة في درجة حرارة الغرفة (~ 150 دورة في الدقيقة)
شاكر مداري منضدة ، ساخننيو برونزويك ScientificG24 حضانة عينة شاكر البيئيةعند 37 درجة ؛ C (~ 150 دورة في الدقيقة)
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرLeicaDMI 6000 TCS SP5مجهر متحد البؤر المقلوب لتصوير عينة
فيجيالمعاهد الوطنية للصحة (ImageJ) برنامجمفتوح المصدر (v1.52h)حزمة معالجة الصور على أساس ImageJ
الغمر بالماء لمسافات العملالطويلة Leica15506360HC PL APO 40x / 1.10 W motCORR CS2
VibratomeLeicaVT1200Sمحطة عمل تقطيع العينة
DellPrecision 7920: Intel Xeon Gold 5118
GPU: Nvidia Quadro P5000
RAM: 128 جيجابايت 2666 ميجاهرتز DDR4
SSD: 2 تيرابايت
قوية>الأجسام المضادة الأولية< قوية>
الماعز المضادة ل RABV Nمعهد فريدريش لوفلرمصل الماعز متعدد النسيلة أحادي النوع المضاد ل RABV N ، الناتج عن تحصين الماعز باستخدام البروتين النووي RABV المعبر عنه بفيروس باكو ومنقى His Tag N
التخفيف: 1:400
الأرانب المضادة ل GFAPDakoZ0334الجسم المضاد متعدد النسيلة (RRID: AB_10013382)
التخفيف: 1:100
الأرانب المضادة ل MAP2Abcamab32454الجسم المضاد متعدد النسيلة (RRID: AB_776174)
التخفيف: 1:250
أرنب مضاد ل RABV P 160-5فريدريش لوفلر معهدمصل الأرانب متعدد النسيلة أحادي النوع المضاد ل RABV P ، الناتج عن تحصين الأرانب باستخدام بروتين فوسفوبروتين RABV المعبر عنه عن فيروس الباكو ومنقى Tag-tag P (انظر المرجع 23: Orbanz et al. ، 2010)
التخفيف: 1: 1,000
<قوي>الأجسام المضادة الثانوية< / قوي>
الحمير المضاد للماعز IgGThermo Fisher Scientificاعتمادا على المترافق الفلوروفورعالي الامتصاص
التخفيف: 1:500
الحمار المضاد للفأر IgGThermo Fisher Scientificاعتمادا على الفلوروفور المترافقعالي الامتصاص
التخفيف: 1: 500
الحمار المضاد للأرانب IgGThermo Fisher Scientificاعتمادا على الفلوروفور المترافقعالي الامتصاص
التخفيف: 1: 500
الماعز المضاد للفأر IgGThermo Fisher علمييعتمد على الفلوروفور المترافقعالي الامتصاص
التخفيف: 1: 500
الماعز المضاد للأرانب IgGThermo Fisher Scientificاعتمادا على الفلوروفور المترافقعالي الامتصاص
التخفيف: 1: 500
من هدف وحدة المعالجة المركزية <

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  3. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  4. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  5. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  6. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  9. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  10. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  11. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
  12. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  13. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
  16. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  17. Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091(2017).
  18. WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
  19. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
  20. Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
  21. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  22. Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
  23. Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BABB D15

مقالات ذات صلة