مقالة منهجية

التحقيق في التعديلات في Caecum Microbiota بعد إصابات الدماغ الصادمة في الفئران

DOI:

10.3791/59410

⸱

سبتمبر 19, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Emergency and Trauma Center, The International Medical Center, The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هنا بروتوكول للحث على إصابة الدماغ الصادمة المنتشرة باستخدام جهاز قرع السوائل الجانبية متبوعاً بجمع محتوى caecum لتحليل ميكروبيوم الأمعاء.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر الأدلة المتزايدة أن محور ميكروبيوتا-القناة الهضمية والدماغ يلعب دورا هاما في مسببات الأمراض من أمراض الدماغ. كما تبين العديد من الدراسات أن إصابات الدماغ الصادمة تسبب تغييرات في ميكروبيوتا الأمعاء. ومع ذلك، لا تزال الآليات التي تقوم عليها التنظيم ثنائي الاتجاه لمحور الدماغ والأمعاء غير معروفة. حاليا، توجد نماذج قليلة لدراسة التغيرات في ميكروبيوتا الأمعاء بعد إصابة الدماغ الصادمة. ولذلك، فإن الدراسة المقدمة تجمع بين بروتوكولات للتحريض على إصابة الدماغ الصادمة باستخدام جهاز قرع السوائل الجانبية وتحليل عينات caecum بعد الإصابة للتحقيق في التعديلات في ميكروبيوم الأمعاء. يتم تحديد التعديلات في تكوين ميكروبيوتا الأمعاء بعد إصابة الدماغ الصادمة باستخدام تسلسل 16S-rDNA. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لدراسة العلاقات بين الكائنات الحية الدقيقة المعوية وإصابات الدماغ الصادمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إصابات الدماغ الصادمة (TBI) هي مشكلة الصحة العامة العالمية والسبب الرئيسي للوفاة والعجز في الشباب البالغين1،2. يسبب TBI العديد من الوفيات كل عام، ويعاني الناجون من مجموعة متنوعة من الإعاقات الجسدية والنفسية والعاطفية والمعرفية. ولذلك، فإن TBI هو عبء ثقيل على أسرة المريض وموارده المجتمعية. TBI ينطوي على كل من إصابة الدماغ الأولية التي تحدث في وقت الصدمة وأي إصابات الدماغ الثانوية التي تتطور ساعات إلى أشهر بعد الإصابة الأولية. يتم التوسط في إصابة الدماغ الثانوية من قبل العديد من السلاسل البيوكيميائية، والتي ليست ضارة فقط للدماغ ولكن أيضا لها آثار سلبية كبيرة على مختلف أجهزة الجهاز، بما في ذلك الجهاز الهضمي3.

حاليا، هناك ثلاثة نماذج للحث على TBI في التجارب الحيوانية: إصابة قرع السوائل، والسيطرة على تأثير القشرية (CCI)، وتسارع انخفاض الوزن. إصابة قرع السوائل الجانبية (LFPI) هو النموذج الأكثر استخداما لإنشاء إصابة الدماغ المنتشرة (DAI)4. ينتج الجهاز إصابة الدماغ من خلال استئصال الجمجمة عن طريق تطبيق نبض ضغط سائل قصير على دورا سليمة. يتم إنشاء هذا النبض عن طريق ضرب البندول. LFPI هو طريقة النمذجة القابلة للاستنساخ والسيطرة على البحوث TBI.

يتم تعريف الميكروبيوم على أنه الجينوم الجماعي لجميع الكائنات الدقيقة التي تعيش في جسم الإنسان. الميكروبات المعوية على وجه الخصوص ليس فقط تلعب دورا هاما في التوازن المعوي والوظيفة ولكن أيضا تنظيم العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء المضيفة وأداء الأجهزة الأخرى5. في السنوات الأخيرة، هناك أدلة متزايدة تشير إلى أن ميكروبيوتا الأمعاء تنظم نمو الدماغ والوظيفة عن طريق محاور الدماغ والأمعاء6. وقد تم ربط اضطراب ميكروبيوتا الأمعاء إلى العديد من اضطرابات وظائف الدماغ بما في ذلك مرض باركنسون, اضطرابات المزاج, والتوحد7. في الآونة الأخيرة، وقد ذكرت الدراسات ما قبل السريرية أيضا أن إصابة الدماغ الحادة يمكن أن تحفز تغييرات في ميكروبيوتا الأمعاء8،9.

ووجدت دراسة أجراها Treangen وآخرون10 انخفاضا كبيرا في ثلاثة أنواع من الميكروبات وزيادات في نوعين من الميكروبات بعد TBI الناجمة عن CCI. وتشير هذه الأدلة إلى أن تعديل ميكروبيوتا الأمعاء قد يكون طريقة علاجية في إدارة TBI. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء إصابات الدماغ الناجمة عن تغيرات ميكروبيوتا الأمعاء لا تزال غير معروفة. لهذا السبب، مطلوب نموذج بسيط نسبيا وفعالة لدراسة التغيرات في ميكروبيوتا الأمعاء بعد TBI. ولذلك، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لدراسة التعديلات في ميكروبيوتا الأمعاء بعد TBI في الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافقت اللجنة التجريبية لأخلاقيات الحيوان بجامعة تشجيانغ على جميع الإجراءات التي تم تنفيذها. جميع الأدوات والمواد المستخدمة في الجراحة معقمة. تستغرق الـ TBI حوالي 20 دقيقة.

1- رعاية الحيوانات

  1. استخدام 5-إلى 6 أسابيع من العمر الذكور C57BL/6J الفئران (20-25 غرام من الوزن) في هذه التجربة.
  2. الحفاظ على الفئران على 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / دورة مظلمة، وتأكد من أنها تتلقى الطعام والماء الإعلان libitum. توفير نفس الكميات من الطعام والماء لكل من مجموعات الشام وTBI طوال فترة الدراسة.
  3. بذل كل الجهود للحد من آلام الحيوانات وعدم الراحة.

2. تحريض إصابات الدماغ الصادمة

  1. حقن الكيتامين (80-100 ملغ / كغ) / Xylazine (10 ملغ / كغ) IP للتخدير. اختبار عمق التخدير باستخدام رد فعل العين أو رد فعل الألم. استخدام الدموع الاصطناعية أو مرهم العين زيوت التشحيم للحفاظ على العينين من التجفيف.
  2. بعد التخدير، ضع الماوس في وضع عرضة للخطر. استخدام وسادة التدفئة التي تسيطر عليها درجة الحرارة للحفاظ على درجة الحرارة في 37 درجة مئوية خلال الجراحة ولمدة 30 دقيقة بعد TBI.
  3. حلاقة شعر منطقة الشق.
  4. تطهير فروة الرأس مع الإيثانول 70٪ باستخدام ثلاثة الدعك بالتناوب، ثم قطع فروة الرأس في طائرة sagittal.
  5. استخدام ملقط لسحب الشق على كلا الجانبين وفصل periosteum قليلا.
  6. استخدم علامة لرسم دائرة (قطرها 3 مم) على المنطقة الجدارية اليمنى من الجمجمة، على بعد 2 مم من خط الوسط.
  7. حفر الجمجمة مع الحفر الكهربائية. تأكد من أن يتم تشغيل هذه الخطوة بعناية لحماية دورا من التعرض للتلف.
  8. إزالة رفرف العظام وفضح نافذة العظام الصغيرة (3 ملم في القطر).
  9. وضع قنية إصابة بلاستيكية (القطر الداخلي = 2.5 ملم، وطول = 8 ملم) على استئصال الجمجمة والاسمنت قنية إلى الجمجمة باستخدام الاكريليك الأسنان.
  10. ملء قنية مع معقمة 0.9٪ NaCl (المالحة العادية) باستخدام حقنة (5 مل) لضمان عدم وجود فقاعات في قنية.
  11. قم بتشغيل منظار الذبذبات ومكبر الصوت وتأكد من خلو أنبوب الضغط العالي لجهاز إصابة قرع السوائل الجانبية (LFPI) من فقاعات الهواء. اختبار الجهاز عن طريق تقديم حوالي 10 نبضات حتى يعطي إشارة ثابتة. ضبط زاوية وضع بدء البندول للوصول إلى كثافة نبض حوالي 2.0 أجهزة الصراف الآلي.
  12. قم بتوصيل قنية الإصابة بجهاز LFPI. الحث على إصابة الدماغ عن طريق سحب الزناد والإفراج عن البندول. ثم، الحصول على نبض ونقله إلى دورا من خلال كامل نظام أنابيب مليئة بالسوائل مغلقة.
  13. تشغيل الفئران في مجموعة الشام مع نفس العملية الجراحية. لا تقم بتنفيذ LFPI.

3. العلاج بعد الجراحة

  1. بعد تحفيز إصابة الدماغ، قم بإزالة قنية البلاستيك وخياطة الشق. خلال الجراحة إدارة البوبرينورفين (2mg /kg) SQ أو IP وبعد ذلك كل 6-12 ساعة لمدة ثلاثة أيام.
  2. وضع الماوس على وسادة التدفئة حتى يكون المتنقلة. تعيين درجة حرارة وسادة التدفئة إلى 37 درجة مئوية لتسريع الإنعاش التخديري.
  3. وضع الماوس مرة أخرى في القفص وإدارة الطعام والماء الإعلان libitum.

4. استئصال البطن وجمع عينة من caecum

  1. قتل الفئران من قبل CO2 تليها خلع عنق الرحم في النقاط الزمنية المقابلة.
    ملاحظة: في هذه التجربة، كانت نقاط الوقت المختار 1 ح، 6 ح، 1 د، 3 د، و 7 د إصابة الدماغ ما بعد الصدمة لتحليل التطور الديناميكي للميكروبيوتا الأمعاء.
  2. إزالة الشعر من سطح البطن. تطهير البطن مع الإيثانول 70٪.
  3. ضع ستارة معقمة فوق الماوس. إجراء شق من خط الوسط أسفل البطن، فقط فوق prepuce في الفئران الذكور.
  4. بعد أن تتعرض الأمعاء، حدد موقع cecum وفصلها بلطف عن المسالك المعوية الأخرى. تجنب استيعاب cecum مع ملقط مسننة أو حادة. استخدم ملقط صادم، مثل ملقط Adson مع السّاقات.
  5. قطع caecum مع مقص حاد.
  6. استخراج محتويات caecum يدويا على خلع الملابس المعقمة وتخزين المحتويات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
  7. تخزين محتويات caecum في -80 درجة مئوية حتى تحليل ميكروبيوم.

5- استخراج الحمض النووي وتسلسل 16S-rDNA وتحليل البيانات

  1. عزل الحمض النووي عن البراز
    ملاحظة: تم استخدام مجموعة عزل الحمض النووي المتاحة تجارياً(جدول المواد)لهذه التجربة.
    1. استخدام مشرط لكشط 300 ملغ من البراز في أنبوب 2 مل microcentrifuge ووضع الأنبوب على الجليد.
    2. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت inhibit إلى كل عينة. دوامة باستمرار لمدة دقيقة واحدة أو حتى يتم تجانس عينة البراز تماما.
    3. طرد مركزي العينة في السرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة لبيليه جزيئات البراز.
    4. ماصة 2 ميكرولتر من بروتيناتك K في أنبوب جديد 2 مل أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. Pipet 600 μL من supernatant من الخطوة 5.1.3 في أنبوب الطرد المركزي الصغير 2 مل التي تحتوي على proteinase K. ثم، إضافة 600 درجة مئوية من المخزن المؤقت 1 ودوامة ل 15 ثانية.
    5. حضانة العينة في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    6. إضافة 600 درجة مئوية من الإيثانول 100٪ إلى lysate (1:1 نسبة) ومزيج من دوامة. الطرد المركزي في السرعة القصوى لفترة وجيزة لإزالة قطرات من داخل غطاء الأنبوب.
    7. تطبيق 600 درجة مئوية من lysate إلى عمود تدور. الطرد المركزي في السرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة تجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة مرة أخرى. ثم قم بنقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد 2 مل.
    8. افتح عمود الدوران وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2. الطرد المركزي في السرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة.
    9. إضافة 500 μL من المخزن المؤقت 3 في العمود. الطرد المركزي في السرعة القصوى لمدة 3 دقائق. كرر عملية الطرد المركزي مرة واحدة للتأكد من أن المخزن المؤقت 3 هو مُتَرَدتماماً.
    10. وضع عمود تدور في أنبوب جديد 2 مل جمع أنبوب وماصة 200 درجة مئوية من العازلة 4 مباشرة على الغشاء. الحضانة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT)، ثم الطرد المركزي في السرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة إلى الحمض النووي elute.
  2. 16S-rDNA التسلسل وتحليل البيانات
    1. استخدام 20-30 نانوغرام من الحمض النووي لتوليد amplicons.
    2. استخدام التمهيديات المتاحة تجاريا مصممة للمناطق المحفوظة نسبيا المتاخمة للمناطق V3 و V4 فائقة المتغيرات من البكتيريا 16S rDNA. واستُخدمت في هذه الدراسة الأوّليات الأمامية التي تحتوي على التسلسل "CCTACGGRRBGCAGKVRVGAAT" والمبادئ التمهيدية العكسية التي تحتوي على التسلسل "GGACTACACNVGGGTGTCTAtATCC".
    3. جعل خليط ردود الفعل PCR عن طريق إضافة 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1، 2 ميكرولتر من dNTPs، 1 ميكرولتر من كل التمهيدي، 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي، و 20 نانوغرام من الحمض النووي قالب في أنبوب. استخدام ddH2O لضبط نظام رد الفعل إلى 25 درجة مئوية.
    4. تعيين المعلمات رد فعل PCR على النحو التالي: أداء ما قبل denaturation في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق مرة واحدة. قم بإجراء إزالة النُشّع عند درجة حرارة 94 درجة مئوية لمدة 5 درجات مئوية، وُلِّم ُ إلى درجة حرارة 57 درجة مئوية لـ 90 درجة مئوية، ويُمدّد عند 72 درجة مئوية لـ 10 درجات، وكرّر هذا 24 درجة مئوية.
    5. تنفيذ تسلسل PE250/300 المقترنة نهاية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واستخدام حزمة تحليل البيانات QIIME لتحليل البيانات rRNA 16S.
      ملاحظة: في هذه التجربة، تم إجراء تسلسل الحمض النووي وتحليل البيانات في المقام الأول من قبل شركة تسلسل المهنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1إنشاء هذه اللجنة. بعد التخدير والتطهير ، تم قطع فروة الرأس sagittally (الشكل 1A). تم استئصال الجمجمة (3 ملم في القطر) في الجمجمة على القشرة الجدارية اليمنى مع الحفر الكهربائي، تم الاحتفاظ دورا سليمة(الشكل 1B،C). تم وضع قنية إصابة بلاستيكية فوق نافذة العظام ورسخت إلى الجمجمة باستخدام الاكريليك الأسنان(الشكل 1D).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرض هنا هو بروتوكول بسيط وفعال لتحديد التغييرات في ميكروبيوتا cecal بعد TBI في الفئران. الحث على إصابة الدماغ وجمع عينات محتوى caecum هي أجزاء حاسمة من البروتوكول.

على الرغم من أن الباحثين بعد دراسة التغيرات في ميكروبيوتا الأمعاء بعد TBI، كانت إصابة الدماغ المستخدمة في هذه الدراسات CCI-8 وانخفاض الوزن / النماذج الناجمة عن التأثير9. ومع ذلك, نموذج CCI في الغالب يكرر كدمة الدماغ, ونموذج انخفاض الوزن قد تعاني من بعض عدم الدقة. من بين جميع نماذج إصا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر أصحاب البلاغ بخالص الشكر باوهونغ وانغ على توجيهها التقني.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم عزل الحمض النووي QIAGEN51604للتنقية السريعة للحمض النووي الجيني من عينات البراز
خدمة تحليل الجيناتخدمة تحليل الجينات GENEWIZ
وسادة التدفئةShanghai SAFE Biotech Co.حاقن وسادة التدفئةTR-200
أول مستشفى تابع ، كلية الطب ، حاقن جامعة
LFPIفرجينيا
جامعة الكومنولث		FP302جهاز LFPI
مثقاب الجمجمة الصغيرRWD علوم الحياة78061مثقاب الجمجمة الصغير
بوفيدون اليودأول مستشفى تابع ، كلية الطب ، جامعةبوفيدون اليود
تشجيانغ جهاز تشجيانغ

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332(2017).
  2. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
  3. Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S. Systemic manifestations of traumatic brain injury. Handbook of Clinical Neurology. 127, 205-218 (2015).
  4. Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
  5. Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
  6. Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
  7. Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
  8. Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
  9. Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
  10. Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757(2018).
  11. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  12. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  13. Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

16S rDNA

مقالات ذات صلة