مقالة منهجية

تعزيز مراقبة داء الكلب باستخدام اختبار سريع مباشر للمناعة الكيميائية

10.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59416

⸱

أبريل 30, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Knoxville, TN, United States Department of Agriculture (USDA), 2Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Sutton, MA, United States Department of Agriculture (USDA), 3Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Milton, FL, United States Department of Agriculture (USDA), 4Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Concord, NH, United States Department of Agriculture (USDA), 5Lyssa LLC

في هذه المقالة

ملخص

يوفر الاختبار المناعي المناعي السريع المباشر (DRIT) بديلاً معترفاً به من قبل المنظمة العالمية لصحة الحيوان ومنظمة الصحة العالمية (OIE/WHO) لاختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) لتشخيص داء الكلب. يسمح هذا الاختبار للتطبيقات الميدانية التي يمكن تنفيذها في حوالي 1 ساعة على انطباعات الدماغ باستخدام الفحص المجهري الخفيف.

الملخص

والمراقبة المختبرية جزء لا يتجزأ من جهود الوقاية من داء الكلب ومكافحته وإدارته. وفي حين أن وزارة الخارجية هي المعيار الذهبي لتشخيص داء الكلب، فإن هناك حاجة إلى التحقق من صحة تقنيات التشخيص الإضافية لتحسين مراقبة داء الكلب، ولا سيما في البلدان النامية. هنا، نقدم بروتوكول قياسي لDRIT كخيار اختبار بديل أو مختبري أو ميداني يستخدم الفحص المجهري الخفيف مقارنة بـ DFA. يتم إصلاح انطباعات اللمس من أنسجة الدماغ التي تم جمعها من الحيوانات المشتبه بها في 10٪ رسميا. يستخدم DRIT أجسام مضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة خاصة بفيروس الكلب (مترافقة مع البيوتين)، وأنزيم streptavidin-peroxidase، ومراسل كروموجين (مثل أسيتيل 3-أمينو-9-إيثيلكاربازول) للكشف عن التضمينات الفيروسية داخل الأنسجة المصابة. في حوالي 1 ساعة، يمكن اختبار عينة أنسجة الدماغ وتفسيرها من قبل DRIT. وقد أظهر تقييم العقول الحيوانية المشتبه فيها التي تم اختبارها من مجموعة متنوعة من الأنواع في أمريكا الشمالية وآسيا وأفريقيا وأوروبا حساسية عالية وخصوصية من قبل DRIT تقترب 100٪ مع النتائج مقارنة مع DFA. منذ عام 2005، قام برنامج خدمات الحياة البرية التابع لوزارة الزراعة في الولايات المتحدة بجهود معززة واسعة النطاق لمراقبة داء الكلب باستخدام DRIT لاختبار > 94,000 عينة تم جمعها من الحياة البرية في مناطق إدارة داء الكلب الاستراتيجية . يوفر DRIT أداة قوية واقتصادية لتشخيص داء الكلب التي يمكن استخدامها من قبل العاملين وعلماء الأحياء الميدانية لتحسين مراقبة داء الكلب الحالي، وبرامج الوقاية والسيطرة على الصعيد العالمي.

المقدمة

في حين أن DFA هو الاختبار الأكثر استخداما لتشخيص داء الكلب الروتيني1،فإن تكلفة شراء وصيانة المجهر الفلورسنت يمكن أن تكون محدودة للدول النامية2،3،4 وعلى نطاق واسع، برامج مراقبة داء الكلب على نطاق واسع3و4. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وزارة الخارجية تتطلب القدرة على تبريد العينات أثناء التثبيت واحتضان العينات فوق درجة الحرارة المحيطة أثناء تفاعلات مستضد الأجسام المضادة، والتي يمكن أن تشكل عقبة كبيرة في البلدان التي لا توجد فيها بنية تحتية مناسبة. ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود المرتبطة باختبارات DFA الحديثة، وقد تم التقليل من الأثر العالمي لداء الكلب منذ فترة طويلة5.

وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى التحقق من صحة تقنيات التشخيص الإضافية لتحسين مراقبة داء الكلب على الصعيد العالمي، ولا سيما في البلدان النامية. يوفر بروتوكول DRIT المعروض هنا بديلاً مختبرياً أو ميدانياً للاختبار على بروتوكول DFA يستخدم الفحص المجهري الخفيفولا يتطلب التبريد أو الحضانة المختبرية أثناء الاختبار 6. DRIT وDFA متشابهة في أن كلا الأسلوبين استخدام انطباعات اللمس من عينات الدماغ التي تم جمعها من الحيوانات التي يحتمل أن تكون مسعورة. ومع ذلك، فإن الخطوة الأولى من DRIT يستخدم formalin كالمثبت التاريخي للعينات، مما يعطل فيروس داء الكلب. وهذا يوفر تحسنا كبيرا في السلامة الأحيائية على الأسيتون المستخدم لإصلاح العينات في بروتوكول DFA3، وهو أمر مهم ليس فقط في المختبر ولكن ربما أكثر من ذلك في بيئات المختبر الميدانية أو اللامركزية. حتى الآن، يظهر DRIT حساسية وخصوصيةمساوية لDFA 2،7،8،9.

منذ عام 2005، قام برنامج WS التابع لوزارة الزراعة الأميركية بجهود مراقبة داء الكلب المعززة على نطاق واسع في أمريكا الشمالية باستخدام DRIT كجزء من برنامج شامل لإدارة داء الكلب البرية 10. يتم استخدام مراقبة داء الكلب المعززة كتكملة لمراقبة الصحة العامة القائمة على التعرض والاختبارات في المقام الأول أنواع الحيوانات البرية meso-carnivore، بما في ذلك الراكون(Procyon lotor)،الظربان المخطط (mephitismephitis)،الثعالب الرمادية ( Urocyon cinereoargenteus)، الثعالب الحمراء(الفرجالفرج) ، والقيوط (كانيسلاترانس)التي لم تشارك في التعرض للحيوانية البشرية أو المنزلية. وقدمت جثث الحيوانات المستخدمة في الاختبار إلى وزارة الزراعة الأمريكية WS من خلال جهود تعزيز مراقبة داء الكلب وتتألف من أنواع ناقلات داء الكلب التي هي: سوء أو غريب التمثيل; العثور على القتلى ، وقتل على الطرق ، أو مصدر إزعاج ؛ ولا ترتبط بتعرض الحيوانات البشرية أو المنزلية. يوفر DRIT اختبار تشخيص داء الكلب التي يمكن استخدامها من قبل علماء الأحياء الميدانية المدربين مع خبرة مختبرية قليلة أو معدومة لتحسين مراقبة داء الكلب والحد من العبء المالي وعبء العمل من مختبرات تشخيص الصحة العامة10. عادة ما يستغرق التدريب الأساسي لـ DRIT للموظفين الميدانيين في وزارة الزراعة الأميركية من 1.5 إلى 2 يومًا، والذي يتضمن حوالي 4 ساعات من التعليم في الفصول الدراسية الذي يغطي المبادئ الأساسية للسلامة البيولوجية، وطرق جمع العينات وعمليات DRIT، فضلاً عن >8 ساعة من وقت المختبر إجراء الاختبار. وقد أتيحت فرص التدريب لوزارة الزراعة الأميركية والمتعاونين في البرنامج من خلال مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC)، LYSSA LLC، ومعهد ويستار.

وفي مناطق الإدارة الاستراتيجية، قامت وزارة الزراعة الأمريكية باختبار أكثر من 94,000 عينة من الحيوانات البرية باستخدام DRIT واكتشفت أكثر من 1,850 عينة مسعورة من المرجح أن تكون قد لم يتم اكتشافها بالاعتماد فقط على اختبارات الصحة العامة للالحيوانات المشتبه فيها. تعزيز بيانات مراقبة داء الكلب التي توفرها نتائج DRIT حاسمة لتوفير تمثيل زمني ومكاني أكثر اكتمالا لداء الكلب في المناظر الطبيعية دعما لبرامج التطعيم عن طريق الفم ضد داء الكلب للحياة البرية في جميع أنحاء الولايات المتحدة الأمريكية10، 11. وبالمثل، أدرجت وكالات الحياة البرية الإقليمية في كندا DRIT في جهود مراقبة داءالكلب البري على نطاق واسع جنبا إلى جنب مع برامجها للصحة العامة بنجاح 8. وقد استخدمت كل من وزارة الزراعة الأمريكية WS والكندية DRIT برامج المراقبة المختبرات المرجعية الوطنية لتأكيد داء الكلب من قبل DFA وأداء البديل الفيروسي ة الكتابة حسب الاقتضاء8. وعلاوة على ذلك، يرسل علماء الأحياء الميدانيون التابعون لوزارة الزراعة الأمريكية 10% من العينات السلبية لتأكيد DFA إلى المختبرات المرجعية، ومنذ عام 2008، شاركوا في اختبار الكفاءة نصف السنوي لـ DRIT الذي يقدمه مختبر ولاية ويسكونسن للنظافة الصحية، كجزء من المعايير تدابير ضمان الجودة.

والهدف من هذه الطريقة هو تقديم نهج بديل لاختبار تشخيص داء الكلب الذي يمكن القيام به في المختبرات اللامركزية، في الميدان، أو في المناطق التي لا يمكن الوصول إليها بشكل روتيني إلى المجهر الإلكتروني.

البروتوكول

وينبغي أن يتلقى كل شخص يجري اختبارات تشخيصية لداء الكلب سلسلة تطعيم قياسية قبل التعرض لداء الكلب وأن يخضع لتقييم منتظم للأجسام المضادة المصلية، مع التحصينات المعززة حسب الحاجة. ولا ينبغي للأفراد الذين لا يُعون عددهم أن يدخلوا المختبرات أو المناطق التي يُضطلع فيها بهذا العمل. وينبغي إجراء جميع أنواع التلاعب بالأنسجة والشرائح لعدم الهباء الجوي للسوائل أو إنتاج جزيئات محمولة جواً. أغطية الدخان ليست مطلوبة ولكن عندما يكون ذلك ممكنا أنها يمكن أن توفر حماية إضافية من الروائح، والطفيليات الخارجية، وشظايا العظام. وينبغي ارتداء الحد الأدنى من معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات وحماية العين، في جميع الأوقات أثناء جمع العينات واختبارها.

1. مجموعة جذع الدماغ

  1. جمع عينات جذع الدماغ إما على الفور عند جمع الذبيحة أو التأكد من أن يتم وضع الذبيحة في الثلاجات للتخزين حتى وقت لاحق اختبار. إذا تم تجميد الذبيحة الحيوانية، ذوبان في درجة الحرارة المحيطة قبل جمع جذع الدماغ لسهولة جمع. في بعض الظروف، يتم جمع العينات مباشرة من الحيوانات المجمدة.
  2. بالنسبة للالحيوانات التي يتم جمعها حديثًا أو التي تم إذابتها إلى درجة الحرارة المحيطة، ضع السوبين الحيواني على سطح مستو مع العمود الفقري العنقي الذي يدور قليلاً نحو الفاحص. Palpate لتحديد المفصل الأكانتو القذالي على الجانب الجانبي للعمود الفقري العنقي.
    1. للجثث التي لا تزال مجمدة تماما، ووضع supine الحيوان كما هو موضح أعلاه، إذا كانت عملية. استخدام المناشير والسكاكين والمقصات العظام أو معدات مماثلة لفصل الرأس تماما من الجسم.
      ملاحظة: وينبغي تنظيف جميع المعدات المستخدمة التي لا تستخدم لمرة واحدة بدقة بين العينات.
  3. باستخدام شفرة مشرط، قم بإجراء شق على مستوى المفصل القذالي الأكانتو في الجانب البطني، وقطع جميع طبقات العضلات والأنسجة الرخوة، بما في ذلك القصبة الهوائية والمريء. استمر حتى تقريب الجانب الأمامي من فقرات العمود الفقري العنقي. للأنسجة المجمدة، استخدم شفرة مشرط لإزالة أي طبقات متبقية من العضلات والأنسجة الرخوة لفضح ماغنوم اللبو.
  4. نقل رأس الحيوان إلى تمديد المدى النهائي حتى جذع الدماغ مرئية. استخدم شفرة مشرط لإزالة جميع أنسجة جذع الدماغ/الجهاز العصبي المركزي المرئية لأخذ العينات. للحصول على عينة مجمدة، استخدم شفرة مشرط لإزالة أكبر قدر ممكن من أنسجة جذع الدماغ/الجهاز العصبي الوطني المجمدة من داخل الجمجمة.
  5. وضع عينات جذع الدماغ في حاوية غير قابلة للكسر (أي القصدير مرهم معدني، القارورة بالتبريد، وما إلى ذلك) والتسمية وفقا لذلك.
  6. تأكد من أن عينات جذع الدماغ يتم اختبارها مباشرة بعد جمعها عن طريق اختبار DRIT، المبردة (4 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل الاختبار، أو المجمدة (-20 درجة مئوية) حتى وقت الاختبار إذا كان الاختبار سيتم أكثر من 24 ساعة بعد جمع العينة.

2. إعداد المواد لDRIT

  1. إعداد 10 أطباق تلطيخ الشرائح (الشكل 1)
    ملاحظة: أطباق تلطيخ عميقة بما فيه الكفاية للسماح لغمر كامل من الشريحة (قطرها 96 ملم، وارتفاع 72 ملم، وعمق 42 ملم، وحجم 250 مل). 6
    1. ملء طبق 1 مع 10٪ الفوسفات المخزنة رسميان المخزنة. استبدال الفورماين بعد 2 تشغيل الاختبار أو أسبوعيا.
    2. ملء الأطباق 2، 4، و 5 مع الفوسفات المخزنة المالحة مع 1٪ توين-80 (TPBS). يستعاض عنها بـ TPBS جديدة قبل كل اختبار.
    3. ملء طبق 3 مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪. استبدال بيروكسيد الهيدروجين قبل كل اختبار.
    4. ملء الأطباق 6 و 8 و 9 و 10 مع الماء المقطر أو منزوع الأيونات. استبدال الماء قبل كل اختبار.
    5. ملء طبق 7 مع صياغة هيماتوإكسلين جيل #2 المخفف ة في نسبة 1:1 في الماء المقطر6. استبدال هيماتوإكسلين بعد 2 أشواط الاختبار أو أسبوعيا.
      ملاحظة: وفقا لبروتوكول DRIT الأصلي التي وضعتها CDC12، يمكن استخدام نسبة 1:2 من الخلل هيماتوإكسيلين إلى الماء إذا كان التلطيخ المضاد مظلما جدا.
  2. إعداد محلول الأسهم الأمينية-إيثيلكاربازول (AEC)
    1. باستخدام ماصة زجاجية، ضع 5 مل من N، N-dimethylformamide في وعاء زجاجي.
    2. إضافة قرص واحد 20 ملغ من 3-أمينو-9-إيثيلكاربازول ويهز حتى يذوب تماما. تسمية جرة مع "AEC الأسهم" وتاريخ إجراء الأسهم.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول مخزون AEC تحت التبريد (4 درجة مئوية) واستخدامه لمدة 1-2 أشهر.
  3. إعداد تخفيف عمل الجماعة الاقتصادية الأفريقية
    1. إضافة 7 مل من العازلة خلات إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    2. باستخدام ماصة زجاجية، أضف 0.5 مل من محلول مخزون AEC إلى أنبوب الطرد المركزي.
    3. إضافة 0.075 مل من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ إلى الأنبوب.
    4. تصفية الحل باستخدام حقنة 10 مل باستخدام فلتر حقنة 0.45 ميكرومتر.
      ملاحظة: يجب إنشاء تخفيف العمل AEC فقط قبل كل اختبار DRIT كما أنها مستقرة فقط لمدة 2-3 ساعة.

3. اختبار الكيمياء المناعية السريعة المباشرة

  1. تسمية الزجاج المجهر الشرائح مع عدد فريد من نوعه لكل عينة باستخدام مسحة واقية، للماء، علامة الحبر الدائم.
    1. باستخدام شفرة مشرط، قم بإزالة جذع الدماغ من الحاوية ومكانه على منشفة ورقية. لطخة بلطف بعيدا أي فائض من السوائل, الدم, أو الفراء مع منشفة ورقية ثانية للكشف عن الأنسجة الجذعية للدماغ فقط13. إذا لزم الأمر، قسم أنسجة جذع الدماغ للكشف عن مقطع عرضي.
    2. لمس بلطف جدا الشريحة المجهر إلى المقطع العرضي من أنسجة جذع الدماغ. لمس الشريحة إلى جذع الدماغ في عدة نقاط دون حركة جانبية للسماح لمناطق متعددة من جذع الدماغ ليتم نقلها إلى الشريحة13. تأكد من نقل 1 أو 2 طبقات فقط من الخلايا من أنسجة الدماغ إلى الشريحة بلمسة لطيفة. لا حاجة إلى عامل تصاعد لتثبيت أنسجة جذع الدماغ إلى الشرائح. تضمين كل من عنصر تحكم إيجابي وسلبي في كل تشغيل DRIT.
  2. اسمحوا الشرائح الهواء الجاف لمدة 5 دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
  3. تزج الشرائح في 10٪ الرسمي المخزنة لمدة 10 دقيقة (طبق 1).
  4. إزالة الشرائح من شكلي وشطف تراجع في حل TPBS (الطبق 2).
  5. تزج الشرائح في بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 10 دقائق (طبق 3).
  6. إزالة الشرائح من بيروكسيد الهيدروجين وتراجع شطف في TPBS الطازجة (الطبق 4). بعد إزالة بيروكسيد الهيدروجين الزائد، ضع الشرائح في TPBS الطازجة (الطبق 5) والعمل مع شريحة واحدة في وقت واحد في حين أن الشرائح الأخرى تبقى مغمورة في TPBS.
  7. تأخذ الشرائح من TPBS (طبق 5) واحد في وقت واحد، ويهز قبالة ووصمة عار العازلة الزائدة، ووضعها على منشفة ورقية مبللة على مقاعد البدلاء المختبر، كأساس ل "غرفة الرطوبة". باستخدام ماصة، إسقاط ما يكفي من الأجسام المضادة لفيروس مكافحة داء الكلب الأولية على كل شريحة لتغطية أنسجة الجهاز العصبي الوطني. احتضان الشرائح لمدة 10 دقيقة في غرفة الرطوبة (أي، تغطي الشرائح مع لوحات جيدة أو غيرها من غطاءبسيط أثناء وضعها على منشفة ورقية مبللة) في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2).
  8. إزالة الشرائح من غرفة الرطوبة، يهز ووصمة عار قبالة conjugate الزائدة، وتراجع شطف الشرائح في TPBS (إعادة استخدام نفس TPBS في الطبق 5).
  9. العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، في حين أن آخرين البقاء مغمورة في TPBS - استخدام ماصة لإسقاط ما يكفي من مجمع streptavidin-بيروكسيداز لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركز. حضانة في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. إزالة الشرائح من غرفة الرطوبة، يهز ووصمة عار قبالة مجمع الزائدة، وتراجع شطف الشرائح في TPBS (الطبق 5).
  11. العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، والتخلص من ووصمة عار المخزن المؤقت الزائد، في حين أن آخرين البقاء مغمورة في TPBS - استخدام ماصة لإسقاط ما يكفي من AEC (يتم شرح التحضير أعلاه، وينبغي أن يتم ذلك مباشرة قبل الاستخدام) لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركز. حضانة في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  12. تراجع شطف الشرائح في الماء المقطر (طبق 6).
  13. ضع الشرائح في طبقة مضادة من جيل هيماتوكسيلين (مخفف1:1 مع الماء المقطر) لمدة دقيقتين (الطبق 7).
  14. على الفور تراجع شطف جميع الشرائح في الماء المقطر (طبق 8). كرر مرتين مع المياه العذبة في كل مرة (أطباق 9 و 10).
  15. العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، في حين أن الآخرين البقاء مغمورة في الماء المقطر (الطبق 10) - يهز ووصمة عار من الماء الزائد واستخدام وسيلة تركيب قابلة للذوبان في الماء لتثبيت زلة غطاء.
  16. استخدام المجهر الخفيف مع هدف 20X لعرض الشرائح والهدف 40X إذا كان هناك حاجة إلى فحص أوثق.

النتائج

تظهر النتائج الإيجابية من DRIT التضمينات الفيروسية الحمراء intracytoplasmic التي يمكن أن تختلف في الشكل والحجم (الشكل 3) داخل السيتوبلازم من أجسام الخلايا المزرقة. تظهر التضمينات ناعمة مع هوامش مشرقة جداً ومنطقة مركزية أقل كثافة. يتم تسجيل الكثافة وتوزيع المستضد عند الكشف عن التضمينات. يتم تقدير الكثافة من +4 إلى +1. يجب أن يكون الشريحة التحكم الإيجابي مكثفة, تألق أرجواني صارخ الذي يشار إليه على أنه +4 كثافة. يمكن أن يحدث فقدان طفيف للون خاصة عندما لم يكن التعامل مع العينة الأمثل (أي أن الأنسجة عينة قد تحللت قليلا) وينبغي تصنيف هذه على أنها +3. يتم تصنيف وصمة عار مملة بشكل ملحوظ على أنها +2 إلى +1، لا تعتبر تشخيصية للعدوى بفيروس داء الكلب ووصفت بأنها غير محددة.

بالإضافة إلى ذلك، يتم تصنيف توزيع المستضد من +4 إلى +1 مع +4 الذي يمثل توزيع المستضد اتّصل بوفرة من التضمينات الكبيرة والصغيرة التي تختلف في الحجم والشكل، وموجودة في كل مجال (أو كل حقل تقريبًا) من العرض داخل أنسجة الجهاز العصبي الوطني لمس الانطباع. يحتوي عنصر التحكم الإيجابي عادةً على توزيع مستضد +4. سيتم تعيين توزيع مستضد +3 عندما تكون هناك تضمينات في مجموعة متنوعة من الأحجام في معظم مجالات العرض وليس كلها. إذا تم العثور على التضمينات في 10٪ -50٪ من حقول المجهر، يتم تعيين توزيع مستضد +2. عند العثور على التضمينات في <10% من حقول المجهر، يتم تعيين توزيع مستضد +1.

معظم أنسجة الجهاز العصبي الوطني مع فيروس داء الكلب الحالية تظهر التضمينات الفيروسية النموذجية التي تم تصنيفها على أنها +3 أو +4 كثافة وتوزيع مستضد. إذا كانت النتائج تشير إلى كثافة +2 أو +1 أو توزيع مستضد +2 أو +1، يتم تعريف العينة "غير محدد" ويكون هناك ما يبرر تكرار الاختبار. إذا كانت نفس العينة لديها نتيجة اختبار غير محددة تكرار، يجب إرسال العينة إلى مختبر مرجعي لDFA أو الاختبارات التأكيدية ذات الصلة.

تعتبر عينة الاختبار التي تستخدم DRIT سلبية لمستضدات فيروس داء الكلب بعد مسح الشريحة التي تحتوي على أنسجة الجهاز العصبي الوطني عندتكبير 200X أو أكثر ولم يتم الكشف عن أي إدراجات فيروس نموذجية (الشكل 4). عينات سلبية تظهر أجسام الخلايا مزرق مع تلطيخ قليلا أو لا محددة.

figure-results-1
الشكل 1: إعداد 10 أطباق تلطيخ الشرائح مع الكواشف للاختبار. يتم تسمية الأطباق مع اسم كاشف في الترتيب اللازم لمتابعة البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: غرفة الرطوبة بسيطة تم إنشاؤها باستخدام منشفة ورقية مبللة ولوحات ثقافة الخلية.  غرفة الرطوبة بسيطة باستخدام منشفة ورقية مبللة ولوحات ثقافة الخلية يسمح للتطبيق الميداني.  الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الشرائح التمثيلية لداء الكلب التضمينات الفيروسية الإيجابية مع +4 كثافة وتوزيع مستضد +4. (A و B)تظهر التضمينات الفيروسية داء الكلب إيجابية في التكبير 200x. (C و D)تظهر التضمينات الفيروسية داء الكلب إيجابية في التكبير 400x. قضبان مقياس = 5 ميكرومتر.

figure-results-4
الشكل 4: شرائح تمثيلية من العينات السلبية مع عدم وجود شوائب فيروسية داء الكلب. (A و B)تظهر عينات سلبية لالشموة الفيروسية داء الكلب في التكبير 200x. (C و D)تظهر عينات سلبية لالشموة الفيروسية داء الكلب في التكبير 400x. قضبان مقياس = 5 ميكرومتر.

figure-results-5
الشكل 5: الصور التمثيلية لمرافق اختبار DRIT التي تستخدمها وزارة الزراعة الأمريكية WS. (أ) مرفق اختبار متنقل في مقطورة مغلقة للنقل. (ب) مركبة ترفيهية تم تعديلها لاختبار DRIT. (ج) مرفق اختبار DRIT بالتعاون مع مختبر الجامعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

وDRIT هو طريقة مرنة مناسبة للمراقبة الميدانية للكشف عن وجود فيروس داء الكلب التي يمكن استخدامها في مناطق المختبرات اللامركزية. في حين أنه من الممكن إجراء الاختبار بأكمله في بيئة ميدانية مثل على الباب الخلفي للشاحنة، فمن المثالي أن يكون هناك مساحة داخلية صغيرة مخصصة لDRIT بسبب المواد الكيميائية والمعدات وقضايا تخزين الإمدادات. بالإضافة إلى ذلك، يجب النظر في الالتزام بجميع القوانين الاتحادية وقوانين الولايات والقوانين المحلية المعمول بها، واللوائح الخاصة باستخدام المواد الكيميائية والتخلص منها. حاليا، وزارة الزراعة WS لديها 15 مرافق DRIT لاختبار عينات من 17 ولاية. يتم إنشاء مرافق وزارة الزراعة الأمريكية WS DRIT بالتعاون مع مختبرات الصحة العامة الجامعية والحكومية، في غرف مخصصة داخل مرافق أكبر وفي مقطورات مغلقة تم تعديلها وتحويلها لتكون بمثابة وحدات اختبار متنقلة في حالة الاستجابة لفاشية الطوارئ حيث اختبار مراقبة داء الكلبالمعزز مع وقت التحول الفوري أمر بالغ الأهمية (الشكل 5).

في حين أن الاختبار كان ناجحا باستخدام مادة جذع الدماغ ذات جودة متغيرة، الأنسجة الجذعية الجديدة مع عدم وجود تحلل الأنسجة هو الأمثل. كما يحدث التحلل، والجفاف، أو تسييل، وانخفاض نوعية العينة والاختبار قد الكشف عن تلطيخ أكثر غير محددة التي يمكن أن تخلط بين النتائج. هذه الملاحظة مماثلة بين DFA وDRIT2. وينبغي جمع جذع الدماغ/الجهاز العصبي المركزي في أقرب وقت ممكن ثم تخزينها مجمدة (-20 درجة مئوية) حتى الاختبار.

بشكل عام، معظم USDA WS مرافق عملية من 12 إلى 24 الشرائح في وقت واحد أثناء جلسة DRIT، بما في ذلك عنصر تحكم إيجابي واحد وعنصر تحكم سلبي واحد التي تم تأكيدها عبر DFA. وتوفر الضوابط الإيجابية والسلبية نقطة مرجعية لكل تشغيل DRIT لضمان نجاح الاختبار وللتأكد مما إذا كانت الأسئلة التفسيرية تنشأ على شرائح الاختبار. إذا لم يتم تحديد عينة أن يكون لها نتيجة إيجابية أو سلبية واضحة، يتم وصفها بأنها غير محددة واختبارها مرة ثانية من قبل DRIT. إذا لم تكن هذه العينة إيجابية أو سلبية واضحة بعد اختبارين DRIT، يتم إرسالها إلى مختبر مرجعي لDFA أو الاختبارات ذات الصلة.

كما هو الحال مع أي اختبار تشخيصي، "مشكلة اطلاق النار" مفيد مع نتائج غير متوقعة. على سبيل المثال، إذا كان تشغيل DRIT غير ناجح (أي، لا يعرض عنصر التحكم الإيجابي +3 أو +4 كثافة تلطيخ وتوزيع مستضد)، تأكد من عدم انتهاء صلاحية كافة المواد الكيميائية والكواشف. لقد وجدنا باستخدام زجاجة مفتوحة حديثا من بيروكسيد الهيدروجين في الحد الأدنى مرة واحدة في الأسبوع هو مفيد للمساعدة في منع تلطيخ غير محددة من خلال أكسدة أنسجة الدماغ. بالإضافة إلى ذلك، نوصي استبدال المخزن المؤقت خلات مرة واحدة على الأقل كل عام على الأقل، بغض النظر عن تاريخ انتهاء الصلاحية المسمى.

هناك عدد من المزايا من DRIT على DFA بما في ذلك انخفاض التكاليف، والقدرة على إجراء الاختبار خارج مختبر مركزي، والحاجة إلى مجهرية خفيفة فقط بدلا من المجهر الفلورسنت، وعملية التدريب مباشرة نسبيا ل الناس إدارة وقراءةالاختبار 2،3،4. وقد أثبتت هذه المزايا، إلى جانب حساسية وخصوصية DRIT التي يمكن مقارنتها DFA2و7و8و9 أن الاختبار بمثابة أداة هامة على نطاق واسع تعزيز برامج مراقبة داء الكلب8،10 في أمريكا الشمالية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسمح هذه اللجنة بزيادة المراقبة والاختبار الفوري في البلدان النامية أو في مناطق أخرى ذات موارد محدودة، لا سيما بعد التوجيهات الأخيرة التي أصدرتها منظمة الصحة العالمية/منظمة الصحة العالمية كاختبار موصى به.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نحن نعترف بجميع موظفي خدمات الحياة البرية في وزارة الزراعة الأمريكية الذين قاموا حاليًا أو سبق لهم بجمع عينات معززة لمراقبة داء الكلب وأجروا DRIT لتشخيص داء الكلب. وبالمثل، نعترف بالعديد من المتعاونين الذين يساعدوننا في جمع مراقبة داء الكلب المعزز. كما نشكر مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها ومعهد ويستار على إمكانية الوصول إلى الكواشف الحرجة اللازمة لإجراء عملية DRIT وعلى توفير فرص التدريب. وبالإضافة إلى ذلك، نقدر التشخيص المؤكد والمساعدة التقنية التي تقدمها مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها ومركز وادسوورث مع وزارة الصحة في ولاية نيويورك. استخدام أي منتجات تجارية هو لأغراض المقارنة فقط ولا يشكل تأييد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3-أمينو-9-إيثيل كاربازول (أقراص AEC ؛ 50 قطعة)سيجما ألدريتش (https://www.sigmaaldrich.com/)A6926
أسيتات عازلة ، 0.1 متر ، 5.2 درجة حموضة ، 32 أوقيةبولي ساینتفيك آر آند D Corp. (https://www.polyrnd.com/)s140
Ag Tek MiniScalpel ، PN110 ، غير معقمة # 10 ، 40 لكل عبوةباترسون البيطرية (https://www.pattersonvet.com/)PN110المعدات التكميلية لعينة انطباعات اللمس ؛ متوفر أيضا من خلال Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok حقنة يمكن التخلص منها بدون إبرة ، 10 سم مكعبفيشر Scientific (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-823-2ABD رقم الشركة المصنعة 309604
مجهر ضوئي مجهر برأس Seidentopf أو ما يعادلهمن بائعين متعددين
أزرق مستطيل الشكل التخلص من الأمم المتحدة حاوية ، تغليف 5GBerlin (https://www.berlinpackaging.com/)1147T01BLUمعدات تكميلية لتخزين / التخلص من النفايات الكيميائية (محلول الهيماتوكسيلين الخياشيم و AEC) زجاج
الغطاء المربع والمستطيل Corning ، 24x60Fisher Scientific (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)12-553-465رقم الشركة المصنعة لشركة Corning 2975246
نصائح Corning Universal Fit Pipet: أرفف ، غير معقمة (1-200ul)فيشر ساينتفيك (جزء من https://www.fishersci.com/us/en/home.html Thermo Fisher Scientific )07-200-300رقم الشركة المصنعة لشركة Corning 4863
Falcon 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية ، البولي بروبيلينفيشر Scientific (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-959-70Cرقم الشركة المصنعة لشركة Corning 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (أغطية ألواح زراعة الأنسجة)Fisher Scientific (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)08-772-5Corning رقم الشركة المصنعة 353910
Fisher Brand 25mm فلتر حقنة ، نايلون ، 0.45 & mu ؛ م ، SterileFisher Scientific (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2) ، 4LFisher Scientific (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator حاويات الأدوات الحادة في نقطة الاستخدام ، 5 كوارتفيشر ساينتفيك (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-827-122المعدات التكميلية لإعداد مختبر BSL-2
المناسب Fluoro-Gel مع Tris Buffer (Gel / Mount Media) ، 20 ملVWR ، جزء من Avantor (https://vwr.com)102092-122بديل Fluoro-Gel ل BioMeda & Trade ؛ Gel-Mount ، علوم المجهر الإلكتروني
الفورمالين ، مخزن مؤقت ، 10٪ ، 4LFisher Scientific (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)SF100-4متوفر لكل منها أو في حالة 4
Gilson Pipetman P200 Pipet ، 50-200 & mu ؛ LDaigger Scientific (https://www.daigger.com)EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline ، 1x محلول ، 1 لتر (PBS)فيشر Scientific (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)SH30256LSيمكن استخدام منتج مسحوق جاف بديل
بيروكسيد الهيدروجين ، 3٪بائعون متعددونأي مصدر متاح تجاريا ، مثل الصيدليات أو العلامات التجارية للمتاجر ، إلخ.
مجهر العدسة 20x و 40xبائعين متعددين منظف
مطهر ربع سنوي Lysol IC ، 1GDaigger Scientific (https://www.daigger.com)EF8481مواد تكميلية للتطهير المختبري BSL-2
مشرط يمكن التخلص منه من ماركة Miltex مقاس 22 (حجم بديل ل MiniScalpel)AMD التالي (www.amdnext.com)999112314المعدات التكميلية لعينة من انطباعات اللمس. الحجم البديل ل Ag Tek MiniScalpel
N ، N-Dimethylformamide ، عبوات زجاجية كهرمانية ، 500 ملفيشر Scientific (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)D119-500
بيروكسيداز المسمى ستربتافيدين ، 50 ملSeraCare (https://www.seracare.com/)5550-0001المقايسة المناعية ومجموعات KPL الرقم المرجعي 71-00-38
مسحوق ملحي مخزن الفوسفات (بديل ل فيشر السائل PBS)سيجما ألدريتش (https://www.sigmaaldrich.com/)P3813يجب تحضيره في 1 لتر ماء مقطر. متوفر بكميات 1 و 10 و 50 عبوة
الجسم المضاد الأساسي: متعدد النسيلة مضاد للبروتين النووي أو مزيج من الأجسام المضادة الحيوية المضادة لفيروس Lyssa C
PYREX ماصات مصلية يمكن التخلص منها ، زجاج ، معقمة ، سدتها ، كورنينج ، 1.0 ملVWR ، جزء من Avantor (https://vwr.com)7078D-1VWR رقم الشركة المصنعة 89091-220
PYREX ماصات مصلية يمكن التخلص منها ، زجاج ، معقمة ، موصولة ، Corning ، 10.0 ملVWR ، جزء من Avantor (https://vwr.com)7078D-10VWR رقم الشركة المصنعة 89091-106
PYREX ماصات مصلية يمكن التخلص منها ، زجاج ، معقمة ، موصولة ، Corning ، 5.0 ملVWR ، جزء من Avantor (https://vwr.com)7078D-5VWR رقم الشركة المصنعة 89091-484
ريتشارد آلان Scientific Gills Hematoxylin Stain رقم 2 ، 1PT (بديل لما سبق)Fisher Scientific (جزء من Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)22-050-201Thermo Scientific رقم الشركة المصنعة 72504
حاملات شرائح ، VWR 24 مكانا، جزء من Avantor (https://vwr.com)25608-868ساكورا & ريج; رقم مورد Finetek 4465 ؛ متوفر من خلال بائعين متعددين
صناديق الصفيح عينات ، 1/2 أوقيةVWR ، جزء من Avantor (https://vwr.com)101412-452المعدات التكميلية لتخزين عينات أنسجة المخ
Taylor 2-Event Digital Timer / ClockMultiple Vendorsالمعدات التكميلية
Tissue-Tek Slide Staining KitVWR ، جزء من Avantor (https://vwr.com)25608-902ساكورا & ريج; رقم مورد Finetek 4551 ؛ متوفر من خلال بائعين متعددين
TWEEN 80 ، بولي إيثيلين جلايكول ، 500 ملSigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)P1754متوفر أيضا بأحجام 25 مل و 1 لتر و 1 جم
حشو ماصة VWR FLIP (0.05-100 مل)VWR ، جزء من Avantor (https://vwr.com)53497-055
VWR قفازات فحص النتريل الناعمة ، L (100 لكل صندوق)VWR ، جزء من Avantor (https://vwr.com)89038-272المعدات التكميلية لمياه معدات الوقاية الشخصية
المناسبة ، منزوعة الأيونات (20 لترا)VWR ، جزء من أفانتور (https://vwr.com)10806-022
قوارير عينة زجاجية شفافة من Wheaton ، 8 ملفيشر سينتيفيك (جزء من https://www.fishersci.com/us/en/home.html Thermo Fisher العلمي06-408Cرقم الشركة المصنعة لعلوم الحياة DWK 224884
شرائح مجهر بنمط بئر مزدوج مطلية باللون الأبيض ، 14 ممTekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)2-140
حاوية التخلص من النفايات الكيميائية المستطيلة الشكل ، تغليف 5GBerlin (https://www.berlinpackaging.com/)1147T01WHTالمعدات التكميلية لتخزين / التخلص من النفايات الكيميائية (الفورمالين)
هدف المناسب يحفظ عند 4 درجات ؛)

المراجع

  1. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. 23, World Health Organization. eds 88-89 (1996).
  2. Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206(2008).
  3. Rupprecht, C., et al. Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
  4. Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
  5. Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
  6. Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , Centers for Disease Control and Prevention. (2016).
  7. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  8. Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21(2017).
  9. Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189(2014).
  10. Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34(2017).
  11. Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549(2009).
  12. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols. , Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019).
  13. Khalid, A., Haque, A. Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AEC 10 TPBS

مقالات ذات صلة