مقالة منهجية

إجراءات التشغيل الموحدة لمراقبة فيروس ليسا لسكان الخفافيش في تايوان

DOI:

10.3791/59421

⸱

أغسطس 27, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Health Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan, 2Institute of Ecology and Evolutionary Biology, National Taiwan University, 3Bat Conservation Society of Taipei

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول إجراء تشغيل مختبري قياسي للاختبار التشخيصي لمستضدات فيروس ليسا في الخفافيش في تايوان.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفيروسات داخل جنس Lyssavirus هي مسببات الأمراض الحيوانية، ويرتبط ما لا يقل عن سبعة أنواع فيروس ليسا مع الحالات البشرية. لأن الخفافيش هي الخزانات الطبيعية لمعظم الفيروسات الليسافية، وقد تم تنفيذ برنامج مراقبة فيروس ليسا من الخفافيش في تايوان منذ عام 2008 لفهم بيئة هذه الفيروسات في الخفافيش. وفي هذا البرنامج، تعاونت المنظمات غير الحكومية المعنية بحفظ الخفافيش والمراكز المحلية لمكافحة الأمراض الحيوانية لجمع الخفافيش الميتة أو الخفافيش التي تموت بسبب الضعف أو المرض. تم الحصول على أنسجة الدماغ من الخفافيش من خلال المحاصيل الفلورية وإخضاعها لاختبار الأجسام المضادة الفلورسنت المباشر (FAT) والنسخ العكسي تفاعل البوليميراز سلسلة (RT-PCR) للكشف عن مستضدات فيروس ليسا والأحماض النووية. بالنسبة للدهون، يوصى باثنين على الأقل من التتقارنات المختلفة لتشخيص داء الكلب. بالنسبة لـ RT-PCR، تُستخدم مجموعتان من المواد التمهيدية (JW12/N165-146 وN113F/N304R) لتضخيم تسلسل جزئي لجين البروتين النووي للفيروس الليسا. يراقب برنامج المراقبة هذا الفيروسات الليسافيروسية وغيرها من العوامل الحيوانية في الخفافيش. تم العثور على فيروس الخفافيش التايوانية في حالتين من بيبيستريلي اليابانية(Pipistrellus abramus)في 2016-2017. وينبغي أن تبلغ هذه النتائج الجمهور والمهنيين الصحيين والعلماء بالمخاطر المحتملة للاتصال بالخفافيش وغيرها من الأحياء البرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفيروسات داخل جنس Lyssavirus هي مسببات الأمراض الحيوانية. هناك ما لا يقل عن سبعة أنواع فيروس ليسا المرتبطة الحالات البشرية1. بالإضافة إلى 16 نوعا في هذا الجنس1،2،3، تايوان الخفافيش lyssavirus (TWBLV)4 وKotalahti الخفافيش lyssavirus5 تم تحديدها مؤخرا في الخفافيش ، ولكن حالاتها التصنيفية لم يتم تحديدها.

الخفافيش هي المضيفين الطبيعيين لمعظم الفيروسات الليسافية، باستثناء موكولا ليسافيروس وإيكوما ليسافيروس، والتي لم يتم تحديدها حتى الآن في أي الخفافيش1،2،3،6. لا تزال المعلومات المتعلقة بالفيروسات الليسافية في الخفافيش الآسيوية محدودة. تم الإبلاغ عن اثنين من الفيروسات lyssasaغير مميزة في الخفافيش الآسيوية (واحد في الهند والآخر في تايلاند)7،8 تم الإبلاغ عنها. تم الإبلاغ عن حالة واحدة من حالات داء الكلب البشري المرتبطة لدغة الخفافيش في الصين في عام 2002، ولكن تم التشخيص فقط عن طريق المراقبة السريرية9. في آسيا الوسطى، تم التعرف على فيروس أرافان ليسا في الخفافيش أقل ماوس الأذنين(Myotis blythi)في قيرغيزستان في عام 1991، وتم التعرف على فيروس Khujand lyssa في الخفافيش شعيرات (Myotismystacinus)في طاجيكستان في عام 200110. في جنوب آسيا، تم التعرف على Gannoruwa الخفافيش lyssavirus في الثعلب الطائر الهندي(Pteropus medius)في سري لانكا في عام 20153. في جنوب شرق آسيا، أظهرت العديد من الدراسات المصلية على الخفافيش في الفلبين وتايلاند وبنغلاديش وكمبوديا وفيتنام الانتشار المصلي المتغير11،12،13،14، 15. على الرغم من أنه تم التعرف على فيروس إركوت ليسا في الخفافيش أكبر أنبوب أنف(مورينا leucogaster)في مقاطعة جيلين، الصين في عام 201216،لا تزال الأنواع بالضبط ومواقع lyssaviruses في مجموعات الخفافيش شرق آسيا غير معروفة.

ولتقييم وجود فيروس الليسا في مجموعات الخفافيش التايوانية، بدأ تنفيذ برنامج مراقبة يستخدم كلا ً من فيروس FAT المباشر وRT-PCR. تم التعرف على فيروس الخفافيش التايوانية في حالتين من البيبيسترلي الياباني(Pipistrellus abramus)4 في 2016-2017. في هذه المقالة، يتم إدخال إجراء تشغيل قياسي مختبري لمراقبة فيروس الليسا لسكان الخفافيش في تايوان. يتم عرض الرسم البياني لتدفق تشخيص فيروس الخفافيش في مختبرنا في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. احتياطات السلامة عند التعامل مع الفيروسات الليسافيروسية

  1. التأكد من أن جميع العاملين في المختبرات الذين يتعاملون مع عينات الخفافيش يتلقون الوقاية من داء الكلب قبل التعرض17. مراقبة مستويات الأجسام المضادة لداء الكلب من العمال مسبقا وإعادة فحصها كل 6 أشهر17. مطلوب متابعة التطعيم ضد داء الكلب لأولئك الذين مستويات الأجسام المضادة أقل من 0.5 وحدة IU/مل17.
  2. اعتمادا على أنظمة السلامة الأحيائية في البلد الذي يوجد فيه المختبر، تأكد من تنفيذ الإجراءات التالية في مختبرات مناسبة على مستوى السلامة الأحيائية (مثل مختبرات BSL-2 في تايوان ومختبرات BSL-3 في أستراليا)، وأن العمال مؤهلون حاليا وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة18.
    ملاحظة: التطعيم داء الكلب يوفر القليل من الحماية أو لا يمكن أن تكون من الفيروسات التي تنتمي إلى فيلوالمجموعات الثانية والثالثة18. ويجب إبلاغ العمال بأنه تم تحديد العديد من مسببات الأمراض الحيوانية في الخفافيش19 وينبغي أن تعالج العينات في ظل ظروف مختبرية مناسبة على مستوى السلامة الأحيائية مع معدات وقائية شخصية مناسبة.

2. جمع عينة

  1. استخدام وجدت الخفافيش ضعيفة أو مريضة أو الذبيحة.
    ملاحظة: يتم تسليم الخفافيش الضعيفة أو المريضة إلى جمعية حفظ الخفافيش في تايبيه للرعاية البيطرية أو البحوث، في حين يتم تقديم الذبيحة مباشرة إلى معهد بحوث صحة الحيوان. لم يتم قتل أي خفافيش صحية في برنامج المراقبة هذا.
  2. يكون عالم البيئة الخفافيش تحديد أنواع الخفافيش من خلال الخصائص المورفولوجية20.
  3. إجراء ترميز الحمض النووي من أنواع الخفافيش عندما يتم تشخيص lyssavirus إيجابية، وذلك باستخدام الإجراءات المنشورة سابقا21.
  4. تقديم ورقة معلومات عن كل جيفة الخفافيش (موقع جمع، والأنواع، والعلامات السريرية، وما إلى ذلك).

3. المحاصيل من عينات الخفافيش

  1. إعداد المواد.
    1. إعداد لوحة تشريح نظيفة ووضع وسادة ماصة معقمة لnecropsy.
    2. إعداد أنابيب جمع لجمع أجهزة الخفافيش.
    3. إعداد ملاقط المتاح ومشرط لnecropsy. تغيير الأدوات بين necropsy كل الخفافيش. إعداد كرات القطن مبللة مع الإيثانول 70٪ لتنظيف ملاقط ومشرط أثناء أخذ العينات.
    4. إعداد اثنين من الشرائح المجهر لFAT. جمع عينات جديدة وإصلاحها في حل رسمي لفحص الأنسجة المرضية.
  2. فحص جميع الفتحات الخارجية قبل necropsy. تصوير السمات الخارجية للخفافيش، وخاصة الرأس والأذنين والأجنحة، لتمايز الأنواع.
  3. جمع عينة مسحة عن طريق الفم. وضع الخفافيش في recumbency البطني على متن الطائرة وإصلاح رأس الخفافيش مع ملاقط. قطع الجلد على طول خط الوسط من calvaria مع مشرط وسحب الجلد إلى الجانبين الجانبي. قطع الجمجمة على طول خط الوسط من calvaria مع مشرط وفتحه مع ملاقط لفضح أنسجة الدماغ.
  4. إزالة أنسجة الدماغ من الجمجمة ووضعها على الاكتئاب اللسان المعقمة، وجعل مسحات الانطباع من أنسجة الدماغ (انظر الخطوة 4.2). جمع قطعة صغيرة من أنسجة الدماغ الطازجة وإصلاحه في formalin لفحص الأنسجة المرضية. احتواء أنسجة الدماغ المتبقية في أنبوب لاستخراج الحمض النووي.
  5. ملاقط نظيفة ومشرط مع كرات القطن مبللة مع الإيثانول 70٪ لإزالة الأنسجة المحتفظ بها بين جمع العينات.
  6. وضع الخفافيش على متن الطائرة في recumbency الظهرية وإصلاحه على متن الطائرة مع الإبر على جانبي axilla وكعب الذيل.
  7. نأي الجلد على طول خط الوسط من الجسم من الفك السفلي إلى فتحة الشرج. رفع وفصل الجلد والأنسجة العضلية الكامنة مع ملاقط. جمع الغدد اللعابية، والتي هي بالقرب من العظام الفكالسفلي.
  8. رفع القص قليلا مع ملاقط، وقطع القص وجدار البطن على طول خط الوسط مع مشرط. قطع الترقوة مع مشرط. إصلاح أقفاص الضلع الأيسر والأيمن إلى المجلس مع الإبر لفتح تجويف الصدر.
  9. تسجيل الآفات الإجمالية ودرجة التغيير بعد الوفاة.
  10. إزالة الأنسجة الحشوية (أي القلب والرئتين والكبد والكلى والأمعاء) من الذبيحة باستخدام ملاقط ومشرط. جمع العينات الحشوية حسب الحاجة للبحوث في المستقبل.
    ملاحظة: من المستحسن جمع عينات مكررة. وينبغي جمع واحد للتشخيص الجزيئي، والآخر ينبغي تجميدها في -80 درجة مئوية مع أو بدون وسيلة نقل الفيروسية للثقافة الفيروسية22.

4. اختبار الأجسام المضادة الفلورسنت المباشر (FAT)

  1. جعل مسحات الانطباع من أنسجة الدماغ لFAT. تنفيذ FAT كما هو موضح سابقا18،23 مع التعديلات التالية.
  2. قم بفصل أنسجة الدماغ بلطف عن الأنسجة العصبية المتصلة بملاقط ونقل أنسجة الدماغ إلى مُقِّب لللسان المعقمة. قطع المقطع العرضي من الدماغ، بما في ذلك جذع الدماغ والمخيخ18،23. جعل مسحات الانطباع من أنسجة الدماغ عن طريق لمس طفيفة سطح قطع أنسجة الدماغ، واضغط على الشريحة على أنسجة العدسة لإزالة الأنسجة الزائدة.
  3. إصلاح الشرائح مع الأسيتون في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. استخدام كل من اثنين من الأجسام المضادة المضادة لداء الكلب FITC المترافقة تجاريا لتلطيخ مستضد فيروس ليسا ينصح بشدة23. تحديد تركيز العمل من المتقارن ة التجارية قبل تلطيخ الأول. إسقاط الكدمات المخففة من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر على الشرائح واحتضان الشرائح في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة داخل غرفة رطبة.
  5. قم بتجفيف المتقارنالزائد من الشرائح واغسل الشرائح بمحلول ملحي مُسحّص بالفوسفات (PBS) بعد الحضانة.
  6. إسقاط كمية صغيرة من الجلسرين 10٪ على الشرائح وتغطية مع الشرائح غطاء.
  7. فحص الشرائح مع المجهر الفلورسنت.

5. استخراج الحمض النووي

  1. إضافة الحجم المناسب من MEM-10 (الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية المكملة مع 10٪ مصل البقر الجنيني) إلى أنسجة الدماغ (10٪ ث / الخامس).
  2. تجانس أنسجة الدماغ مع حبة الصلب 5 مم في أداة المجانسة والطرد المركزي في 825 × ز لمدة 10 دقائق.
  3. استخراج حمض النووية، والحجم النهائي منها هو 50 درجة مئوية، في غضون 200 درجة مئوية من supernatant باستخدام مجموعة استخراج حمض نووي الكلي المتاحة تجاريا مع أداة.

6. RT-PCR والتحليل الجيني

ملاحظة: تم نشر عدة مجموعات التمهيدي للكشف عن كافة الفيروسات lyssaالمعروفة أو lyssaviruses محددة. البروتوكول الموصوف هنا هو مثال يستخدم مختبرنا وقد لا يناسب جميع الاحتياجات التجريبية. حدد التمهيديات المناسبة وفقا لاحتياجات المختبر.

  1. إعداد الكاشف RT-PCR من خطوة واحدة على النحو التالي: إضافة 5 ميكرولتر من حمض نووي المستخرج إلى خليط التفاعل الذي يحتوي على 2.5 ميكرولتر من 10X احتياطي التفاعل، 0.5 ميكرولتر من التمهيديات الأمامية والعكسية (10 ميكرومتر لكل منهما)، 4 ميكرولتر من 1.25 مليون متر من الدنتب، 0.3 ميكرولتر من مثبطات RNase (40 U/μL) ، 0.3 ميكرولتر من النسخ العكسي (10 U/μL)، و0.4 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي (5 U/μL)، و 11.5 ميكرولتر من المياه المعالجة بـ DEPC.
    ملاحظة: مجموعة التمهيدي المستخدمة في هذا البروتوكول هو JW12 (5 '-ATGTACACCYCTACAATG-3') و N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24. تعديل إعداد الكواشف وظروف ركوب الدراجات وفقا لمجموعات التمهيدي المستخدمة.
  2. أداء ركوب الدراجات في ظل الظروف التالية: الحضانة في 42 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة; النُضر الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 s, 55 °C ل 30 s, و 72 °C ل 30 s; وأخيرا، مزيد من التمديد في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. استخدام مجموعة أخرى أو أكثر التمهيدي لزيادة حساسية التشخيص.
    1. استخدام N113F (5'-GTAGGGTTATATGGG-3') و N304R (5'-TTGACGAGAATCTTTCTCAT-3')25،26 لإعداد الكاشف RT-PCR خطوة واحدة على النحو التالي: إضافة 5 ميكرولتر من حمض نووي المستخرجة إلى خليط رد فعل يحتوي على 5 ميكرولتر من 10X العازلة، 5 ميكرولتر من التمهيديات الأمامية والعكسية (4 ميكرومتر لكل منها)، 5 ميكرولتر من 1.25 مليون متر من الدنتوب، 0.5 ميكرولتر من مثبطات RNase (40 U/μL)، 0.2 ميكرولتر من النسخ العكسي (10 U/μL)، 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي (5 U/μL)، و23.3 ميكرولتر من المياه المعالجة بـ DEPC.
    2. أداء ركوب الدراجات في ظل الظروف التالية: الحضانة في 42 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة; النُضر الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 20 درجة، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ وأخيرا، مزيد من التمديد في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: اعتمادا على الاحتياجات المختبرية، واختيار التمهيديات المناسبة للتشخيص. تم تصميم N113F في الأصل لتضخيم فيروس داء الكلب، ولكن قد لا تعمل بشكل جيد لفيروسات lyssas الأخرى. مجموعة من N113F و N304R يعمل بشكل جيد لفيروس داء الكلب (تايوان النمس الغرير البديل) وتايوان الخفافيش lyssavirus. سيكون من الأسهل الحصول على تسلسل البروتين النووي كله باستخدام مجموعة من التمهيديات JW12 و N304R إذا تم تضخيم ليسافيروس من قبل كل من اثنين من مجموعات التمهيدي أعلاه.
  4. تحليل المنتج PCR على 2٪ الأوروز جل الكهربائي وتصور من قبل الأشعة فوق البنفسجية الإضاءة الخفيفة.
  5. تسلسل المنتج PCR حسب خدمة التسلسل التجاري.
  6. أدخل أو حمّل التسلسل إلى صفحة ويب أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST). حدد قاعدة البيانات "الآخرين (NR الخ)" وأدخل الكائن الحي كفيروس Lyssavirus. حدد خوارزمية MegaBlast وتشغيل BLAST.

7. فيروس العزلة

ملاحظة: تنفيذ عزل الفيروس عند إما 1) FAT أو 2) يشير RT-PCR الإيجابية.

  1. تجانس عينة الدماغ في تعليق 10٪ (ث / الخامس) في MEM-10. الطرد المركزي في 825 × ز لمدة 10 دقائق.
  2. تلقيح 200 درجة مئوية من supernatant مع تعليق 3 × 106 MNA (الماوس ورم الخلايا العصبية) الخلايا في 1 مل من MEM-10 لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع 1٪ CO2. نقل تعليق الدماغ خلية متجانسة إلى قارورة 25 سم2 وإضافة 6 مل من MEM-10.
  3. زراعة 1 مل من الدماغ تعليق خلية متجانسة في 4 الشريحة الزجاجية المغلفة تفلون جيدا مع قطر 6 ملم في نفس الوقت.
  4. بعد 3-4 أيام من الحضانة في 37 درجةمئوية مع 1٪ CO 2، إصلاح الخلايا على الشريحة 4 جيدا مع الأسيتون 100٪ (v / v).
  5. وصمة عار الشرائح مع اثنين من الأجسام المضادة لداء الكلب FITC المترافقة بعد الخطوات 4.4-4.7. يتم إصابة الخلايا عندما يتم التحقيق في التضمينات intracytoplasmic. تسجيل النسبة المئوية للخلايا المصابة.
  6. إجراء التغريب والثقافة الفرعية لثقافة الخلية الملقحة عندما تكون الشرائح ملطخة بالسالبة:
    1. إزالة المتوسطة وشطف قارورة مع 5 مل من PBS.
    2. إضافة 1 مل من التربسين إلى قارورة وضرب بحزم الجزء السفلي من قارورة.
    3. إضافة 6 مل من MEM-10 وإعادة تعليق الخلايا.
    4. وضع تعليق الخلية في قارورة الأنسجة الجديدة (6 مل) وعلى شريحة 4 جيدا (1 مل).
  7. كرر الخطوات 7.4-7.6 حتى يتم الوصول إلى العدوى 100%.
  8. جمع supernatant بعد 24 ساعة من الحضانة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الفترة من عام 2014 إلى مايو 2017، تم جمع 332 جثة خفاش من 13 نوعاً للمراقبة. اثنين من اختبار إيجابي. في حالة الخفافيش الأولى، تم اختبار انطباع الدماغ سلبيًا باستخدام FAT مع أحد الأجسامالمضادة لداء الكلب التجاري المترافق ة في تَكْتَبَد (الشكل 2)، في حين أن ّ الـ RT-PCRs التي تستخدم كل من المجموعتين التمهيديتين (JW12/N165-146 وN113F/N304R) أسفرت عن نتائج إيجابية(الشكل 3). تم الحصول على تسلسل 428 نقطة أساس من amplicon (تضخيم مع N113F/N304R وتحتوي على جين البروتين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر إجراء التشغيل القياسي المختبري (SOP) عملية تسلسلية لاختبار عينات الخفافيش لوجود مستضدات فيروس ليسا في تايوان. وتشمل الخطوات الرئيسية توظيف FAT وRT-PCR. ومن المهم أيضا اختيار العينات المناسبة والعزل الناجح للفيروس. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها أثناء مراقبة lyssaviruses الخفافيش. وكان الفرق الرئيسي هو الحيوانات المستهدفة. في البداية (2008-2009)، كانت الحيوانات المستهدفة من مراقبة فيروس الخفافيش الخفافيش الخفافيش الحية، التي حوصرت في جزيرة كينمن في تايوان ثم اختبارها للفيروس الليسا بعد القتل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يُعلن عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر تيان - تشنغ لي، ويي - تانغ لين، وشيا - جونغ تساي، ويا لان لي على مساعدتهم خلال هذه الدراسة. وقد تم دعم هذه الدراسة بمنحة رقم 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) من مكتب التفتيش على صحة الحيوان والنبات والحجر الصحي، مجلس الزراعة، يوان التنفيذي، تايوان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2.5٪ تربسين (10x)جيبكو15090046التربسين
25 سم < sup >2< / sup> قارورةGreiner bio-one690160
AcetoneHoneywell32201-1L
Agarose IVWR Life Science97062-250
الكحولكاشف NIHON SHYAKUNS-32294
AMV النسخ العكسيPromegaM5101
مضاد حيوي مضاد للفطريات (100X)  جيبكو15240-062MEM-10
بليدبراونBA215
طرد مركزيeppendorf5424R
نظام التلألؤ الكيميائيTOP BIO CO.MGIS-21-C2-1M
أنبوب جمعQiagen990381
أنبوبSSI2341-SO
غطاء الشريحةMuto Pure Chemical Co.، LTD.24505
محلل الحمض النوويالأنظمة الحيوية التطبيقية3700XL
مصل الأبقار الجنينيجيبكو10437028MEM-10
FITC مكافحة داء أحادي النسيلة الجلوبيولينFujirebio Diagnostic Inc.800-092الأجسام المضادة لداء المترافقة FITC: الكاشف B
شريحة زجاجية مطلية بالتفلون بأربعة آبارThermo Fisher Scientific30-86H-WHITE
الرحلان الكهربائي للجلالعلوم الرئيسيةMJ-105-R
HBSS (1x)حاضنة Gibco14175095التربسين
ASTECSCA-165DS
مجهر مقلوبأوليمبوسIX71
L-جلوتامين 200 ملي مولار (100x)GibcoA2916801MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS كاشف داء الدهنيةEMD Millipore Corporation5100الأجسام المضادة لداء المترافقة FITC: الكاشف A
MagNA Pure Compact InstrumentRoche03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1Roche03730964001
MEM (10x)Gibco11430030MEM-10
MEM NEAA (100x)Gibco11140050MEM-10
MEM محلول فيتامينGibco11120052MEM-10
NaHCO3Merck1.06329.0500MEM-10
إبرةTerumoNN * 2332R9
PBSMedicago09-8912-100
توليف التمهيديمهمة Biotech
RNasin ريبونوكلياز مثبطPromegaN2111
خدمة التسلسلMission Biotech
SlideThermo ScientificAA00008032E00MNT10
Sodium Pyruvate (100 mM)Gibco11360070MEM-10
حبات الفولاذ المقاوم للصدأQIAGEN69989
وسادة ماصة معقمة3M1604T-2
مرشح حقنةNalgene171-0045
Taq polymeraseJMR HoldingsJMR-801
Thermal cyclerApplied Biosystems2720
TissueLyser IIQIAGEN85300
خافض اللسانHONJER CO., LTD.122246
ملاقطتينيسون للأدوات الطبية لتطوير الشركة المحدودة.A0601
تايلوسين طرطراتسيجماT6271-10GMEM-10
جهاز نظام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).
  2. Aréchiga Ceballos, N., et al. Novel lyssavirus in bat, Spain. Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).
  3. Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
  5. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
  6. Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
  7. Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
  8. Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384(1967).
  9. Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
  10. Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
  11. Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
  12. Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
  13. Kuzmin, I. V., et al. Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh. Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).
  14. Reynes, J. -M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
  15. Nguyen, A. T., et al. Bat lyssaviruses, northern Vietnam. Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).
  16. Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097(2013).
  17. Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).
  18. World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf (2019).
  19. Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
  20. Corbet, G. B., Hill, J. E. The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).
  21. Mayer, F., von Helversen, O. Cryptic diversity in European bats. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).
  22. Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).
  23. Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
  24. Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
  25. Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
  26. Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).
  27. Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216(2017).
  28. Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
  29. Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).
  30. Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372(2013).
  31. David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
  32. Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

JW12 N165 146

مقالات ذات صلة