مقالة منهجية

تكنولوجيا كريسبر/كاس9 في استعادة التعبير عن عسر الهضم في مُدَجّن العضلات المشتقة من iPSC

7.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59432

⸱

سبتمبر 14, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Medical College of Georgia, Augusta University

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكول حذف exon23 المستندة إلى Cas9 لاستعادة التعبير dystrophin في iPSC من DMDmdx الخلايا الليفية الجلدية المشتقة من الماوس وتميز مباشرة iPSCs في خلايا ذرية myogenic (MPC) باستخدام نظام تنشيط تيت أون MyoD.

الملخص

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو مرض العضلات التدريجي الحاد الناجم عن الطفرات في جين dystrophin، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى استنفاد خلايا ذرية العضلات. تجميعها بانتظام بين متباعدة قصيرة تكرار باليندروميك / كريسبر المرتبطة 9 (CRISPR / Cas9) تحرير الجينات لديه القدرة على استعادة التعبير عن جين dystrophin. يمكن للخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة ذاتيًا (iPSCs) التي تستمد خلايا العضلات (MPC) تجديد تجمع الخلايا الجذعية/السلفية وإصلاح الأضرار ومنع حدوث المزيد من المضاعفات في DMD دون التسبب في استجابة مناعية. في هذه الدراسة، نقدم مزيج من كريسبر / كاس9 والتكنولوجيات iPSC غير المتكاملة للحصول على الذرية العضلات مع التعبير البروتين dystrophin تعافى. باختصار، نستخدم متجه Sendai غير متكامل لإنشاء خط iPSC من الخلايا الليفية الجلدية من الفئرانMdx DMD. ثم نستخدم استراتيجية الحذف CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير dystrophin من خلال نهاية غير متجانسة الانضمام إلى الجين dystrophin إعادة صياغة. بعد التحقق من استنفاد exon23 exon23 في ثلاث مستعمرات من 94 المستعمرات التي تم اختيارها iPSC، ونحن نميز iPSC في MPC عن طريق doxycycline (دوكس) التي يسببها التعبير MyoD، وهو عامل النسخ الرئيسي يلعب دورا هاما في تنظيم تمايز العضلات. تظهر نتائجنا جدوى استخدام استراتيجية حذف CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير عن عسر التحجر في MPC المشتقة من iPSC، والتي لديها إمكانات كبيرة لتطوير العلاجات المستقبلية لعلاج DMD.

المقدمة

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو واحد من الضمور العضلي الأكثر شيوعا ويتميز بعدم وجود dystrophin، مما يؤثر على 1 من حوالي 5000 الأولاد حديثي الولادة في جميع أنحاء العالم1. فقدان وظيفة الجينات dystrophin يؤدي إلى عيوب العضلات الهيكلية مما يؤدي إلى انحطاط myofibers التدريجي1,2. وقد تم اختبار فيروس المؤتلف المرتبطة بأدينو (rAAV) بوساطة نظام العلاج الجيني لاستعادة التعبير dystrophin وتحسين وظيفة العضلات، مثل استبدال الجينات باستخدام خلل التوتر الجزئي (μ-Dys). ومع ذلك، فإن نهج rAAV يتطلب حقن متكررة للحفاظ على التعبير عن البروتين الوظيفي3،4. لذلك، نحن بحاجة إلى استراتيجية التي يمكن أن توفر بشكل فعال ودائم استرداد التعبير الجيني dystrophin في المرضى الذين يعانون من DMD. الماوسDMD MDX، نموذج الماوس لDMD، لديه طفرة نقطة في exon 23 من الجينات dystrophin الذي يقدم codon إنهاء سابق لأوانه والنتائج في البروتين المقتطعة غير وظيفية تفتقر إلى C-محطة dystroglycan نطاق ملزم. أظهرت الدراسات الحديثة استخدام تكنولوجيا CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير الجيني dystrophin عن طريق تصحيح الجينات بدقة أو حذف الطارد اتّصال في الحيوانات الصغيرة والكبيرة5و6و7. أبلغ Long et al.8 عن طريقة تصحيح طفرة الجينات dystrophin في خط الجراثيم الماوس DMDMDX عن طريق إصلاح الموجهة من قبل علم الهولوجي (HDR) القائم على كريسبر / Cas9 تحرير الجينوم. وأفاد الرفاعي وآخرونأن rAAV يمكن أن يقتطع بكفاءة exon 23 متحولة في الفئران عسر التغذية. في هذه الدراسات، تم تصميم gRNAs في الإنترونات 20 و 23 للتسبب في فواصل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مرتين، والتي استعادت جزئيا التعبير dystrophin بعد إصلاح الحمض النووي عن طريق نهاية غير متجانسة الانضمام (NHEJ). حتى أكثر إثارة, Amoasii وآخرون10 ذكرت مؤخرا فعالية وجدوى rAAV بوساطة كريسبر تحرير الجينات في استعادة التعبير dystrophin في نماذج الكلاب, خطوة أساسية في التطبيق السريري في المستقبل.

DMD يسبب أيضا اضطرابات الخلايا الجذعية11. لتلف العضلات, الخلايا الجذعية العضلات السكنية تجديد خلايا العضلات الموت بعد تمايز العضلات. ومع ذلك، فإن دورات متتالية من الإصابة والإصلاح يؤدي إلى تقصير التيلوميرات في الخلايا الجذعية العضلات12، واستنفاد سابق لأوانه لتجمعات الخلايا الجذعية13،14. ولذلك، يمكن أن يكون مزيج من العلاج بالخلايا الجذعية الذاتية مع تحرير الجينوم لاستعادة التعبير dystrophin نهجا عمليا لعلاج DMD. توفر تقنية CRISPR/Cas9 إمكانية توليد الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSC) التي تم تصحيحها وراثياً من أجل تجديد العضلات الوظيفي ومنع حدوث المزيد من المضاعفات في DMD دون التسبب في رفض المناعة. ومع ذلك، iPSCs لديها خطر تشكيل الورم، والتي يمكن تخفيفها من خلال تمايز iPSC في خلايا ذرية myogenic.

في هذا البروتوكول، ونحن نصف استخدام فيروس Sendai غير دمج لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية من الفئرانMdx DMD في iPSCs ومن ثم استعادة التعبير dystrophin عن طريق حذف الجينوم CRISPR /Cas9. بعد التحقق من حذف Exon23 في iPSC عن طريق علم الوراثة، قمنا بتمييز iPSC المصوبة الجينومية في الذرية الميجينية (MPC) عن طريق التمايز الماجينية المستحثة من قبل MyoD.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت جميع عمليات التعامل مع الحيوانات والعمليات الجراحية من خلال بروتوكول وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة أوغوستا. تم تغذية الفئران النظام الغذائي القياسية والمياه الإعلان libitum.

1. عزل الخلايا الليفية الماوس الأولية من الفئرانMdx DMD الكبار

  1. القتل الرحيم الكبار DMDMDX الفئران (ذكر, 2 أشهر من العمر) من قبل CO2 الاختناق واستئصال الصدر وفقا لIACUC المعتمدة من قبل كلية الطب في جورجيا, جامعة أوغوستا. قطع الذيل مع مشرط معقمة في حالة معقمة تحت غطاء محرك السيارة laminar. شطف الذيل مع الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق، ومن ثم يغسل مع محلول ة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في طبق 6 سم.
  2. قشر الجلد الذيل قبالة عن طريق شق حاد من القاعدة إلى طرف الذيل على طول الجلد الذيل، ومن ثم قشر بلطف قبالة الجلد الذيل مع ملاقط. قم بتحريك الجلد إلى حجم 1 مم3 باستخدام مشرط معقم ونقل أنسجة الجلد المفرومة إلى طبق 6 سم في الحد الأدنى من المتوسط الأساسي دولبكو / F12 لحم الخنزير (DMEM /F12) التي تحتوي على 0.1٪ كولاجيناز الرابع و 1 U / مل من ديسباس.
  3. هضم أنسجة الجلد في طبق الثقافة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪.
  4. معطف لوحة 6 جيدا مع فيبرونيكتين و الجيلاتين 0.2٪ (1 مل من فيبرونيكتين في 199 مل من الجيلاتين 0.2٪. جدول المواد) وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. فصل أنسجة الجلد المهضومة مع طرف الأنابيب 1 مل ونقل الأنسجة وsupernatant إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل معقمة. الطرد المركزي في 217 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في 1.5 مل من المتوسطة الليفية(جدول المواد).
  6. ثقافة الكريات بما في ذلك أنسجة الجلد هضمها غير مكتملة من الخطوة 1.5 على لوحة 6 جيدا المغلفة مع فيبرونيكتين و 0.2٪ الجيلاتين من الخطوة 1.4 في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. استبدال المتوسطة 24 ساعة بعد الطلاء الأولي لإزالة الخلايا غير المرفقة، وتغيير المتوسطة كل 48 ساعة.

2. إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد الماوس في iPSCs

  1. قبل يومين من التحويل، هضم الخلايا الليفية الجلدية من الخطوة 1.6 مع حل مفرزة الخلية(جدول المواد)في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق.
  2. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيماسيومتر والطرد المركزي في 217 × ز لمدة 3 دقائق.
  3. خلايا البذور بكثافة 1−2 × 105 خلايا لكل بئر على لوحة 6 آبار وثقافة مع وسط ليفي(جدول المواد)في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2.
  4. في يوم التحويل (اليوم 0)، تقدير الخلايا وحساب حجم كل فيروس المطلوبة للوصول إلى التعدد المستهدف للعدوى (وزارة الداخلية) من 5 و 5 و 3 (أي، KOS MOI = 5، HC-Myc MOI = 5، hKlf4 MOI = 3) وفقا للدليل التجاري.

figure-protocol-1

  1. إذابة ثلاثة أنابيب سينداي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5−10 ثوان وأضف الأحجام المحسوبة لكل من أنابيب سينداي الثلاثة إلى 1 مل من وسط الليفي(جدول المواد).
  2. إزالة وسيطة الأورام الليفية من الخطوة 2.3 وإضافة خليط فيروس إعادة برمجة إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا. حضانة الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2.
  3. استبدال المتوسطة مع المتوسطة الليفية الطازجة 24 ساعة بعد transduction. ثقافة الخلايا لمدة أسبوع واحد مع تبادل المتوسطة كل يوم.
  4. حصاد الخلايا الليفية الماوس المصابة في اليوم 7 بعد transduction مع 0.05٪ تريبسين / EDTA ووضع هاعلى الأطباق التي كانت مغلفة سابقا مع فيبرونيكتين و 0.2٪ الجيلاتين.
  5. ثقافة الخلايا الليفية الماوس المصابة من الخطوة 2.6 مع كامل الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (ES) متوسط النمو(جدول المواد)في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 وتغيير المتوسطة يوميا.
  6. من اليوم الثامن، لاحظ لوحة تحت المجهر المقلوب كل يوم لتحديد مظهر كتل الخلية مع مورفولوجيا الماوس ES.

3. باستخدام الفوسفاتيز القلوية بقعة حية وتدفق قياس السيتومترية لتحديد كفاءة إعادة البرمجة

  1. قم بإزالة الوسائط الثقافية من كل بئر واشطفها بـ DMEM/F-12 لمدة 2-3 دقائق.
  2. تطبيق 2 مل من 1X الفوسفاتيز القلوية (AP) يعيش وصمة عار حل العمل (1:500 تخفيف في DMEM / F-12) على الخلايا الملتصقة، واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
  3. يستنشق وصمة عار AP الحية وغسل مرتين مع PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  4. هضم الخلايا مع حل مفرزة الخلية(جدول المواد)في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق.

4. اختيار وحصاد الخلايا الشبيهة ES

  1. فحص المستعمرات من الخطوة 2.8 تحت المجهر المقلوب.
  2. وضع علامة على المستعمرات في الجزء السفلي من الطبق مع علامة كائن التحبير الذاتي.
  3. تطبيق حلقات الاستنساخ مدهون لتغطية مستعمرات الخلايا ملحوظ. إضافة 100 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين / EDTA إلى كل حلقة استنساخ في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ومن ثم نقل الخلايا المهضومة مع 100 * نصائح ماصة إلى لوحات ثقافة 48 جيدا التي تحتوي على mES متوسط النمو.
  4. حضانة الخلايا في لوحات الثقافة 48 جيدا في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2. تمر الخلايا إلى طبق 6 سم عندما تصل إلى التقاء 70٪.
  5. كرر الخطوتين 4.3 و4.4 لعدة مرات حتى يتم الحصول على نسخ موحدة على شكل سكن.

5- تجميد المعدات الأساسية للحماية من أجل الحفظ بالتبريد

  1. فصل iPSCs المحدد من الخطوة 4.5 مع التربسين، versene، والبلازما الفرخ (TVP; جدول المواد) حل في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ لمدة 30 دقيقة.
  2. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي معقمة 15 مل والطرد المركزي في 217 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من الماوس ES المجمدة المتوسطة(جدول المواد)للحصول على 1 مل لكل cryovial.
  4. إضافة خلايا إلى الفيوارير وتجميد باستخدام حاوية الفريزر التي توفر الحرجة، المتكررة -1 درجة مئوية / دقيقة معدل التبريد اللازمة للحفظ بالتبريد في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. نقل قارورة المجمدة في خزان النيتروجين السائل.

6. تلطيخ الفلورة المناعية لعلامات الخلايا الجذعية في iPSCs

  1. iPSCs البذور من الخطوة 5.1 المستزرعة مع mES المتوسطة في شريحة غرفة 8-جيدا المغلفة مع بولي د-يسين / لامينين(جدول المواد)في الكثافة المناسبة لتحقيق ما بين 1−2 × 104 خلايا لكل بئر وحضانة في حاضنة 37 درجة مئوية مع حاضنة 37 درجة مئوية مع حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
  2. تزج الشرائح في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم تزج الشرائح في PBS مرتين لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  3. أقسام الحضانة مع الكاشف الماوس IgG حجب(جدول المواد)،و مصل الماعز 5٪ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تخفيف الأجسام المضادة الأولية في مخفف البروتين (الماوس المضادة لSSEA1، 1:100، أرنب المضادة نانوغ، 1:500؛ أرنب المضادة للPOU فئة 5 homeobox 1 [OCT4]، 1:500؛ أرنب المضادة للسري مربع 2 [SOX2]، 1:500؛ أرنب المضادة لين-28 التجانس A [Lin28A]، 1:400) (جدول من [Lin28A]، 1:400)(جدول المواد). تطبيق الأجسام المضادة على الخلايا وحضانة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في غرفة رطبة.
  5. تجاهل الحل الأساسي للجسم المضاد واغسل الشرائح 3x في PBS.
  6. تطبيق الأجسام المضادة الثانية (Alexa488-المترافق الماعز المضادة للماوس الأجسام المضادة للفئران وAlexa555-المترافق الماعز المضادة للأرنب، 1:400 لكل منهما) في M.O.M. بروتين مخفف على الشرائح وحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. غسل الشرائح 3X في PBS وجبل المقاطع مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4'6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI).
  8. التقاط الصور مع المجهر البؤري.

7- التحقيق في تعدد القوى في الكائنات الحية

  1. فصل iPSCs من الخطوة 5.1 إلى خلايا واحدة باستخدام حل TVP في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
  2. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيماسيومتر والطرد المركزي في 217 × ز لمدة 3 دقائق.
  3. يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه مع mES المتوسطة في أنبوب الطرد المركزي المعقم 1.5 مل بتركيز 5 × 105 خلايا / 30 ميكرولتر لزراعة الخلايا.
  4. إزالة الشعر من كلا الأطراف الخلفية من الفئران نقص المناعة باستخدام مقص الشعر.
  5. التخدير الفئران مع الكيتامين (100 ملغ / كغ) وتنظيف موقع الحقن مع الكحول 75٪.
  6. حقن 30 ميكرولتر من تعليق iPSC من الخطوة 7.3 العضل في الجهاز الهضمي، وذلك باستخدام إبرة 31 G.
  7. بعد أسبوعين من الحقن، حصاد الجهاز الهضمي الماوس وتضمين في درجة الحرارة المثلى (OCT) مركب، تجميد المفاجئة وقطع إلى أقسام 5-ميكرومتر15،16.
  8. إصلاح أقسام في الفورمالديهايد 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم غسل الشرائح مرتين في PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  9. سد الخلايا مع 5٪ مصل الماعز بروتين مخفف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. إضافة الجسم المضاد الأساسي المخفف (أرنب المضادة لوكالة فرانس برس، 1:50؛ أرنب المضادة SMA، 1:50؛ أرنب المضادة TH، 1:50) إلى الشرائح وحضانة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في غرفة رطبة.
  11. تجاهل محلول الأجسام المضادة الأساسي، وغسل الخلايا 3X (5 دقائق / غسل) في PBS، إضافة 1:400 المخفف Alexa555-المترافق الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة للانزلاقات، وحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  12. اغسل الشرائح 3x (5 دقائق /غسل) في PBS، وجبل أقسام مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI.

8. بناء كريسبر / Cas9 ناقلات لينتيفيروسي استهداف الإينترونات المحيطة dystrophin exon 23

  1. تصميم اثنين من أزواج من القلة gRNA استهداف الإنترون يحيط dystrophin exon 23 عبر http://crispor.tefor.net/crispor.py.
    ملاحظة: أزواج مصممة كما يلي:
    i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAAA- 3'
    i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTTACCAAAGCTTAAC-3'
    i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATATTTCT- 3'
    i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3').
  2. هضم وdephosphorylate 5 ميكروغرام من بلازميد كريسبر لينتيفيروسي (lenti-CRISPRv2-blast [هدية من موهان بابو] ولينتي-دليل-هيغرو-iRFP670 [هدية من كريستين بريناند])(جدول المواد)مع BsmB1/Esp3I لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. بالنسبة لـ 5 ميكروغرام من البلازميدات، أضف 3 ميكرولتر من BsmB1 تقييد الإنزيم، و3 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوي السريع، و6 ميكرولتر من 10x من أنزيم الملخص الاحتياطي و0.6 ميكرولتر من 100 مليون متر DTT في رد فعل 60 ميكرولتر).
  3. تحميل ردود الفعل على هلام أروز 0.8٪. تشغيل هلام في 100-150 V لمدة 30 دقيقة.
  4. تنقية البلازميد المهضوم في هلام باستخدام مجموعة استخراج هلام(جدول المواد)وelute في 20 ميكرولتر من H2O.
  5. الفوسفوريات والصلب كل زوج من oligonucleotides gRNA تحتوي على 1 ميكرولتر من كل oligonucleotide في 100 ميكرومتر، 1 ميكرولتر من 10X T4 الربط العازلة، 0.5 ميكرولتر من T4 polynucleotide كيناز (PNK)، 6.5 ميكرولتر من ddH2O في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم منحدر د الخاصة إلى 25 درجة مئوية عند 5 درجة مئوية / دقيقة.
  6. [ليغت] 1:200 تخفيف من ال [أنّليد] [غرنا] [أوليغونوكلوتيدس] داخل ال [لنتيكريسبر] [ف2-فّل] [بلنتيغيد-هيغرو-رفب670]. مزيج 50 نانوغرام من BsmB1 /Esp3I هضم ناقلات مع 1 ميكرولتر من دوبلكس oligo المخفف و 5 ميكرولتر من 2X الرباط العازلة بالإضافة إلى 1 ميكرولتر من ligase في نظام رد فعل 11 درجة مئوية وحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. إجراء التحول مع 3 ميكرولتر من المنتج الربط إلى 50 ميكرولتر الخلايا المختصة(جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  8. نشر الخلايا المختصة المحولة في لوحة أجار مع 100 ميكروغرام / مل كاربينسيلين وحضانة في 31.5 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
  9. اختيار المستعمرات مع 10 ميكروغرام نصائح ماصة معقمة والثقافة في 5 مل من مرق رائع(جدول المواد)التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل كاربينسيلين في 31.5 درجة مئوية، 185 دورة في الدقيقة في حاضنة شاكر لمدة 21 ساعة.
  10. تنقية الحمض النووي بلازميد باستخدام مصغرة الإعدادية وميدي الإعدادية مجموعات(جدول المواد).
  11. تحقق من بلازميدات الإعدادية المصغرة عن طريق تقييد الهضم. بالنسبة لنظام التفاعل بسعة 20 ميكرولتر، أضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي بلازميد، و2 ميكرولتر من المخزن الاحتياطي لتفاعل الهضم(جدول المواد)و1 ميكرو لتر من خليط إنزيم تقييد (0.5 ميكرولتر من KpnI-HF و0.5 ميكرولتر من AgeI-HF for plentiCRISPR V2-Blast-i22؛ 0.5 ميكرولتر من NotI-HF و0.5 ميكرولتر من EcoRI-HF لـ EcoRI-HF plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). احتضان نظام رد الفعل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  12. تحميل ردود الفعل على هلام أروز 0.8٪. تشغيل هلام في 100-150 V لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن تكون النطاقات الصحيحة لplentiCRISPR V2-Blast-i22 622 bp و 12.2 كيلو بايت، ويجب أن تكون النطاقات الصحيحة لplentiGuide-Hygro-iRFP670- i23 2.6 كيلو بايت و 7.1 كيلو بايت.

9. تغليف ناقلات Lentiviral

  1. ثقافة 7 × 105 293FT الخلايا في 5 مل من وسائل الإعلام DMEM تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنين في طبق 6 سم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  2. إعداد كوكتيل (1 ميكروغرام من plentiCRISPR V2-Blast-i22 أو plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23، 750 نانوغرام من بلازميد التعبئة والتغليف psPAX2، 250 نانوغرام من بلازميد مغلف pMD2.G، و 5 ميكرولتر من الكاشف المتحول A [جدول المواد]في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام MEM المصل المنخفض).
  3. إعداد خليط من 5 ميكرولتر من الكاشف الانسياق B(جدول المواد)في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام MEM المصل مخفضة.
  4. يُضاف 100 لتر من خليط الكاشف البيرفيل B إلى خليط البلازميد من الخطوة 9.2 والحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة مجمع الدهون الحمض النووي (من الخطوة 9.4) قطرة إلى خلايا 293FT. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  6. إضافة محسن إنتاج الفيروس (500x)(جدول المواد)إلى كل طبق في اليوم التالي وحضانة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  7. جمع المتوسطة من الخلايا باستخدام الماصات في اليومين المقبلين وتصفية المتوسطة من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة الخلايا.

10- تركيز وتنقية ناقلات الفيروسات اللينة

  1. ناقلات النضدية المعجّلة في وسط الخطوة 9.7 بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية مع 5x البولي إثيلين غليكول 4000 (PEG4000, 8.5% التركيز النهائي) و 4 M كلوريد التركيز (0.4 M التركيز النهائي).
  2. طرد مركزي وسائل الإعلام الفيروسية التي تحتوي على حل PEG4000 في 2095 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وإزالة وتجاهل supernatant.
  3. إعادة تعليق الكريات مع 500 درجة مئوية من المصل خفض MEM وسائل الإعلام (لينتيفيروس titer: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1.56 × 108،lenti-iRFP6 70-gRNAi23: 1.3 × 108، لينتي كريسبر V2-- السيطرة: 3.13 × 107، lenti-iRFP670-التحكم: 5.9 × 107 ). يُحفظ عند -80 درجة مئوية حتى يُستعمل.

11- حذف الإكسون 23 في أجهزة iPSCs الماوس مع دليلين RNAs (rnAs) إلى جانب Cas9

  1. لوحة iPSCs الماوس من الخطوة 4.5 في لوحة 24 جيدا المغلفة مع فيبرونيكتين والجيلاتين.
  2. بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء 50٪، انتقل إلى وسط الثقافة الطازجة (كامل الماوس نمو الخلايا الجذعية الجنينية المتوسطة) التي تحتوي على 8 ميكروغرام / مل بوليبرين).
  3. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الجسيمات اللينفيروسي من الخطوة 10.3 بما في ذلك lenti-CRISPR V2-gRNAi22، lenti-iRFP670-gRNAi23 والتحكم (ناقلات فارغة: lenti-CRISPR V2، lenti-iRFP670) إلى iPSCs الماوس. حضانة الخلايا لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  4. حدد الخلايا المصابة بشكل كبير مع وسائل الإعلام التي تحتوي على 2.5 ميكروغرام / مل blasticidin و 100 ميكروغرام / مل هيغروميسين B عن طريق تحديد الحد الأدنى من تركيز blasticidin والهيغروميسين B اللازمة لقتل الخلية غير المصابة.
    ملاحظة: سيتم قتل الخلايا غير المصابة بواسطة blasticidin والهيغروميسين B.
  5. هضم iPSCs الماوس المحدد مع 0.5 مل من حل TVP كل بئر (لوحة 24 جيدا) والخلايا الحاضنة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  6. فصل iPSCs في خلايا واحدة عن طريق الأنابيب، عد الخلايا مع غرفة عد الخلايا ومن ثم تخفيف حوالي 150 خلايا واحدة هضمها مع mES المتوسطة في طبق 10 سم للثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  7. بعد حوالي 10 أيام، واختيار مستعمرات واحدة تحت المجهر المقلوب باستخدام 10 * لتر نصائح ماصة معقمة (96 المستعمرات تحتاج إلى أن يتم انتقاؤها).
  8. نقل المستعمرات المختارة إلى 50 درجة مئوية من محلول TVP كل بئر (لوحة 96-well، مستعمرة واحدة كل بئر)، هضم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ومن ثم زرع الخلايا المهضومة في اثنين من لوحات الثقافة 96 جيدا للحفاظ على الثقافة (واحد للكتابة الجينية).
  9. حضانة في حاضنة CO2 في 37 درجة مئوية حتى 70٪ confluent.

12. تحديد مستعمرات iPSC مع حذف exon23

  1. إزالة المتوسطة في لوحة 96 جيدا عندما تصل مستعمرات الخلية 70٪ التقاء.
  2. إضافة 25 ميكرولتر من كاشف الليسات(جدول المواد)التي تحتوي على محلول بروتيناز K (1 مل من بروتيناس K في 100 مل من كاشف الليسات) إلى كل بئر، ونقل lysate إلى لوحة PCR 96 جيدا.
  3. ختم لوحة PCR واحتضان لوحات في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم في 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة لتحلل الخلايا وتشوه بروتيناس K.
  4. تنفيذ تفاعل PCR مع 2 ميكرولتر من lysate من الخطوة 12.3. بالنسبة لتفاعل PCR 20 ميكرولتر، أضف 2 ميكرولتر من الليسات، و10 ميكرولتر من 2x DNA polymerase premix(جدول المواد)،و7 ميكرولتر من المياه الخالية من DNase، و1 ميكرولتر من DMD exon 23 التمهيديات(الجدول 1).
  5. استخدم المعلمات التالية لرد فعل PCR: 98 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، و35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 درجات، و60 درجة مئوية لمدة 15 ق، و72 درجة مئوية لمدة 30 ق، وملحق نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
  6. تحميل رد فعل PCR على هلام أجاروز 2٪. تشغيل هلام في 100-150 V لمدة 30 دقيقة.
  7. فحص هلام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (كفاءة خروج المغلوب هو 3/94).

13. استخدام نظام تنشيط تيت أون ميوغة للتمييز مباشرة بين iPSC وخلايا الذرية المسببة للسرطان (MPC)

  1. حزمة LV-TRE-VP64-الماوس MyoD-T2A-dsRedExpress2 و LV-TRE-VP16 الماوس MyoD-T2A-dsRedExpress2 (هدية من تشارلز Gersbach)(جدول المواد)كما هو موضح سابقا لlenti-CRISPRv2-الانفجار وlenti-gRNA-iRFP670 ناقلات في أقسام 9 و10
  2. إصابة iPSC الماوس مع lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 أو lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 كما هو موضح سابقا ً لناقلات lenti-CRISPRv2-blast وlenti-gRNA-iRFP670 في الخطوات 11.1−11.3.
  3. حدد الخلايا مع 1 ميكروغرام / مل بوروميسيسين بعد ثلاثة أيام من العدوى للحصول على السكان الخلايا المستحثة نقية.
  4. إضافة 3 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين في وسائل الإعلام الثقافة (10٪ FBS DMEM) إلى تمايز MPC. استبدال المتوسطة الطازجة تستكمل مع الدوكسيسيكلين كل يومين.

14. النسخ العكسي الكمي PCR لتقييم التمايز الديناميكي للعضلات وDMD exon التعبير 22-24

  1. استخراج الحمض النووي الريبي الخلوي بعد 0، 3، 6، و 10 أيام بعد العلاج الدوكسيسيكلين باستخدام الكاشف العزل RNA، نسخ عكس الحمض النووي الريبي في cDNA باستخدام أول حبلا cDNA توليف عدة(جدول المواد).
  2. بالنسبة لنظام التفاعل بين الـ 20 ميكرولتر، أضف 1 ميكرولتر من cDNA، و10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل PCR(جدول المواد)،و8 ميكرولتر من الحمض النووي H2O، و1 ميكرولتر من خليط من المواد التمهيدية الأمامية والعكسية (غليسيرالدهايد-3-فوسفات ديهيدروجينز [GAPDH]، العضلات الهيكلية [ACTA1]، OCT4 و DMD exon22, DMD exon23, و DMD exon24, انظر الجدول 1).
  3. استخدام المعلمات التالية لرد فعل PCR: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ق، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، منحنى ذوبان 65.0 درجة مئوية إلى 95.0 درجة مئوية، زيادة 0.5 درجة مئوية.

15. تلطيخ الفلورة المناعية من سلسلة الموسين الثقيلة 2 (MYH2) والتعبير عن بروتين dystrophin

  1. لوحة الدوكسيسيكلين الناجمة، لينتي-TRE-MyoD الخلايا المعدلة من الخطوة 13.4 على 8-جيدا الشرائح الثقافة.
  2. إصلاح الخلايا في الفورمالديهايد 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم غسل الشرائح مرتين في PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  3. سد الخلايا مع 5٪ مصل الماعز بروتين مخفف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة الأرنب المضادة لdystrophin الأجسام المضادة (1:300) والماوس المضادة للMYH2 الأجسام المضادة (1:100) إلى الشرائح، وحضانة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في غرفة رطبة.
  5. تجاهل محلول الأجسام المضادة الأولية، وغسل الخلايا 3X (5 دقائق / غسل) في PBS، إضافة 1:400 المخفف Alexa488-المترافق الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة وAlexa555-المترافقة الماعز المضادة للماوس الأجسام المضادة للماوس إلى الشرائح، وحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اغسل الشرائح 3x (5 دقائق /غسل) في PBS، وجبل أقسام مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إنشاء DMDMDX الجلد الليفية المستمدة iPSC. أظهرنا كفاءة توليد iPSCs الماوس من الفئرانDMD MDX المستمدة من الخلايا الليفية الجلد باستخدام ناقلات إعادة برمجة خالية من التكامل. ويبين الشكل 1ألف أن ظهور مستعمرات تشبه الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) في ثلاثة أسابيع بعد العدوى. نحن نقيم كفاءة الحث iPSC من قبل الفوسفاتيز القلوية الحية (AP) وصمة عار. ويبين الشكل 1 باء أن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية AP كانت حوالي 1.8 في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو مرض وراثي مدمر وقاتل في نهاية المطاف يتميز بعدم وجود dystrophin، مما يؤدي إلى ضمور العضلات التدريجي1،2. تظهر نتائجنا التعبير الجيني المزيل المنتم في خلايا السلالة الماجينية المستمدة من DMDmdx iPSC من خلال نهج حذف exon23 من CRISPR/Cas9-بوساطة. ولهذا النهج ثلاث مزايا.

أولاً، قمنا بتوليد iPSCs من الخلايا الليفية الجلدية المستمدة من Dmdmdx باستخدام متجه RNA غير مدمج. وقد تم تطوير مجموعة متن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم تانغ ووينتروب جزئيا من قبل NIH-AR070029، NIH-HL086555، NIH-HL134354.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأدوات الجراحية
31 قياس إبرةمتنوعة 
شق حادمتنوع 
مشارط معقمةمتنوعة 
ملاقطمتنوعة 
وسيط الخلايا الليفية (ل 100 مل من الوسط الكامل)رقم كتالوجالشركةالمجلد
2-Mercaptoethanol (55 ملم)Gibco21-985-0230.1 مل
مضاد حيوي مضاد للفطريات 100xCORNINGMT30004CI1 مل
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High GlucoseSIGMAD642987 مل
الجنين مصل الأبقار يتميزHyCloneSH30396.0310 مل
محلول L-GlutamineSIGMAG75131 مل
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)   ؛Gibco11140076سعة 1 مل
(ل 500 مل من المحلول الكامل)رقم كتالوجالشركةحجم
مصل الدجاجGibco16110-0825 مل
EDTASigma-AldrichE6758186 مجم
محلول ملحيإلى 500 مل
تربسين (2.5٪)حراري150900465 مل
وسط نمو mES (ل 500 مل من المحلول الكامل)رقم كتالوجالشركةالحجم
2-Mercaptoethanol (55 ملم)Gibco21-985-0230.5 مل
مضاد حيوي مضاد للفطريات 100xCORNINGMT30004CI5 مل
Dulbecco's Modified Eagle's متوسط - عالي الجلوكوزSIGMAD6429408.5 مل
مصل الأبقار الجنينية يتميزHyCloneSH30396.0375 مل
محلول L-GlutamineSIGMAG75135 مل
عامل مثبط لسرطان الدم المؤتلف بالفأر (LIF) ، 0.5 × 106 U / ملEMD Millipore CorpCS210511500 & mu ؛ L
MEK / GS3 الملحق المثبطEMD Millipore CorpCS210510-500UL500 & mu ؛ ل
الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x)   ؛Gibco111400765 مل
يجب عدم تخزين وسائط الخلايا الجذعية الجنينية لأكثر من 4 أسابيع وبمثبطات لا تزيد عن أسبوعين.
<قوي > متوسط مجمد (ل 50 مل من المحلول الكامل) < / قوي ><قوي > الشركة < / قوي ><قوي> رقم الكتالوج < / قوي >< قوي > الحجم < / قوي >
ثنائي سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO)SIGMAD26505 مل
Dulbecco's Modified Eagle's متوسط - عالي الجلوكوزSIGMAD642924.9 مل
مصل الأبقار الجنيني يتميزHyCloneSH30396.0325 مل
عامل مثبط لسرطان الدم المؤتلف (LIF) ، 0.5 × 106 وحدة / ملEMD Millipore CorpCS21051150 & mu ؛ L
اسم المواد / المعداترقم كتالوجالشركةRRID
0.05٪ Trypsin / 0.53 mM EDTACORNING25-052-CI
4٪ ParaformaldehydeThermo ScientificJ19943-k2
محلول AccutaseSIGMAA6964انفصال الخلية
AgeI-HFNEBR3552L
Alexa488 مترافق الماعز المضاد للجسم المضاد للفأرInvitrogenA32723AB_2633275
Alexa488 مترافق الماعز المضاد للأرانبInvitrogenA32731AB_2633280
Alexa555 المترافق الماعز المضاد للأرانبInvitrogenA32732AB_2633281
مضاد ل AFPThermo ScientificRB-365-A1AB_59574
مضاد لألفا - ناعم الأكتين العضلي (D4K9N) XPCST19245SAB_2734735
المضاد للدستروفينالحراريPA5-32388AB_2549858
المضاد للLIN28A (D1A1A) XP & nbsp ؛    CST8641SAB_10997528
مضاد ل MYH2DSHBmAb2F7AB_1157865
مضاد Nanog-XPCST8822SAB_11217637
مضاد لأكتوبر 4A (D6C8T)CST83932SAB_2721046
مضاد ل Sox2abcamab97959AB_2341193
مضاد ل SSEA1 (MC480)  CST4744sAB_1264258
anti-TH (H-196) سانتاكروز & nbsp ؛sc-14007AB_671397
بقعة حية من الفوسفاتيز القلوي (500x)ThermoA14353
Blasticidin SSigma-Aldrich203350
BsmBI / Esp3INEBR0580L / R0734L
CarbenicillinMillipore205805-250MG
Collagenase IV & nbsp ؛شركة ورثينجتون للكيمياء الحيويةLS004189
الخلايا المختصةTakaRa636763
CutSmart & nbsp ؛NEBB7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermoA16517
DirectPCR كاشف التحلل (الخلية)VIAGEN BIOTECH302-C
Dispase (1 U / mL)STEMCELL Technologies7923
الكواشف الحيويةللدوكسيسيكلين هيدروكلوريدBP26535
EcoRI-HFNEBR3101L
فيبرونيكتين البلازما البقريةSIGMAF1141
  ؛
QIAEX II جل استخلاص كيت (500)		QIAGEN20051
الجيلاتين من جلد الخنازير ، نوع ASIGMAG1890
HardSet المضاد للتلاشي وسط التركيب مع DAPIVectorH-1500
Hygromycin B (50 مجم / مل) حقنInvitrogen10687010
الكيتامين HCLهنري شاين لصحة45822
KpnI-HFNEBR3142L
lenti-CRISPRv2-blastAddgene83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670Addgene99377
Lipofectamin 3000 Transfection KitInvitrogenL3000015
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2   ماوس Addgene60625
LV-TRE-VP16 MyoD-T2A-dsRedExpress2Addgene60626
ماوس على الماوس (MOM) مجموعة أساسيةناقلاتBMK-2202
NotI-HFNEBR3189L
Opti-MEM I وسائط مصل مخفضةThermoFisher31985070
بولي إيثيلين جلايكول 4,000Alfa AesarAAA161510B
PolybreneSIGMATR1003
Corning  BioCoat Poly-D-Lysine / Laminin Culture SlideCORNINGCB354688
PowerUp SYBR Green Master MixThermoFisherA25742
PrimeSTAR Max PremixTakaRaR045
Proteinase KVIAGENBIOTECH 507-PKP
Puromycin DihydrochlorideMP BiomedicalsICN19453980
qPCR Lentivirus طقم المعايرة بالتحليل الحجميabmLV900
طقم ربط سريعNEBM2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)QIAGEN12945
RevertAid RT طقم النسخ العكسيThermo ScientificK1691
RNAzol RTمركز البحوث الجزيئية ، INCRN 190
T4 DNA Ligase تفاعل عازلةNEBB0202S
T4 بولي النوكليوتيدات كينازNEBM0201S
مرق رائع معدلالكواشف الحيوية فيشرBP9729-600
كاشف ViralBoost (500x)ALSTEMVB100
محلول TVP مخزن بالفوسفات محلول محلول فيشر

المراجع

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244(2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9 23 MyoD

مقالات ذات صلة