تقييم متشابك تعدد استخدام المشبك تصحيح كامل الخلية الكهربية

انتقال متشابك هو إليه أساسية للتواصل بين الخلايا العصبية والمخ وبالتالي الدالة. أيضا انتقال متشابك مجا ويمكن تغيير فعاليته بطريقة تعتمد على النشاط، وكذلك كما هو الحال في استجابة لإشارات مودولاتوري¹. وهكذا، تم دراسة الدالة متشابك نقطة تركيز رئيسية لأبحاث علم الأعصاب. تصحيح كامل الخلية الكهربية المشبك هو تقنية متعددة الاستخدامات التي تمكننا من فهم، بوضع تصاميم تجريبية وتحليلات البيانات، الآليات الفيزيائية-الحيوية والجزيئية متعمقة لانتقال متشابك. اتباع نهج استخداماً، ربما نظراً لبساطة الأسلوب والمفهوم، هو قياس التيارات بوستسينابتيك ضادات/المثبطة مصغرة (لي/إيبسكس) تحت الجهد المشبك التكوين^{2،3، 4 , 5 , 6}-مبسكس الفردية تمثل تدفق الأيونات من خلال مستقبلات إيونوتروبيك بوستسينابتيك (مثل مستقبلات امبا وغابا_A ) ردا على ربط بهم العصبية منهم أطلق سراحهم من محطة بريسينابتيك ⁷ . لأنه يتم الحصول على التسجيل حضور الجهد عن طريق بوابة نا⁺ قناة مانع تيدرودوتاكسين (TTX)، الإفراج عن إمكانات العمل المستقل وينطوي عادة على حويصلة متشابك واحد يحتوي على الناقل العصبي. وبناء على هذا الافتراض، متوسط السعة من مبسكس يستخدم على نطاق واسع تقديراً تقريبيا لحجم كانتال، التي تمثل عدد ووظيفة مستقبلات بوستسينابتيك معارضة موقع إطلاق سراح واحد. من ناحية أخرى، يعتبر تواتر مبسكس وتمثل مزيجاً من مجموع عدد من الاشتباكات العصبية التي تنتهي إلى الخلية بوستسينابتيك واحتمال الإفراج عن المتوسط. ومع ذلك، لا تقيس هذه المعلمات مولتيبليكاتيفيتي متغير آخر الاشتباكات العصبية، أو تعدد متشابك – هو أمر مهم لفعالية انتقال متشابك.

استناداً إلى نظرية انتقال متشابك^7،،من⁸⁹قوانتال، قوة اتصال معينة بين زوج من الخلايا العصبية تعتمد على ثلاثة عوامل: عدد الاشتباكات العصبية الوظيفية (N)، بوستسينابتيك ردا على إطلاق سراح حويصلة متشابك مفردة (حجم قوانتال؛ Q) واحتمال إطلاق سراح العصبي (P_r). تعدد متشابك يساوي N. تطوير تعدد متشابك أو تشذيب نهايات المضاعف من البلاستيك في التنمية وفي المرض مختلف الدول^3،4،،من⁶¹⁰. لهذا السبب، فقد وصف تعدد متشابك آثار هامة لفهم مدى فعالية انتقال متشابك في الصحة والمرض. يمكن تحديد التقنيات، مثل الميكروسكوب الإلكتروني أدلة الهيكلية لتعدد متشابك بالكشف عن عدة جهات اتصال متشابك منشؤها إكسون نفس على نفس العصبية بوستسينابتيك^{11،12، 13،14}. ومع ذلك، يمكن هذه مولتيسينابسيس هيكلياً المحددة وظيفيا صامت^15،16. يتطلب دراسة دقيقة الوظيفية N تحديا من الناحية التقنية النهج الكهربية، مثل التسجيلات كامل الخلية المزدوجة التي يمكن تحديد ما إذا كان اتصال معين لمواقع إطلاق سراح وظيفية متعددة والحد الأدنى النهج التحفيز التي تهدف إلى توظيف إكسون المفترضة مفردة.

في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة بسيطة لتقدير تعدد متشابك باعتماد أسلوب وضعت أصلاً من قبل حاسبات وآخرون². هذا الأسلوب ينطوي على قياس عفوية PSCs (سبسكس) ومبسكس باستخدام التصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية، مما يسمح لنا بتقدير درجة تعدد متشابك عبر جميع المدخلات إلى خلية معينة.  كما يعكس تعدد المعرفة مسبقاً، ومتشابك عدد نقاط الاشتباك العصبي بين خلية معينة قبل وبوستسينابتيك. إذا نهايات متعددة جندهم بإمكانيات العمل في التزامن، سيكون هناك احتمال كبير للجمع الزماني الفردية الأمنية الخاصة (أي كانتال)، توليد سعة أكبر من PSC.  في تسجيلات مبسك منخفض (في إمكانات العمل التي يتم حظرها بواسطة تتكس)، احتمال الجمع الزماني للفرد مبسكس (غير متزامن). باستخدام هذا المنطق، يمكن تقدير تعدد متشابك بمقارنة السعة sPSC (مع إمكانية العمل تعتمد على الإصدار) إلى السعة مبسك.

لفحص وجود تعدد يصف لنا أربع تجارب وتحليلاتها باستخدام ابسكس جلوتاماتيرجيك على سبيل مثال. ومع ذلك، يمكن استخدام نفس النهج للصيام انتقال جابايرجيك/جليسينيرجيك (إيبسكس). يرد أدناه وصف موجز الأساس منطقي لكل تجربة. أولاً، وكما هو موضح أعلاه، يمكن تقدير تعدد متشابك بمقارنة سعة سيبسكس إلى ميبسكس. هناك شرطين لهذا النهج؛ محاور عصبية 1) presynaptic يجب إطلاق النار عددا كافياً من إمكانات العمل أثناء التسجيل، و 2) P_r يجب أن تكون عالية حتى الإفراج عن عدة نقاط الاشتباك العصبي العصبي عند وصول بإمكانيات العمل. ولتلبية هذه المتطلبات، سيبسكس هي سجلت أول في انخفاض Ca^{2 +} الاصطناعية النخاعي (قام)، وثم تسجيل حضور تركيز منخفض من خصم قناة ك⁺ ، 4-أمينوبيريديني (4-AP) لزيادة العمل إطلاق النار المحتملة و P_r. ثم حظر إمكانات عمل إطلاق النار من قبل ت وانخفض بمقدار الجهد عن طريق بوابة Ca^{2 +} قناة مانع Cd^{2 +}للعلاقات العامة. مقارنة السعة سيبسكس (مع 4AP) إلى ميبسك (مع 4AP، تتكس، ومؤتمر نزع السلاح^{2 +}). في التجربة الثانية، Ca^{2 +} محله اكويمولار ريال^{2 +} في قام لﻻستخدام الإصدار حويصلة. كما Ca^{2 +} مطلوب من أجل الإفراج عن حويصلات متزامن، يجب القضاء على استبدال مع ريال^{2 +} سيبسكس السعة الكبيرة التي تدل على تعدد. ثالثا، ميتشانيستيكالي، تعدد يمكن أن يؤدي أما جهات متشابك متعددة إلى نفس الخلايا العصبية بوستسينابتيك أو الإصدار مولتيفيسيكولار (أي حويصلات متعددة إطلاق سراحهم خلال اتصال متشابك واحدة)^17،18. للتمييز بين هذين النوعين من التعدد، يستخدم التجربة الثالثة لتقارب منخفضة، سرعة الناي تنافسية خصم مستقبلات امبا،^،γ-د-جلوتاميلجليسيني (γ-DGG)¹⁷¹⁸ لتحديد ما إذا كانت كبيرة سيبسك هي نتيجة لمجموع الزمانية نهايات مستقلة أو الإفراج عن مولتيفيسيكولار تعمل على سكان بتداخل مستقبلات بوستسينابتيك. إذا كانت الأحداث السعة الكبيرة التي تنشأ عن إطلاق سراح مولتيفيسيكولار، γ-DGG ستكون أقل فعالية في تثبيط سيبسكس مقارنة بالاصغر حجماً أكبر، بينما سوف تتأثر بالمثل سيبسكس الكبيرة التي تنشأ من مجموع الزمانية لعدة جهات اتصال متشابك Γ-استيراد. في التجربة الرابعة، استخدمت طريقة أكثر فيزيولوجية لتعزيز إمكانات عمل إطلاق النار، وهما الزبائ التحفيز متشابك. عابر رشقات نارية باتجاه النشاط متشابك الزيادة/تيسير عفوية العمل إمكانية إطلاق النار، والإفراج عن احتمال أفيرينتس حفز. ويسمح هذا النهج لذلك، تعدد في المجاهرة بطريقة أكثر فسيولوجية.

البروتوكول التالية توضح طريقة إجراء هذه التجارب في الأنسجة طائي الماوس. وتستخدم على وجه التحديد، كورتيكوتروبين الإفراج عن هرمون (CRH) الخلايا العصبية من نواة تحت المهاد (التشفيير) بارافينتريكولار. تصف الإجراءات المتعلقة بإجراء تصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية، وشرح التجارب المحددة لاختبار لتعدد متشابك.

جميع التجارب على الحيوانات تقرها "اللجنة العناية بالحيوان" لجامعة ويسترن أونتاريو وفقا "المجلس الكندي لإرشادات العناية بالحيوان" (سياسة الاستخدام المقبول #2014-031).

1-الحلول

1. تشريح الحل
   1. الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين الحل تشريح.
   2. إعداد حل أسهم 20 x مسبقاً وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   3. 1 x تشريح حل، حل₃والجلوكوز السكروز في ddH₂س ناكو، وإضافة الأسهم 20 x. التأكد من الاسموليه بين موسم 315-320 وتخزين الحل لمدة أسبوع واحد لا يزيد على 4 درجة مئوية.
   4. ملء قنينة اثنين مع 100 مل من تقطيع الحل وغطاء لهم مع بارافيلم. البرد الحل في ثلاجة حتى يصبح تجميد الحل جزئيا (حوالي 20 دقيقة في الثلاجة-80 درجة مئوية). استخدام أنبوب غاز تشتت، فقاعة كل قنينة من تقطيع الحل مع 95% O₂5% CO₂ لمدة 20 دقيقة على الجليد.

الجدول 1: تكوين حلول مختلفة.

2. قام (لاسترداد شريحة والصيانة)
   1. الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين قام.
   2. إعداد حل أسهم 20 x مسبقاً وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   3. قام 1 x، حل NaHCO₃ والجلوكوز في ddH₂س وإضافة الأسهم 20 x. ضمان الاسموليه بين موسم 298-300. استخدام الحل في يوم واحد.
3. قام (انخفاض Ca^{2 +} لتسجيل)
   1. الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين منخفض Ca^{2 +} قام.
   2. إعداد حل أسهم 20 x مسبقاً وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   3. 1 × Ca^{2 +} قام منخفضة، حل ناكو₃ والجلوكوز في ddH2O وإضافة 20 x (كاكل₂ ومجكل₂ مجاناً) الأسهم وكاكل₂ مجكل₂ لتحديد تركيزات. ضمان الاسموليه بين 298-300. استخدام الحل في يوم واحد.
4. قام (ريال^{2 +} لتسجيل)
   1. الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين ريال^{2 +} قام.
   2. إعداد حل أسهم 20 x مسبقاً وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   3. 1 ×^{2 +} قام ريال، حل NaHCO₃ والجلوكوز في ddH₂س وإضافة 20 x (كاكل₂ ومجكل₂ مجاناً) الأوراق المالية، سركل₂ و مجكل₂ لتحديد تركيزات. ضمان الاسموليه بين 298-300. استخدام الحل في يوم واحد.
5. حل داخلي
   1. الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين كغلوكونات أساس الحل الداخلية.
   2. لجعل 20 مل من محلول الداخلية، إضافة 15 مل مياه الصف البيولوجيا الجزيئية إلى أنبوب 50 مل. نفذ الخطوات التالية على الجليد.
   3. إعداد الحلول التالية قبل الوقت بتركيزات 1 م الأسهم في البيولوجيا الجزيئية المياه الصف. إضافة (في مل): غلوكونات ك 2.32، 0.24 غ-غلوكونات، 0.20 حبيس، 0.16 بوكل، 0.05 K2-عطا، 0.04 مجكل₂ إلى أنبوب 50 مل.
   4. إضافة 100 ميليلتر من 0.3 م غ₃أنشئ.
   5. وزن ملغ 44.08 ك₂ATP في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل وإضافة 1 مل مياه الصف البيولوجيا الجزيئية، ثم إضافة إلى أنبوب 50 مل.
   6. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4 مع 1 م كوه. ضمان الاسموليه بين موسم 283-289.

2. إعداد الشريحة

1. إعداد الأدوات
   1. إضافة 200 مل قام إلى قاعة الإنعاش (شيدت من كوب 250 مل مع 4 آبار والمعاوضة) ووضع في غرفة الإنعاش في حمام مائي (35 درجة مئوية).
   2. تغطية الدائرة مع فيلم بارافين واستمرار الفقاعة قام مع 95% O_2%5 CO₂ استخدام أنبوب تشتت زجاج لمدة 20 دقيقة على الأقل.
   3. التحضير للتشريح بإعداد الأدوات (المبضع، مقص غرامة الزاوية، الملقط، فرشاة طلاء غرامة، ملعقة بلاستيكية).
   4. ملء المحاقن 60 مل مع حوالي 15 مل الحل تشريح المثلج من الخطوة 1.1.4.
   5. إعداد منصة التشريح عن طريق وضع ورقة تصفية على غطاء لوحة جيدا.
   6. إعداد قاعة تشريح بوضعه في علبة الجليد وملء العلبة مع الجليد.
   7. إعداد فيبرتوم طريق تأمين شفرة المتاح في حامل بليد.
   8. جعل ماصة نقل بكسر غيض من ماصة باستور ووضع لمبة مطاط أكثر من نهاية مكسورة.
2. تشريح الدماغ الماوس
   1. تخدير الحيوان في دائرة مشبعة إيسوفلوراني 4% حتى ردود الفعل العمود الفقري غائبة.
   2. قطع رأس الحيوان باستخدام مقصلة وإزالة الدماغ بسرعة.
      1. جعل شق خط الوسط مع شفرة المبضع رقم 22 من روسترال إلى والذيلية.
      2. قشر فروة الرأس أفقياً على كل جانب من الرأس.
      3. استخدام مقص جيد قطع الجمجمة على جانب واحد من والذيلية إلى روسترال (بما في ذلك الجانب من عظام أمامي)، استخدام الحذر لا إلى تلف الدماغ.
      4. استخدام الملقط برفع قطعة الجمجمة قبالة الدماغ وتبريد الدماغ مع 15 مل حل تشريح المثلج باستخدام المحاقن من الخطوة 2.1.4 بسرعة.
      5. رفع المخ خارج الجمجمة.
      6. مكان الدماغ في واحدة من قنينة مملوءة بالحل تشريح المثلج (من الخطوة 1.1.4) bubbled مع 95% O₂5% CO₂.
3. إعداد شرائح من تحت المهاد الماوس
   1. كتلة في الدماغ لمنطقة الدماغ المرجوة وقص زاوية (مثلاً، لشرائح طائي الاكليلية، تقليم قبالة الأنسجة روسترال إلى chiasm البصرية ووالذيليه إلى بونس استخدام شفرة وضمان كتلة والذيلية خط عمودي على سطح مستو لقاعدة للدماغ).
   2. استخدام قطع قطعة من ورق الترشيح، تلتقط الدماغ من الجانب الأمامي والصق على الجانب الخلفي للوحة عقد استخدام الغراء الفورية.
   3. بسرعة ضع لوحة عقد في قاعة تشريح وملء الدائرة مع تقطيع الحل من الكأس الثانية في خطوة 1.1.4.
   4. تأمين علبة الدائرة والجليد تشريح على فيبرتوم.
   5. تحديد مجال تشريح (الأمامي والخلفي للدماغ) والبدء في تقطيع 250 ميكرون سمك شرائح الاكليلية. وأوصت المعلمات: 0.10 mm/s، السعة بسرعة 2 مم.
   6. تقليم الشرائح إلى الحجم المناسب لمنطقة الدماغ المرجوة.
   7. استرداد الشرائح عند 35 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة. ثم إزالة غرفة الإنعاش من حمام الاحترار والسماح للشرائح لاسترداد في درجة حرارة الغرفة مقدار 30 إضافية للحفاظ على شرائح في درجة حرارة الغرفة لبقية اليوم وتواصل فقاعة حمام باستمرار مع 95% O₂5% CO₂ .

3. كلامبريكوردينج تصحيح كامل الخلية

1. سحب الماصات التصحيح
   1. استخدام معلمات المقترح للجامعة-خلية تسجيل من دليل ساحبة ماصة، سحب الماصات التصحيح من الزجاج السميك مسورة لمقاومة ماصة من 3-5 MΩ.
   2. استخدام تعبئة (تجارية أو محلية الصنع)، ميكروسيرينجي تلميح ماصة مع الحل الداخلية التي تمت تصفيتها. لتجعل من ميكروسيرينجي، وحرق غيض من حقنه 1 مل والسماح بالتلميح سقوط إنشاء تلميح غرامة طويلة.
2. الحصول على تكوين كامل الخلية
   1. ضع ماصة تسجيل فقط فوق ماصة شريحة والإزاحة الحالية في وضع المشبك الجهد. تطبيق ضغط إيجابي طفيف على ماصة وقفل في محبس الحنفية.
   2. حدد خلية صحية مع غشاء سليمة والاقتراب من الخلية التي تحتوي الماصة. الضغط الإيجابي ينبغي أن يسبب اضطرابات طفيفة في الأنسجة (أي موجه بطيئة في الأنسجة عند إدخال).
   3. وتواصل ببطء جلب ماصة أقرب إلى الخلية باستخدام اقتراح قطري حتى الماصة النماذج نقرة صغيرة على سطح الخلية.
   4. فك القفل الضغط الإيجابي. سوف تبدأ الخلية لتشكيل ختم، وسوف يزيد المقاومة أعلاه 1 GΩ. في المشبك الجهد، عقد الخلية في-68 أم.
   5. سحب قليلاً بعيداً عن الخلية قطرياً لإزالة الضغط الزائد من الخلية.
   6. التعويض عن السعة ماصة سريعة وبطيئة.
   7. تطبيق شفط موجزة من خلال أنبوب متصل بحامل ماصة اختراق الخلية والحصول على تكوين كامل الخلية.
   8. التبديل إلى وضع الخلية في الغشاء اختبار نافذة في الكهربية الحصول على البيانات وتحليل البرمجيات (مثلاً، كلامبيكس).
   9. قبل كل تسجيل المشبك الجهد، إجراء اختبار غشاء باستخدام نفس البرنامج وتسجيل المعلمات ذات الصلة في كتاب مختبر (غشاء المقاومة والمقاومة الوصول والسعة).
   10. الحفاظ على درجة حرارة الحمام التسجيل في 27 – 30 درجة مئوية ومعدل التدفق في 1.5-2.0 مل/دقيقة للتجارب اللاحقة.

4-تعدد التجارب

1. التجربة 1: تقدير تعدد استخدام 4-أ فب
   1. في المشبك الجهد، عقد الخلية في-68 أم. باستخدام البرنامج نفسه، سجل في سيبسكس بينما بيرفوسينج الحمام مع انخفاض Ca^{2 +} قام. سجل لمدة 5 دقائق على الأقل بعد بدء تكوين كامل الخلية لضمان تسجيل أساس مستقرة كما قد يكون النشاط متشابك عالية بعد وقت قصير من اختراقه في الغشاء.
   2. ميكروبيبيتي، باستخدام إضافة 4-AP إلى قام وحمام تطبيق 30 ميكرون 4-آب سجل سيبسكس لمدة 10 دقيقة على الأقل للحصول على تأثير المخدرات الكاملة.
   3. إضافة 0.5 ميكرومتر ت و 10 ميكرون Cd^{2 +} إلى قام مع 4-آب وتسجيل ميبسكس لمالا يقل عن 10 دقيقة.
   4. لتحليل العمل دون اتصال، استخدام الماضي 1 دقيقة من الأساس قبل تطبيق 4-AP (بانخفاض Ca^{2 +} قام)، دقيقة العاشرة لتطبيق 4-AP ودقيقة العاشرة ت التطبيق مباشرة.
2. التجربة 2: لﻻستخدام الإصدار حويصلة ريال^{2 +} باستخدام
   1. بينما بيرفوسينج الحمام مع العادي Ca^{2 +} قام (نفس قام حمام) السجل سيبسكس لمدة 5 دقائق على الأقل.
   2. التبديل من العادي Ca^{2 +} قام وتبدأ بيرفوسينج ريال^{2 +} قام (من الخطوة 1، 4)، وسجل سيبسكس.
   3. للتحليل دون اتصال، تحديد ما إذا كانت سيبسكس السعة الكبيرة نتيجة إطلاق متزامن حويصلات، قارن 1 دقيقة الأخيرة من خط الأساس (في قام العادي) في الدقيقة^ال 10 ريال^{2 +} قام التطبيق.
3. تجربة 3: اختبار لاستخدام الإصدار مولتيفيسيكولار Γ- استيراد
   1. في انخفاض Ca^{2 +} قام السجل سيبسكس لمدة 5 دقائق على الأقل.
   2. إضافة 30 ميكرون 4-AP قام من خلال نظام التروية. سجل سيبسكس لمالا يقل عن 10 دقيقة.
   3. إضافة 200 ميكرومتر γ-DGG قام مع 4-آب وتسجيل سيبسكس لمالا يقل عن 10 دقيقة.
   4. كما تجربة التحكم في خلية منفصلة، قم بإجراء الخطوات 1-3 ولكن يطبق بتركيز منخفض (125 شمال البحر الأبيض المتوسط) من دنقكس بدلاً من استيراد γ.
   5. لتحليل غير متصل، تحليل دقيقة الأخير لكل تطبيق المخدرات.
4. التجربة 4: حفز الزبائ المدخلات لزيادة إمكانات عمل إطلاق النار.
   1. سجل سيبسكس في Ca^{2 +} قام العادي.
   2. تنشيط أفيرينتس استخدام زجاج أحادي القطب كهربائي مليئة قام بمعدل 20 هرتز 2 s وكرر 10 مرات بفاصل بين انفجر من 20 ثانية.
   3. للتحليل واستخدام ms 5,000 قبل أن الحافز الأول كخط الأساس وقارن إلى ms 10-300 بعد الحافز النهائي وثم تأخذ تغيير السعة والتردد المتوسط ما يزيد على 10 محاكمات.

5-تحليل

1. تحليل سيبسكس وميبسكس باستخدام برنامج يكتشف ويحلل التيارات متشابك (مثلاً، برامج تحليل مصغرة).
   1. باستخدام هذا البرنامج، استخدم المعلمات الكشف المقترحة للكشف عن امبا مستقبلات ابسكس (أو ابسكس مستقبلات GABA إذا كان تسجيل التيارات المثبطة).
   2. استخدم الدالة "التحليل دون توقف" للكشف عن ابسكس في التسجيل.
   3. التفحص يدوياً كل تسجيل التأكد من البرنامج هو الكشف بدقة عن كل حدث (مثل ضمان لا يتم أحداث غاب أو عدها مرتين).
   4. تصدير بيانات الحدث بنسخها إلى "الحافظة" ولصقه في برنامج إدارة بيانات (مثل Excel)
   5. حساب متوسط التردد و/أو السعة لكل العلاج من تعاطي المخدرات، وإجراء التحليلات الإحصائية ذات الصلة.

البروتوكول أعلاه توضح طريقة لاستخدام تصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية لفحص درجة تعدد متشابك، استخدام الماوس طائي الخلايا العصبية كمثال. ينبغي أن يؤدي هذا الأسلوب إعداد شريحة الخلايا قابلة للحياة السليمة التي لم تقم تورم الغشاء أو نواة (الشكل 1). كل خطوة في البروتوكول المهم لصحة الأنسجة والنوعية من التسجيلات.

رقم 1: شريحة أنسجة صحية وغير صحية بعد إعداد- شريحة إعداد التشفيير تحت التدخل التفاضلية التباين البصريات الكهربية في 40 x التكبير. رؤوس الأسهم الحمراء تشير إلى الخلايا السليمة، ورؤوس سوداء تشير إلى الخلايا غير صحية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويبين الشكل 2 الأساس المنطقي لتحديد متشابك تعدد استخدام التصحيح المشبك الكهربية. يمكن أن يؤدي تعدد متشابك من أما اتصال متشابك متعددة بين زوج من الخلايا العصبية (الشكل 2A اليسار)، أو بالإفراج عن مولتيفيسيكولار في موقع معين متشابك (الشكل 2A الحق). في كل من هذه الحالات، سوف تحظى بإمكانيات العمل في الخلايا العصبية presynaptic استجابة بوستسينابتيك كبيرة (سيبسك) سبب الجمع الزماني لإحداث متشابك متعددة. بيد أنه في حالة عدم وجود إمكانات العمل presynaptic (مثل حضور تتكس و Cd2 + لحجب نا+-تعتمد على و Ca2 +-يعتمد العمل إمكانية إطلاق النار)، الإصدار العصبي حويصلية غير متزامنة. نتيجة لذلك يصبح استجابة بوستسينابتيك الأصغر (الشكل 2B: AP مستقلة). إذا كان اثنين من الخلايا العصبية لا يحمل تعدد (أي يكون واحد فقط من الإفراج عن مولتيفيسيكولار الاتصال/لا متشابك) لن يكون هناك أي فرق في الاستجابة بوستسينابتيك بين تعتمد على إمكانات العمل وإمكانات العمل المستقل عن ناقل عصبي (الشكل 2).

رقم 2: رسم تخطيطي يوضح النتائج المترتبة على مختلف المنظمات متشابك في التيارات بوستسينابتيك. (أ، ب) في المشبك مع تعدد، بإمكانيات العمل والمرجع المصدق الذي أعقب ذلك مشغلات2 + تدفق الانصهار متزامن من حويصلات متشابك متعددة تؤدي إلى ابسكس كبيرة، مولتيكوانتال. يمكن أن يؤدي تعدد متشابك من الاتصال مولتيسينابسي أو الإفراج عن مولتيفيسيكولار في المشبك مفردة (A). حضور ت والقرص المضغوط2 +، الانصهار حويصلة مستقلة عن إمكانات العمل غير متزامنة ويسبب أونيكوانتال صغيرة ابسكس (ب). (ج) في نهايات دون تعدد، النتائج على حد سواء تعتمد على إمكانات العمل والمستقله حويصلة الانصهار في أونيقوانتال ابسكس. لقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 1A لدينا التقرير السابق6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

في تجربة 1، يتم تطبيق 4-AP إلى حمام لزيادة إمكانات عمل إطلاق النار والإفراج عن احتمال. للتأكد من أن 4-أ فب هو زيادة إمكانات العمل عفوية إطلاق، يمكن مقارنة تواتر ابسكس بين سيبسكس وميبسكس (الشكل 3 ألف، ج). نظراً لأن سيبسكس مزيج من كلا تعتمد على إمكانات العمل-المستقلة الأحداث و، الفرق في تواتر سيبسك وميبسك بمثابة وكيل لإمكانات العمل العفوي يطلقون النار في محاور عصبية presynaptic. نحن نستخدم قص تعسفي قبالة من الفرق > 15% في التردد بين سيبسك إلى ميبسك التأكد من وجود عدد كاف من الأحداث تعتمد على إمكانات العمل الحالي لتحليل تعدد. إذا كانت مماثلة في التردد والسعة (أي لا عفوية العمل إمكانات إطلاق Ca2 + حالة منخفضة)، والفرق بين انخفاض Ca2 + خط الأساس سيبسك و 4 ابسكس في انخفاض Ca2 + الشرط والشرط ت (ميبسك) أ فب-يمكن استخدامها أيضا لتحليل تعدد.

في مثال يزيد النتائج هو مبين في الشكل 3، 4-AP كل من السعة والتردد من سيبسكس. يقلل الطلب اللاحق من القرص المضغوط وت2 + كل من السعة والتردد. كما هو موضح أعلاه، يشير إلى الفرق في السعة بين سيبسكس وميبسكس تعدد متشابك. في الخلايا العصبية طائي ندرس هنا، والسعة والتردد لخط الأساس وظروف ت نفسها (الشكل 3د)، نقترح أن سيبسكس الأساس تحتوي على عدد قليل جداً تعتمد على إمكانات العمل ابسكس. وبناء على ذلك، يمكن مقارنة التجارب اللاحقة الفرق بين خط الأساس وب 4 لقياس تعدد.

الشكل 3:. 4-AP التطبيق يكشف عن تعدد متشابك. نموذج (أ) آثار سيبسكس المسجلة في انخفاض Ca2 + قام خلال خط الأساس، وبعد تطبيق 4-AP (30 ميكرومتر)، وت اللاحقة (0.5 ميكرومتر) والقرص المضغوط2 + (10 ميكرومترات) التطبيق. (ب) توزيع السعة سيبسك من التسجيل المبينة في (أ). (ج، د) ملخص تواتر يعني (ج) والسعة (د) بين خط الأساس (رمادي)، 4-AP (أحمر) وت + Cd2 + (أزرق). ف < 0.005، * * ف < 0.01. لقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 2 لدينا التقرير السابق6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الطريقة الموضحة أعلاه تقديرات متوسط تعدد الاشتباكات العصبية التي تنتهي إلى الخلايا العصبية بوستسينابتيك: قد لا تكشف عن تغييرات في تعدد التي تحدث لنسبة صغيرة من نقاط الاشتباك العصبي. على الرغم من ذلك، هذا الأسلوب في دراستنا الأخيرة، كشفت عن تغييرات في تعدد نقاط الاشتباك العصبي الغلوتامات في الخلايا العصبية طائي بين العادي ومزمن وأكد شروط6.

استبدال من Ca2 + مع اكويمولار ريال2 + في قام ديسينتشرونيزيس تعتمد إمكانية العمل على الإفراج عن حويصلات العصبي 19، 20. ولذلك، إذا سيبسكس السعة الكبيرة هي مجموع العصبي حويصلية متزامنة تعتمد على إمكانات العمل الصحفي (أي تعدد)، استبدال Ca2 + مع ريال2 + ستنخفض السعة ابسكس. كما رأينا في ريال الرقم 4، 2 + قام يقلل نسبة كبيرة السعة الأحداث (الشكل 4 باء)، ونتيجة لانخفاض متوسط السعة (الشكل 4). عندما لا يحمل خلايا متعددة، ديسينتشرونيزينج حويصلة الإفراج سيكون أي تأثير على السعة ابسك.

الشكل 4: ريال2 + ديسينتشرونيزيس كبيرة من الأحداث مولتيكوانتال. (أ) تتبع الممثل مقارنة بين العادي Ca2 + قام ريال2 + قام. ريال2 + قام ديسينتشرونيزيس الإصدار حويصلة وينقص السعة للأحداث المتزامنة مولتيكوانتال كما رأينا في توزيع سعة ممثل (ب) وتغيير السعة لكل الخلايا (ج) * ف < 0.05. لقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 3 لدينا التقرير السابق6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Γ-DGG، خصم تنافسية ديسوسياتينج سريعة من مستقبلات امبا، يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان التعدد سبب الإفراج عن مولتيفيسيكولار أو عدة جهات اتصال متشابك. كما يعمل الإصدار مولتيفيسيكولار على سكان بتداخل مستقبلات بوستسينابتيك، السعة الكبيرة ابسكس ينطوي على تجميع غلوتامات في المشقوق متشابك. وبعبارة أخرى، أن تركيز الغلوتامات في المشقوق متشابك أعلى من ذلك الذي ينتج من الإصدار أونيقوانتال. من ناحية أخرى، أن يكون لجهات الاتصال مولتيسينابتيك ابسكس أونيكوانتال في كل موقع متشابك. إذا كانت السعة الكبيرة ابسكس تنشأ عن إطلاق سراح مولتيفيسيكولار، ابسكس أكبر سوف يتأثر أقل بالعداء γ-استيراد (بسبب تركيز غلوتامات أعلى) مقارنة بالسعة أصغر ابسكس (5A الشكل الصحيح، ب-د). إذا كانت السعة الكبيرة ابسكس بسبب مجموع متزامن مع أونيكوانتال ابسكس (مولتيسينابسي جهات الاتصال)، وبالمثل تأثير γ-استيراد السعة لكل ابسكس (الشكل 5A اليسار، ه-ز). خلافا γ-DGG، دنقكس وتقارب عالية، يسبب بطء الناي بخصم مستقبلات امبا/كينيت نقصان موحدة عبر كل كبيرة وصغيرة السعة ابسكس (الرقم 5 ح-ي). يمكن قياس حساسية γ-DGG ودنقكس كالنسبة من متوسط السعة ابسك مقسوماً على الحد الأقصى (متوسط ابسكس 20 أكبر) ابسك السعة (الرقم 5 ك، L).

الرقم 5: استخدام γ-DGG للتحقيق الصحفي مولتيفيسيكولار- (أ) الخطط التي توضح نموذجين من تعدد. اليسار: الجمع الزماني لانتقال أونيقوانتال التي تستهدف السكان مستقلة من مستقبلات بوستسينابتيك. ابسكس الكبيرة والصغيرة وتتحقق بتركيز غلوتامات مماثلة في المشقوق متشابك وعلى قدم المساواة ولذلك حساسة لاستيراد γ. حق: انتقال مولتيكوانتال التي تستهدف سكان بتداخل مستقبلات بوستسينابتيك. ابسكس الكبيرة هي سبب تركيز غلوتامات أعلى في المشقوق من سيبسكس أصغر، وبالتالي فهي أقل حساسية لاستيراد γ. القيم المعروضة في أسفل النموذج هي الاتساع النسبي افتراضية. نموذج (ب) آثار من تسجيل فيها، كانت هناك زيادة في السعة سيبسك يعني عقب تطبيق 4-AP (4-AP المستجيب). (ج) ارسم التراكمي السعة ابسك للتسجيل هو موضح في الفقرة (ب). (د) ارسم التراكمي لتطبيع ابسك السعة (ابسك/ابسكماكس) قبل وبعد تطبيق γ-استيراد من التسجيل هو موضح في الفقرة (ب). يتتبع (ه) عينة من تسجيل حيث لم يطرأ أي تغيير في السعة سيبسك يعني بعد 4-AP التطبيق (غير 4-AP-المستجيب). (و) ابسك التراكمي السعة للتسجيل هو موضح في (ه). (ز) التراكمي ابسك/ابسكماكس مؤامرة للتسجيل هو موضح في (ه). (ح) عينة يتتبع من تسجيل من خط الأساس، وكذلك بعد 4-AP وتطبيق دنقكس. (أنا) ابسك التراكمي السعة للتسجيل هو موضح في (ح). (ي) التراكمي ابسك/ابسكماكس مؤامرة للتسجيل هو موضح في (ح). ملخص (ك) يعني ابسك/ابسكماكس بعد γ-DGG (في 4-AP المستجيب والمجموعات غير المستجيب) أو تطبيق دنقكس تطبيع إلى ما قبل-γ-DGG/دنقكس (أي وظيفة 4-ب). يعني قطع (L) لوظيفة-4-AP ابسك السعة (تطبيع إلى ما قبل-4-AP) ضد يعني وظيفة-γ-DGG/دنقكس ابسك/ابسكماكس (تطبيع لوظيفة-4-أ فب). ف < 0.005. لقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 4 لدينا التقرير السابق6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويمكن زيادة قوة انتقال متشابك عابر برشقات نارية من النشاط متشابك. التحقيق تعدد الظروف الفسيولوجية أكثر، يمكن استخدام التحفيز الزبائ لزيادة إمكانات عمل إطلاق النار وإطلاق سراح الاحتمال. التحفيز الزبائ إذا تعدد غير موجود، يجب أن يسبب زيادة قصيرة في السعة ابسك (الشكل 6A-د). النشاط مدفوعة الزيادات في إمكانات عمل إطلاق النار إذا تعدد غير موجود، لن تزيد السعة ابسك.

رقم 6: التحفيز عالية التردد يكشف عن تعدد متشابك. نموذج (أ) آثار سيبسكس قبل وبعد التحفيز متشابك الزبائ. (ب) الأرض من السعة سيبسك قبل وبعد التحفيز متشابك (20 هرتز، 2 s) من التسجيل المبينة في (أ). (ج، د) موجز للتردد سيبسك (ج) والسعة (د) تغييرات في أعقاب التحفيز متشابك. ف < 0.001، * P < 0.05. لقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 5 لدينا التقرير السابق6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن